في المختبر تمايز متعددة القدرات البشرية الخلايا الجذعية إلى خلايا الأرومة الغاذية

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لتوليد خلايا الأرومة الغاذية البشرية بكفاءة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات باستخدام البروتين المورفوجينيك للعظام 4 ومثبطات مسارات Activin / Nodal. هذه الطريقة مناسبة للتمايز الفعال للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ويمكن أن تولد كميات كبيرة من الخلايا للتلاعب الجيني.

الملخص

المشيمة هي الجهاز الأول لتطوير خلال مرحلة التطور الجنيني ومطلوب لبقاء الجنين النامي. وتتكون المشيمة من مختلف خلايا الأرومة الغاذية التي تميز من خلايا الأديم الظاهر الغاذي خارج الجنينية من الكيسة قبل الغرس. على هذا النحو، فهمنا للأحداث التمايز في وقت مبكر من المشيمة البشرية محدودة بسبب القيود الأخلاقية والقانونية على العزلة والتلاعب في مرحلة التطور الجنيني البشري. الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) هي نظام نموذجي قوي للتحقيق في التنمية البشرية، ويمكن أيضا أن تكون متباينة في المختبر إلى خلايا الأرومة الغاذية التي تعبر عن علامات لمختلف أنواع الخلايا الأرومة الغاذية. هنا، نقدم بروتوكول مفصل للتمييز بين hPSCs إلى خلايا الأرومة الغاذية باستخدام بروتين morphogenic العظام (4) ومثبطات للActivin / مسارات الإشارات العقدية. هذا البروتوكول يولد مختلف أنواع الخلايا الأرومة الغاذية التي يمكن transfected مع الرناوات siRNAsللتحقيق في فقدان وظيفة من الظواهر أو يمكن أن تصاب مع مسببات الأمراض. بالإضافة إلى ذلك، hPSCs يمكن تعديلها وراثيا ثم متباينة إلى الأسلاف الأرومة الغاذية لتحقيق مكاسب من وظيفة ويحلل. هذا في المختبر طريقة التمايز لتوليد أرومة مغذية الإنسان بدءا من hPSCs يتغلب على القيود الأخلاقية والقانونية للعمل مع الأجنة البشرية في مراحلها المبكرة، وهذا النظام يمكن أن تستخدم لمجموعة متنوعة من التطبيقات، بما في ذلك اكتشاف المخدرات وأبحاث الخلايا الجذعية.

المقدمة

مطلوب المشيمة لنمو وبقاء الجنين أثناء الحمل ويسهل تبادل الغازات والمواد الغذائية والفضلات، والهرمونات بين الدورة الدموية للأم والجنين. الجهاز الأول شكلت خلال مرحلة التطور الجنيني الثدييات هو المشيمة التي تبدأ تطوير 6-7 أيام بعد الحمل في البشر و3،5-4،5 أيام في الفئران ^{1، 2، 3، 4.} خلايا الأرومة الغاذية هي الخلايا أهم من المشيمة، وهذه الخلايا تمثل واحدة من أقرب الأحداث النسب تمايز الجنين الثدييات. أنها تنشأ من خلايا الأديم الظاهر الغاذي خارج الجنينية الخارجية للالكيسة قبل الغرس. معرفتنا المراحل الأولى من....

البروتوكول

ملاحظة: للحصول على تمايز إما hESCs أو hiPSCs إلى الأسلاف الأرومة الغاذية، وانتقلت hPSCs نمت على الخلايا الليفية الجنينية الماوس (MEFS) إلى المغذية خالية من الشروط لاثنين من الممرات قبل بدء التمايز مع BMP4 / A / P. هذه العملية يزيل التلوث MEF من الخلايا المتمايزة. هنا، نقدم بروتوكول للتمايز HESC، ونفس البروتوكول يمكن تطبيقها على hiPSCs.

1. الثقافة واسترداد hESCs على المشع الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEFS) (التحضير)

1. غاما تشعيع MEFS

النتائج

نظرة عامة على التمايز في المختبر من hPSCs

يبدأ هذا البروتوكول التمايز في المختبر مع hESCs غير متمايزة نمت على MEFS التي يتم نقلها إلى المغذية خالية من الشروط اللازمة لمرور واحد (الشكل 1A). في حين وصفنا تمايز hESCs في هذا البروتوكول، ونحن استخدام هذا البروتوكول للتمييز hiPSCs بنجاح إلى خلايا الأرومة الغاذية. الانتقال .......

المناقشة

قدمنا ​​الخطوات الأساسية للتمييز بين hESCs إلى الأسلاف الأرومة الغاذية. وقد تم مؤخرا الأمثل هذا البروتوكول للتمييز بسرعة hESCs مع إضافة Activin / العقدية يشير مثبطات، وزيادة التمايز إلى خلايا الأرومة الغاذية وتجنب جيل من الأسلاف الأديم المتوسط، والتي عادة ما لوحظ مع العلاج BMP4 وحدها. يسمح نظام نموذجي BMP4 لدراسة المراحل الأولى من مواصفات الأرومة الغاذية نسب الإنسان والتوسع. وبالإضافة إلى ذلك، فإن هذا النظام نموذج BMP4 مفيد أيضا للتحقيق في تمايز الخلايا الأرومة الغاذية إلى الأنساب.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
DMEM / F12	Invitrogen	11330-057
Knock Out Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	يشار إلى هذا باسم "استبدال المصل" في هذا البروتوكول.
NEAA	Invitrogen	11140-050
FBS	Invitrogen	16000-044
L-Glutamine	Invitrogen	10828-028
Penicillin / Streptomycin	Invitrogen	15140-155
2-Mercaptoethanol	Sigma	M-7522
B-FGF	Millipore	GF-003
DMEM	Invitrogen	11965-118
Dispase	Invitrogen	17105-041
Collagenase Type IV	Invitrogen	17104-019
مثبط الصخور Y27632	Calbiochem	688000
CF1 MEFs المشع	يمكن توليد GlobalStem	6001G	MEFs من اليوم الجنيني 13.5 embyos وتشعيعها.
0.22 وميكرو ؛ مرشح المحقنة m	Millipore	SLGS033SS
Heracell 150i حاضنة الأكسجين المنخفض	Heracell / VWR	89187-192	أي حاضنة لزراعة الأنسجة لديها القدرة على تنظيم تركيزات الأكسجين كافية.
BMP4	R & أنظمة D	314-BP-01M
A 83-01	R & D Systems	2939/10
PD173074	R& D Systems	3044/10
RNAiMax	Invitrogen	13778150
Trizol	ThermoFisher	15596026	Trizol يستخدم لعزل الحمض النووي الريبي الكلي.
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001
Matrigel	Corning	356231	يشار إلى هذا باسم "المصفوفة خارج الخلية" في هذا البروتوكول.