يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نشر على نطاق صغير iPSCs الإنسان في الظروف المصل خالية لتوصيف Immunocytochemical الروتينية

7.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55260

⸱

فبراير 18, 2017

 , 
1Department of Neurology, The University of Arizona

في هذه المقالة

ملخص

< p class = 'jove_content'> يعد التوصيف المنتظم للخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) ، للتأكد من الحفاظ على حالتها متعددة القدرات ، خطوة مهمة قبل استخدام هذه الخلايا لتطبيقات أخرى. هنا نصف طريقة للانتشار على نطاق صغير من iPSCs البشرية مصممة خصيصا لتمكين توصيفها السهل والروتيني عن طريق الكيمياء المناعية.

الملخص

هناك اهتمام كبير باستخدام الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة البشرية (hiPSCs) لنمذجة الأمراض وعلاجات الخلايا نظرا لخصوصية المريض وجذعها المميز. ومع ذلك, تعدد القدرات من iPSCs, وهو أمر ضروري لوظائفها, يجب أن تؤكد قبل أن تستخدم هذه الخلايا في مثل هذه التطبيقات. في حين توصيف صارم ل iPSCs, من خلال فحوصات خلوية ووظيفية مختلفة ضروري لتأسيس تعدد القدرات, يمكن تحقيق التقييم الروتيني للحفاظ على تعدد القدرات بشكل أكثر بساطة وفعالية من خلال التقنيات الكيميائية المناعية. هنا ، نقدم بروتوكولا منهجيا لزراعة hiPSCs ، بطريقة مصغرة ، لتسهيل التحقق بشكل خاص من حالتها متعددة القدرات باستخدام الكيمياء المناعية. وبشكل أكثر تحديدا, تشمل هذه المنهجية وسيلة فعالة وفعالة من حيث التكلفة لزراعة iPSCs في ظروف خالية من المصل وطلاءها على شرائح غرفة صغيرة أو أغطية زجاجية مثالية لكيمياء الخلايا المناعية.

المقدمة

إعادة برمجة الخلايا الجسدية الكبار الإنسان إلى خلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs) يوفر وسيلة للحصول على العرض قد يكون غير محدود من خلايا المريض محددة لدراسة مرض 1، 2. سوف تلخص النمط الظاهري المرض في المختبر جعل من المعقول لدراسة الآليات الخلوية والجزيئية المرتبطة مع المرض، وتعزيز اكتشاف الأدوية والطب الشخصي 3. وبالإضافة إلى ذلك، iPSCs الإنسان (hiPSCs) توفر إمكانية استنباط أنواع معينة من الخلايا التي يمكن استخدامها بوصفها موردا فريدا لتحل محل الخلايا الميتة أو مختلة واستعادة وظيفة في سياق العديد من الاضطرابات 4، 5.

شرط هام لاستخدام iPSCs في التطبيقات المذكورة أعلاه هو ضمان أن يتم الحفاظ المحفزة وغير متمايزة دولتهم خلال التوسع في الثقافة. عادة، techniqUES مثل التدفق الخلوي، النشاف الغربي، تفاعل البلمرة المتسلسل والمقايسات الفنية، والتي تتطلب كميات كبيرة من الخلايا والمعدات المتخصصة، وتستخدم لتحليل مفصل لIPSC تعدد القدرات 6، 7، 8، 9، 10. ومع ذلك، يمكن تحقيق التقييم الروتيني للحالة غير متمايزة في iPSCs بشكل فعال من خلال نشر محدود من هذه الخلايا على وجه التحديد لمناعية (ICC)، وبالتالي تنطوي على تخفيض الوقت والموارد.

التطورات الحديثة تسمح لنمو iPSCs في ظروف خالية من المصل محددة، وهو تحسن كبير على أنظمة الثقافة التقليدية التي تتطلب الفئران طبقات الخلايا الليفية التغذية وسائل الإعلام مصل يحتوي على. ومع ذلك، فإن الدراسات الحالية لا تتضمن البروتوكولات تدريجي واضحة تصف كيفية الانتقال iPSCs من وحدة التغذيةطبقة لأنظمة خالية المغذية.

في هذا السياق، فإن البروتوكول تفاصيل منهجي كيف hiPSCs نمت على الماوس المشع الليفية الجنينية (iMEF) طبقات المغذية يمكن أن يكون (1) تكييفها لنشر في المصل خالية المتوسطة، و (2) مثقف على نطاق صغير لدعم تحديدا قوية تحليل immunocytochemical. وعموما، تمثل هذه المنهجية إجراء في الوقت المناسب وفعالة من حيث التكلفة لنشر iPSCs الإنسان في ظروف خالية من المصل لتأكيد تعدد القدرات على أساس روتيني باستخدام مناعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد استمدت hiPSCs من الخلايا الليفية الجلدية البشرية معزولة عن 4 مم الخزعات لكمة الجلد وبرمجتها في المنزل عن طريق إعادة برمجة سينداي بوساطة فيروس 11. وافقت جامعة أريزونا مجلس المراجعة المؤسسية جميع إجراءات التوظيف الموضوع وجمع الخزعة.

1. إعداد مصفوفة خارج الخلية السطح المطلي لIPSC الثقافة

  1. قبل يوم واحد لالتقاء الثقافات hiPSC المتزايد على iMEFs، وإعداد المصفوفة خارج الخلية (Matrigel) لوحات المغلفة.
  2. تحسن بطيء قسامة من المصفوفة خارج الخلية (الكثير يعتمد، اتبع الإرشادات التي تظهر على ورقة مواصفات) على الجليد في 4 درجات مئوية لمدة 2 ساعة.
  3. في غطاء السلامة الأحيائية، وذلك باستخدام نصائح الماصة الباردة (المخزنة في -20 درجة مئوية)، إضافة 1 قسامة من المصفوفة خارج الخلية للبرد Dulbecco لتعديل النسر متوسطة / المغذيات خليط F-12 (DMEM / F12 / HEPES) وفقا لكثير من عامل التخفيف محدد .
  4. الاستغناء ~ 60081؛ ل من المصفوفة خارج الخلية لكل بئر من كل خلية ثقافة جديدة تعالج 12 لوحة جيدا اللازمة.
  5. احتضان لوحة في درجة حرارة الغرفة لعدة ساعات. هنا، استخدم وقت الحضانة 3 ساعات.
    ملاحظة: لوحات يمكن استخدامها على الفور أو تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.

2. نقل hiPSCs نمت على خلايا الطاعم iMEF على خارج الخلية مصفوفة للدعوة

  1. في يوم من الركض، وإزالة لوحة المغلفة مصفوفة من 4 درجات مئوية والسماح لوحة ليتأقلم مع درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في نسيج الثقافة هود.
  2. نضح في المتوسط ​​من 1 بئر من لوحة 6 جيدا للثقافة hiPSC المتزايد على iMEFs واستبدالها مع 500 ميكرولتر كولاجيناز التفكك كاشف (1 ملغ / مل في مستنبت القاعدية).
  3. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ~ 10-30 دقيقة حتى حواف المستعمرات IPSC يبدو أن رفع قليلا.
    ملاحظة: فترة حضانة يعتمد الخط وسوف تختلف. مراقبة التفكك تحت المجهر.
  4. سيارةefully نضح كاشف التفكك وغسل بلطف 2 مرات مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS، ودرجة الحموضة 7.4).
  5. إضافة 1 مل من درجة حرارة الغرفة mTeSR1 المتوسطة كاملة مع 10 نانوغرام / مل المرتبطة رو-بروتين كيناز (Y-27632 ROCK المانع) إلى البئر.
    ملاحظة: استخدام 50:50 خليط من مكيفة iMEF المتوسطة وmTeSR1 خلال هذا المقطع الأولي ويقترح ويمكن أن تكون مفيدة للبقاء hiPSCs خلال هذه المرحلة الانتقالية وسائل الإعلام.
  6. باستخدام صغير المجهر النقيض من المرحلة ضعت جزئيا داخل غطاء محرك السيارة، يدويا تسجيل واختيار 1-2 المستعمرات hiPSC (~ 700 - 1000 ميكرون في القطر) استخدام المحاقن والإبر (25 G، 1½ في). دفع قبالة القطع وسجل للمستعمرة في المتوسط ​​مع طرف P200 الماصة.
  7. نضح والتخلص من مصفوفة من لوحة جديدة، والحرص على عدم تعكير صفو الطلاء.
  8. نقل 1 مل من تعليق خلية من النظام القديم الذي يحتوي جيدا iPSCs سجل في مصفوفة جديدة مغلفة بشكل جيد.
  9. جيش التحرير الشعبى الصينىCE لوحة في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. موسيقى الروك لوحة في عدة سريع، ذهابا وإيابا، والحركات جنبا إلى جنب لموزعة بالتساوي على خلايا. لا تخل لوحة لمدة 24 ساعة.
  10. إجراء تغييرات إعلامية كاملة اليومية مع mTeSR1 المتوسطة كاملة (إضافة Y-27632 ROCK المانع ليست هناك حاجة بعد الطلاء الأولي في الخطوة 2.5).

الركض 3. على نطاق صغير من hiPSCs على لوحات المغلفة مصفوفة

ملاحظة: عموما، بعد نقل الأولي للhiPSCs إلى matrix وحات مغلفة، ينبغي passaged الخلايا مرة أخرى بطريقة مماثلة لضمان تم القضاء على جميع iMEFs وتكيفت الخلايا المغذية خالية من الشروط.

  1. قبل يوم واحد IPSC confluency باعداد المغلفة حديثا لوحات مصفوفة كما نوقش في القسم 1.
  2. في يوم المرور، وإزالة لوحة المغلفة مصفوفة من 4 درجات مئوية حضانة والسماح لوحة ليتأقلم مع درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في طريق مسدود الأنسجةالبنية غطاء محرك السيارة.
  3. نضح في المتوسط ​​من 1 بئر من لوحة 6 جيدا من hiPSCs (انتقلت أصلا من وحدة التغذية إلى المصفوفة) واستبدالها مع 500 ميكرولتر العازلة تفارق الخلية.
    ملاحظة: المخزن المؤقت تفارق الخلية التجارية المستخدمة هنا (انظر المواد الجدول) هي أكثر مناسبة للاستخدام مع متوسط ​​mTeSR1 مقارنة كولاجيناز.
  4. يحضن في درجة حرارة الغرفة ل3-7 دقائق حتى تظهر حواف المستعمرات التوجيهية لرفع قليلا. كما ذكرت من قبل، وفترة حضانة يعتمد الخط ومتغير. لذلك، ومراقبة تفكك الخلايا تحت المجهر لتحديد الوقت الأمثل.
  5. بعناية نضح المخزن المؤقت التفكك وغسل بلطف 2 مرات مع برنامج تلفزيوني.
  6. إضافة 500 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة mTeSR1 المتوسطة كاملة مع 10 نانوغرام / مل Y-27632 ROCK المانع إلى البئر.
  7. بدلا من المستعمرات التهديف كما في الخطوة 2.6، ودفع العدد المطلوب من المستعمرات في وسائل الإعلام باستخدام طرف P200 ويسحن بلطف تعليق الخلية 2 مرات AGainst زاوية واحدة من البئر لكسر المستعمرات hiPSC إلى كتل من ~ 50-200 ميكرون في الحجم. على سبيل المثال، لوحة 12-جيدا، واختيار 1-2 المستعمرات لنقل في كل بئر جديد 1. نقل تعليق خلية من البئر القديمة في بئر واحد جديد من لوحة 12-جيدا.
  8. موسيقى الروك لوحة في عدة سريع، ذهابا وإيابا، وجنبا إلى جنب الحركات موزعة بالتساوي على الخلايا، وترك بقية لوحة لمدة 24 ساعة في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 الحاضنة.
  9. إجراء تغييرات إعلامية كاملة اليومية مع mTeSR1 المتوسطة كاملة. كما ذكرت من قبل، فإنه ليس من الضروري إضافة Y-27632 ROCK المانع بعد الطلاء الأولي.
    ملاحظة: مستعمرات IPSC غير المستخدمة من الخطوة 3.7 قد تكون cryopreserved بسهولة في هذه المرحلة.

4. إعداد غرفة الشرائح وCoverslips لبذر hiPSCs لسيتولوجية مناعية

ملاحظة: بروتوكول التالية يستخدم 4 جيدا الشرائح غرفة البلاستيكية و 12 coverslips ملم الزجاج مع appropriatمجلدات البريد وسائل الإعلام في الآبار متعددة لدعم مناعية فعالة من حيث التكلفة. ومع ذلك، وأحجام وسائل الإعلام يمكن زيادة إذا كان المطلوب استخدام أكبر جيدا وساترة الأحجام.

  1. يوم واحد قبل hiPSC التقاء، وإعداد الشرائح غرفة مطلية حديثا مع المصفوفة خارج الخلية كما نوقش في القسم 1. إضافة ما يكفي من حل مصفوفة (~ 300-500 ميكرولتر لكل بئر من شريحة غرفة 4 أيضا) بشكل كامل معطف كل بئر من دون أي قلق تبخر. بدلا من ذلك، بعد وضع 1 ساترة تنظيفها وتعقيمها في كل بئر من 24 لوحة جيدا، ومعطف مع 500 ميكرولتر المصفوفة خارج الخلية، وتأكد من ساترة لا تطفو على أعلى من الحل.
  2. في يوم المرور، وإزالة الشرائح المغلفة غرفة / coverslips من 4 درجات مئوية، والسماح للتأقلم على درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة في نسيج الثقافة هود.
  3. نضح في المتوسط ​​من 1 بئر من لوحة ال 12 أيضا من hiPSCs واستبدالها مع 500 العازلة ميكرولتر التفكك.
  4. يحضن في تيمبي الغرفةrature ل~ 3-7 دقائق حتى حواف المستعمرات IPSC يبدو أن رفع قليلا.
  5. بعناية نضح المخزن المؤقت التفكك وإضافة 1 مل من درجة حرارة الغرفة mTeSR1 المتوسطة كاملة مع 10 نانوغرام / مل Y-27632 ROCK المانع إلى البئر.
  6. باستخدام النقيض المجهر مرحلة صغيرة توضع داخل نسيج الثقافة هود، يدويا اختيار 1 مستعمرة / بئر جديد من شريحة غرفة 4 جيدا أو 1 ساترة جديدة لتكون مطلية (~ 1000 - 1500 ميكرون في القطر) باستخدام طرف P200 الماصة عن طريق دفع من على سطح لوحة في المتوسط.
  7. نضح مصفوفة من غرفة الشرائح / ساترة جديدة، والحرص على عدم تعكير صفو الطلاء.
  8. يسحن بلطف تعليق الخلية 2 مرات ضد زاوية واحدة من البئر لكسر المستعمرات hiPSC إلى كتل من ~ 50-200 ميكرون في الحجم. نقل 250 ميكرولتر من تعليق خلية من البئر القديمة في كل بئر جديد من 4 جيدا غرفة الشرائح / ساترة.
  9. تبرزي حجم كل بئر جديد يصل إلى 500 ميكرولتر مع mTeSR1 تابعaining 10 نانوغرام / مل Y-27632 ROCK المانع.
  10. وضع غرفة الشرائح / coverslips في الحاضنة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
  11. بعد 24 ساعة، وإجراء تغييرات إعلامية كاملة اليومية مع mTeSR1 المتوسطة كاملة. مرة أخرى كما ذكرنا سابقا، إضافة Y-27632 ROCK المانع ليست ضرورية بعد الطلاء الأولي.

5. إعداد iPSCs لسيتولوجية مناعية

  1. مرة واحدة متموجة، والحفاظ على المستعمرات hiPSC عبر التثبيت عن طريق إزالة وسائل الإعلام من الآبار وإضافة قبل حرارة تنبيه 4٪ امتصاص العرق (~ 300 ميكرولتر / بئر 4-جيدا شريحة الغرفة / ساترة). يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  2. تجاهل امتصاص العرق بشكل مناسب وفقا لاقية المؤسسي وإرشادات السلامة الكيميائية.
  3. غسل الخلايا 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما على شاكر المقعد العلوي مع برنامج تلفزيوني.
    / coverslips يمكن تخزين الخلايا على الشرائح غرفة مع وافرة برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية إلى أجل غير مسمى في هذه المرحلة: ملاحظة.بدلا من ذلك، يمكن استخدامها على الفور لمحكمة الجنايات الدولية.

6. المناعية من hiPSCs مع تعدد القدرات علامات

ملاحظة: hiPSCs Immunostain مع الأجسام المضادة تعدد القدرات القياسية. وكمثال على ذلك، وهنا الخلايا المزدوج الملون مع الأجسام المضادة التي تستهدف واحدة 1 السطحية و1 مستضد الخلايا بطريقة متسلسلة على النحو التالي: مكافحة مسارح محددة الجنينية مستضد 4 (SSEA4) مع بروتين 4 (OCT- مكافحة Octamer ملزم 4) ومكافحة ترا-1-60 مع مكافحة SRY المتعلقة HMG BOX الجين 2 (SOX2) (يرجى الاطلاع على الجدول المواد للحصول على تفاصيل الأجسام المضادة).

  1. نضح في برنامج تلفزيوني من الآبار وإضافة في 500 ميكرولتر / حجب جيدا الحل دون تريتون-X-100. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  2. إعداد تركيز محدد مسبقا (هنا، استخدم 1: 200) من الأجسام المضادة السطحية، إما SSEA4 أو ترا-1-60، عن طريق تمييع في عرقلة الحل دون تريتون X-100.
    1. الشرائح للغرفة، وإعداد 300 ميكرولتر / بئر شريحة غرفة 4-جيداعن طريق خلط 298.5 ميكرولتر من عرقلة الحل فوق و 1.5 ميكرولتر من معاداة SSEA4 أو ترا-1-60 الأجسام المضادة الأولية.
    2. لcoverslips، وإعداد 40 ميكرولتر / ساترة عن طريق خلط 199 ميكرولتر من عرقلة الحل و1 ميكرولتر من معاداة SSEA4 أو ترا-1-60 الأجسام المضادة الأولية.
  3. نضح عرقلة الحل من الشريحة الغرفة والاستغناء عن الأجسام المضادة الأولية في آبار المناسبة. لcoverslips، ضع قطعة من بارافيلم بقوة داخل طبق بتري والاستغناء عن 40 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية على رأس بمثابة قطرة. باستخدام إبرة حقنة عازمة وملقط، ورفع بعناية ساترة للخروج من ثقافة جيدا ووضعه الجانب الخلية أسفل على انخفاض الأجسام المضادة على بارافيلم. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  4. في صباح اليوم التالي، وغسل الخلايا 3 مرات، 5-10 دقيقة لكل منهما، عن طريق إزالة الأجسام المضادة من الشريحة غرفة واضاف في برنامج تلفزيوني. لcoverslips، ورفع كل واحد قبالة بارافيلم وضعه مرة أخرى في بئر من 24 لوحة جيدا، جنبا خلية يصل. بعناية إضافة PBS.
  5. إعداد الأجسام المضادة الثانوية المناسبة في 1: 500 في عرقلة الحل.
    1. الشرائح للغرفة، وإعداد 300 ميكرولتر / بئر شريحة غرفة 4-جيدا عن طريق خلط 499 ميكرولتر من عرقلة الحل و1 ميكرولتر من الماعز المضادة للماوس IgG3 اليكسا فلور 488 (لSSEA4) أو 1 ميكرولتر من الماعز المضادة للماوس الغلوبولين المناعي اليكسا فلور 488 (لترا-1-60).
    2. لcoverslips، وإعداد 40 ميكرولتر / ساترة عن طريق خلط 499 ميكرولتر من عرقلة الحل و1 ميكرولتر من الماعز المضادة للماوس IgG3 اليكسا فلور 488 (لSSEA4) أو 1 ميكرولتر من الماعز المضادة للماوس الغلوبولين المناعي اليكسا فلور 488 (لترا-1-60 ).
  6. نضح في برنامج تلفزيوني من الشريحة الغرفة والاستغناء عن الأجسام المضادة الثانوية في آبار المناسبة. لcoverslips بعد الخطوة 6.2، عكس لل coverslips على حل الأجسام المضادة وضعت على بارافيلم في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
    ملاحظة: إذا كنت تستخدم فلوري الموسومة الأجسام المضادة الثانوية، يجب حماية الخلايا من الضوء. وضع الشرائح غرفة ولل coverslips في الحياة الفطرية الظلامironment خلال حضانات ويغسل.
  7. غسل الخلايا 3 مرات لمدة 5-10 دقيقة لكل منهما عن طريق إزالة الأجسام المضادة من الشريحة غرفة واضاف في برنامج تلفزيوني. لcoverslips، ورفع كل واحد بعناية من بارافيلم والمكان مرة أخرى في بئر من 24 لوحة جيدا، جنبا خلية يصل. إضافة بلطف PBS خلال يغسل.
  8. قبل التحقيق للمستضد الثاني، الخلايا أكتوبر-4 أو SOX2 في هذه الحالة، واحتضان مرة أخرى في عرقلة الحل المصنوع من كاشف permeabilization (تريتون-X-100) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  9. لimmunostain للأكتوبر-4 أو SOX2، ببساطة اتباع منهجية وصفها في خطوات 6،1-6،6 لتطبيق الأجسام المضادة الأولية والثانوية. لأغراض هذا البروتوكول، واستخدام OCT-4 و SOX2 بتركيز 1: 200 والثانوي الأجسام المضادة الماعز المضادة للأرنب مفتش فلور اليكسا 594 في 1: 500.
  10. بعد العلاج الأجسام المضادة الأولية والثانوية المذكورة أعلاه، وغسل الخلايا 3 مرات لمدة 5-10 دقيقة مع كل برنامج تلفزيوني ومباين مع 4 "، 6'-diamidino-2-phenylindole، هيدروكلوريد (دابي) التالية البروتوكولات القياسية إذا كان المطلوب التصور النووي.

7. التحضير للعرض

  1. الشرائح للغرفة، وإزالة بعناية الغرفة العليا من الشريحة باتباع إرشادات الشركة المصنعة. ثم، وشطف في الماء المقطر، وإضافة تصاعد المتوسطة وساترة لتمكين المجهري.
  2. لcoverslips، عكس لل coverslips إلى قطرة من تصاعد وضعت المتوسطة على شريحة المجهر والزجاج.
  3. صورة تحت المجهر مضان القياسية أو متحد البؤر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يوفر هذا البروتوكول وصفا خطوة حكيمة لكيفية iPSCs البشرية يمكن نقلها من الطبقة المغذية لتحرير المغذية الشروط، ونشر في وقت لاحق بطريقة محدودة لتمكين تحديدا مناعية فعالة من حيث التكلفة لتأكيد صيانة تعدد القدرات. ويبين الشكل 1 التمثيل التخطيطي من هذا البروتوكول. ويبين الشكل 2A المستعمرات hiPSC المتزايد على iMEFs في 6 لوحات جيدا. هذه المستعمرات يحمل مورفولوجيا نموذجية مع حدود محددة ومراكز مشرقة المرحلة الكثيفة. كما هو م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بروتوكول منهجية المعروضة هنا يقدم للوقت وطريقة فعالة من حيث التكلفة، في شكل تقنية ثقافة تحجيم، والمصممة خصيصا لدعم تحليل تعدد القدرات الفعالة عبر مناعية.

المزايا الرئيسية للمنهجية وصفها على النحو التالي. وهناك حاجة عادة أكثر من 3-4 الممرات للانتقال iPSCs من طبقات المغذية لالمغذية خالية من الظروف والثقافة من أجل القضاء على iMEFs المتبقية المتبقية بعد استخدام تقنيات التفكك السائبة والتشكل أحادي الطبقة نموذجي للمثول...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

مصادر التمويل: جامعة أريزونا ، ومؤسسة جيم هيميليك ، ومركز أريزونا لبيولوجيا الأمراض المعقدة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEM-F12 / HEPESLifeTechnologies 11330032
مصل بدائل بالضربة القاضية10828028
L-GlutamineLife Technologies25030081
MEM-NEAALifeTechnologies 11140050
2-mercaptoethanolLifeTechnologies 21985023
علوم الخلايا الأساسية للإنسانالمؤتلف CRF001B
Y-27632 ROCK InhibitorR & D1254
Collagenase Type IVLife Technologies17104019
Matrigel hESC MatrixCorning354277
mTeSR1 Basal MediumStemCell Technologies05850
mTeSR1 5x SupplementStemCell Technologies05850
الجذعية العازلة لتفكك الخلايا اللطيفة07174
0.1 M PO4< / sub> عازلةداخليةn / A
Paraformaldehyde ، علومالمجهر الإلكتروني19202
1x محلول ملحي مخزن بالفوسفاتn / an / a
تقنيات حياة مصل الماعز العادي16210072
ألبومين مصل الأبقارSigma-AldrichA2153
Triton-X-100Sigma-AldrichX100
Oct-4A (C30A3) أرنب mAb ،
Sox2 (D6D9) أرنب mAb ،
SSEA4 (MC813) ماوس mAb ،
TRA-1-60 (S) (TRA-1-60 (S)) إشارات خلية mAb للفأر
إشارات الخلية
إشارات الخلية
إشارات الخلية		2840
3579
4755
4746		بدلا من ذلك ، يمكن شراء مجموعة من 6 أجسام مضادة أولية متعددة القدرات معا كمجموعة في الكتالوج # 9656
Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21042
Goat anti-MS IgG3 Alexa Fluor 488Life TechnologiesA21151
Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11037
لوحاتزراعة الخلايا متعددة الآبارفيشر العلمية 0720080 / 0720081متوفر في 6 ، 12 ، 24 ، 48 ، 96 أحجام الآبار
شرائح الغرفةفيشر العلمية & nbsp ؛12 565 21متوفر في الزجاج أو بلاستيك بيرمانوكس في أحجام 1 ، 2 ، 4 ، 8 ، 16
بئر غطاء للنموفيشر العلمي & nbsp ؛12 545 82متوفر بأحجام 12 و 15 و 18 و 22 و 25 مم
تقنيات تقنيات الخلايا

المراجع

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
  2. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  3. Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson's disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
  4. Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
  5. Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
  6. Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118(2009).
  7. Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
  8. Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
  9. Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
  10. Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
  11. Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
  12. Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
  13. Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ROCK mTeSR
نشر على نطاق صغير iPSCs الإنسان في الظروف المصل خالية لتوصيف Immunocytochemical الروتينية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.