طرق لالتكامل الذاتي للMegamolecular البوليمرات الحيوية على تجفيف الهواء-LC واجهة

Kosuke Okeyoshi; Kensuke Osada; Maiko K. Okajima; Tatsuo Kaneko

doi:10.3791/55274

مقالة منهجية

طرق لالتكامل الذاتي للMegamolecular البوليمرات الحيوية على تجفيف الهواء-LC واجهة

DOI:

10.3791/55274

⸱

أبريل 7, 2017

Kosuke Okeyoshi¹ , Kensuke Osada² , Maiko K. Okajima¹ , Tatsuo Kaneko¹

¹Japan Advanced Institute of Science and Technology, ²Department of Bioengineering, School of Engineering, The University of Tokyo

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم توفير طريقة لالناجم عن التجفيف التكامل الذاتي من البوليمرات الحيوية megamolecular على واجهة بلورية الهواء السائل هنا. وهذه المنهجية أن تكون مفيدة ليس فقط لفهم إمكانات العيانية من البوليمرات الحيوية، ولكن أيضا باعتبارها طريقة التقييم للمواد لينة في المجالات الطبية الحيوية والبيئية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكائنات الحية التي تستخدم المياه هي دائما عرضة للتجفيف في البيئة. هي التي تحرك أنشطتها الصغرى على أساس البوليمر الحيوي والهياكل الكلية، كما رأينا في حالات نقل المياه في الحزم الوعائية وترطيب المياه في طبقات الجلد. في هذه الدراسة، قمنا بتطوير طريقة لتقييم تأثير المحاليل المائية البلورية السائلة (LC) تتكون من البوليمرات الحيوية على تجفيف. كما البوليمرات الحيوية LC لها وزن megamolecular، اخترنا لدراسة السكريات والبروتينات هيكل الخلية، والحمض النووي. مراقبة حلول البوليمر الحيوي أثناء التجفيف تحت الضوء المستقطب تكشف milliscale التكامل الذاتي بدءا من واجهة الهواء-LC غير مستقرة. يمكن رصد ديناميات حلول البوليمر الحيوي LC المائية عن طريق تبخير الماء من خلية جانب واحد مفتوحة. من خلال تحليل الصور التي يتم التقاطها باستخدام ضوء عبر الاستقطاب، فمن الممكن التعرف على التغيرات المكانية والزمانية في المعلمة أجل توجهي. هذهيمكن أن يكون طريقة مفيدة لتوصيف المواد الاصطناعية ليس فقط في مختلف المجالات، ولكن أيضا الأنسجة الحية الطبيعية. ونحن نعتقد أنه سيوفر طريقة التقييم للمواد لينة في مجالات الطب الحيوي والبيئة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من خلال التركيز على هياكل جامدة، على شكل قضيب من البوليمرات الحيوية، وقد استخدمت مواد لينة ديناميكية لمختلف التطبيقات، بما في ذلك المصفوفات السكاريد بيوفيلم ^1، "المواد الهلامية النشطة" التي تتألف من البروتينات هيكل الخلية ^2، و "اوريغامي الحمض النووي" والأشكال المطلوبة ^3. لتوضيح الخصائص الهيكلية، تم استكشاف استراتيجيات عديدة، مثل انتقال المجهر الإلكتروني والمسح الضوئي المجهر الإلكتروني، مجهر القوة الذرية، ومتحد البؤر المجهري مضان. ومع ذلك، لأن هذه الأساليب تجري في معظمها في حالة المجففة أو ثابتة، فمن الصعب أن أشرح السلوكيات الحيوية في جداول العيانية، كما رأينا في المنظومات الحية الفعلية. في الآونة الأخيرة، لاحظنا بنجاح السلوك الديناميكي من البوليمرات الحيوية على واجهة الهواء-LC المائية من خلال الضوء المستقطب ^4. خلال تصور لهيكل المنحى حين تجفيف البوليمر الحيويحل، أشارت التغيرات الزمانية التكامل الذاتي من البوليمرات الحيوية على واجهة الهواء-LC غير مستقرة.

هنا، نحن تصف بروتوكول لتجفيف حلول LC البوليمر الحيوي في واجهة الهواء-LC باستخدام أدوات الاستقطاب. خلافا لغيرها من التحليلات للمرحلة LC التي لا تنظر تجفيف ^{^5،} ^6، وقد تم التحقيق ديناميات LC أثناء عملية التجفيف هنا من خلال تقييم المعلمة أجل توجهي في وجهة النظر الجانبي للمرحلة السوائل في زنزانة جانب واحد مفتوحة . مزيج من التبخر الخلية واستخدام أدوات الاستقطاب يسمح لرصد العيانية مع اتجاه التبخر التي تسيطر عليها. وبالإضافة إلى ذلك، كان من الممكن للتحقق من صحة السجلات التجفيف من خلال التركيز على الهياكل البلورية للmicrodomains كثف، والتي تأثرت الوزن الجزيئي، والتركيز، وما إلى ذلك لإثبات فعالية الأسلوب، وتجفيف الموالية، وقد تم التحقيق cesses من البوليمرات الحيوية الأساسية مع الأشكال قضيب جامدة، مثل السكريات، والأنابيب الدقيقة (MTS)، وDNA. لقد اخترنا هذه البوليمرات الحيوية لأنها أمثلة نموذجية من الجزيئات الهرمية مع الأوزان megamolecular، والتفاعلات بين الجزيئات التي تمكنها من تشكيل الدول LC.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. أدوات

جهاز الاستقطاب
1. لبناء جهاز الاستقطاب، وتوفير مصدر الضوء مع مصابيح الهالوجين، وهو دليل الضوء، المستقطبات، مرحلة عينة، والسكك الحديدية البصرية، قضيب يقف، وكاميرا رقمية أحادية العدسة العاكسة (انظر الشكل 1C ومواد قائمة على الاستقطاب أجزاء الجهاز).

2. إعداد الحل BIOPOLYMER

حلول السكاريد
1. حل sacran ⁷ (0.5 غرام) في الماء النقي (100 مل) عن طريق اثارة في ~ 80 درجة مئوية لمدة أكثر من 12 ساعة. خلال حل، تغطية الحاويات مع غلاف بلاستيكي لمنع التبخر. تحضير محلول مائي للصمغ زنتان بنفس الطريقة.
2. تبريد الحلول في ~ 25 درجة مئوية إلى الحصول على المحاليل المائية 0.5٪ بالوزن.
3. أجهزة الطرد المركزي في حل sacran لإزالة الشوائب (48400 x ج، 4 ° C، 1 ساعة، 3 تيمالخانات).
حل MT
1. إعداد 0.5٪ بالوزن تويولين حل (1 مل) في منطقة عازلة بريتون-روبنسون (80 ملي piperazine- N، N '-bis (حمض 2-ethanesulfonic) (أنابيب)؛ 1 ملم جلايكول الإثيلين مكرر (β-aminoethyl الأثير) - N، N، N، N 'حمض -tetraacetic (EGTA)؛ و 5 ملي MgCl _2، ودرجة الحموضة 6.8) على الجليد ^8.
2. استخدام الحل تويولين 0.5٪ بالوزن (50 ميكرولتر) وغوانوزين-5 "- [(α، β) -methyleno] ثلاثي الفوسفات (GpCpp) (5 ميكرولتر) لإعداد حل تويولين GpCpp التي تحتوي على (50 ميكرولتر). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات للحصول على نواة MT مستقرة.
  ملاحظة: دور GpCpp هو دعم تشكيل MT وقمع تماما التحلل من MT إلى تويولين.
3. مزيج من محلول 0.5٪ بالوزن تويولين (950 ميكرولتر) والحل تويولين GpCpp التي تحتوي على (50 ميكرولتر) في ~ 25 درجة مئوية لمدة 1 يوم للحصول على مستقر 0.5٪ بالوزن حل MT.
حل DNA
1. إعداد 0.5٪ بالوزن حل DNA (1 مل) في حل العازلة تريس، EDTA (10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 8.0، مع 1 ملم EDTA).
حافظ على 0.5٪ بالوزن حلول عينة البوليمر الحيوي عند 25 درجة مئوية لمدة التجربة التجفيف.

3. التجارب التجفيف والمراقبة تحت ضوء مستقطب عبر

الحلول في زنزانة جانب واحد المفتوحة (الشكل 1A)
1. قطع ورقة السيليكون (انظر قائمة المواد) في شكل مناسب مع سمك 1 مم (البعد الداخلي من 5-15 ملم، 1 ملم، و~ 20 مم؛ الشكل 1A).
  1. تجميع خلية جانب واحد مفتوحة تتكون من فاصل السيليكون مع البعد الداخلي من 5-15 ملم، 1 ملم، و~ 20 ملم واثنين من الشرائح الزجاجية غير المعدلة (76 مم × 1 ملم × 26 ملم). إصلاح جانبي الخلية مع لقطات مزدوجة مقدما للحفاظ على حل عينة من تسرب.
2. ببطء إضافة كل من الحل البوليمر الحيوي 0.5٪ بالوزن (100-300 ميكرولتر) باستخدام ~ 1 ملم من حجم المسام الماصةالشركة المصرية للاتصالات تلميح إلى كل خلية في ~ 25 درجة مئوية. إزالة فقاعات الهواء من الخلايا باستخدام إبرة حقنة.
3. وضع الخلايا في فرن دائري مع الهواء عند 60 درجة مئوية تحت الضغط الجوي للتبخر. الاتجاه المعاكس التبخر إلى أن الجاذبية.
الملاحظات تحت الضوء عبر الاستقطاب (الشكل 1B-1C)
1. توفر الضوء المرئي مباشرة عبر مصابيح الهالوجين 100 W مع مصدر ضوء سطح مستو، على مساحة واسعة (80 ملم × 80 ملم). ضبط المستقطبات إلى 45 درجة و 135 درجة باستخدام حاملي (الشكل 1C).
2. إصلاح مواقف مصدر للضوء، المستقطبات، المرحلة العينة، وكاميرا باستخدام السكك الحديدية البصرية والمدرجات قضيب (الشكل 1C). ضع مرحلة عينة بين المستقطبات اثنين (المسافة بين المستقطبات ينبغي أن يكون ~ 5 سم). وضع الكاميرا ~ 20 سم من مرحلة عينة للسماح التركيز.
3. في أوقات معينة، ووضع عينات من الخطوة 3.1.3 بين بولاrizers على التوازي مرحلة إلى XZ-الطائرة وتغطية الجهاز مع ستارة سوداء. يظهر الجهاز الفعلي في الشكل 1C.
4. تصوير العينات من خلال خطي عبرت المستقطبات باستخدام كاميرا عاكسة مفردة العدسة الرقمية مع عدسة التكبير القياسية (انظر قائمة المواد). التحكم في إعدادات الكاميرا، مثل المسافة البؤرية، وذلك باستخدام برامج الكمبيوتر (انظر قائمة المواد).
التحليل المكانية والزمانية لشدة الضوء التي تنتقل عن طريق (الشكل 1C)
1. لتقييم التغيير المعلمة أجل توجهي في عملية التجفيف، وجمع الصور كل ساعة لمدة 24 ساعة.
2. قياس شدة الضوء ينتقل على طول محور في الاتجاه Z-كقيمة الرمادي باستخدام برنامج معالجة الصور (مثل يماغيج).
3. رسم بياني للقيمة الرمادي بوصفها وظيفة من المسافة من الجانب المفتوح العلوي.
الملاحظات المجهرية تحت من ligh الاستقطاب عبرر (الشكل 1D)
1. للتحقق من الأساليب، وجعل الملاحظات المجهرية مع المجهر الاستقطاب مزودة بكاميرا CCD ^9. الحفاظ على لوحة التخلف من الدرجة الأولى في مسار الضوء. ضبط الأوضاع للصور باستخدام برامج الكمبيوتر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام الجهاز كما هو مبين في الشكل 1، والتكامل الذاتي من microdomain إلى macrodomain على تجفيف تم تقييم اجهة الهواء-LC (الشكل 2A). كما المظاهرة الأولى من التجربة التجفيف، و، وتمت مقارنة نوعين من السكريات megamolecular، sacran (M _ث = 1.9 × 10 ⁷ غ مول ^-1) وصمغ زنتان (4.7 × 10 ⁶ غرام مول ^-1). ويبين الشكل 2B الصور من الحلول في الخلية تحت ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان من الصعب في بعض الأحيان للكاميرا للتركيز على عينة بسبب شدة الضوء التي تنتقل عن طريق كونها منخفضة جدا. في مثل هذه الحالات، ووضع موسعة فيلم من البلاستيك الشفاف على المسرح ساعد في ترتيب التركيز. وكان الحد من القرار ملاحظتها تعتمد على عدسة الكاميرا، ~ 10 ميكرون في هذه الحالة. وكان الحد ملاحظتها من سمك العينة، Δy، التي تعتمد على أقصى قدر من شدة الضوء من مصباح، ~ 10 ملم في هذه الحالة.

وميزة الجهاز هو مبين في

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل المنح في المساعدات للعلماء الشباب (16K17956) من وزارة التربية والتعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا في اليابان، ومركز Technoscience كيوتو، ومؤسسة ميتاني للبحوث والإنماء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
شركة sacran	Green Science Materials Inc. ، اليابان		من Aphanothece sacrum. M_{w< / sub> = 1.9 & مرات ؛ 10^{7< / sup> g mol^{-1< / sup>}}}
xanthan gum	Taiyo Kagaku Co. ، اليابان	Neosoft XC	من Xanthomonas campestris. M_{w< / sub> = 4.7 & مرات ؛ 10^{6< / sup> جم مول^{-1< / sup>}}}
tubulin	Cytokeeleton، Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية	T240	من دماغ الخنازير.
GpCpp	جينا العلوم البيولوجية ، ألمانيا	NU405L
piperazine-N ، N & prime ؛ < / م > مكرر (2-حمض إيثان سلفونيك)	سيجما ألدريتشي ، شركة ذ م م.	أنابيب P6757-500G
الإيثيلين جلايكول مكرر (& بيتا ؛ أمينوإيثيل الأثير) -< م > N ، N ، N ، N < / em > - حمض رباعي الأسيتيك	Dojindo Molecular Technologies، Inc.	342-01314	EGTA
MgCl₂-6H₂O	واكو للصناعات الكيميائية النقية، المحدودة.	135-15055
KOH	واكو للصناعات الكيميائية النقية المحدودة	162-21813	بيليه
الحمض النووي	سيجما ألدريتش ، شركة ذ م م.	D1626	من خصيتي السلمون. Mw = 1.3 & مرات ؛ 10^{6< / sup> Da (~ 2,000 نقطة أساس)}
محلول عازل Tris-EDTA	Sigma-Aldrich، Co. LLC.	T9285-100ML	10 ملي تريس ، درجة الحموضة 8.0 ، مع 1 ملي مولار EDTA
زجاج منزلق	ماتسونامي الزجاج المحدودة ، اليابان	S1111
ورقة مطاط السيليكون	أسون المحدودة.	6-611-32	السماكة:
جهاز طرد مركزي	Beckman-Coulter، Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكية	Avanti J-25	مجهزة بمصدر ضوء دوار JA-20
	Sumita Optical Glass، Inc. ، اليابان	دليل ضوء LS-LHA
	Sumita Optical Glass، Inc. ، اليابان	GF7.2-1-L1500R-M80 (AAAR-015M)	80 مم & مرات مصباح
هالوجين	Ushio Inc. ، اليابان	JCR 15V150WBN
حامل	Sigmakoki, Co.,Ltd.	KMH-80
مرحلة عينة	Sigmakoki، Co.، Ltd.	TARW-25503L
حامل عينة	Sigmakoki، Co.، Ltd.	SHA-25RO
قضيب	Sigmakoki، المحدودة	ROU-12-40
حامل الوظائف	Sigmakoki، Co.، Ltd.	RS-6-40
حامل المشاركات	Sigmakoki، Co.، Ltd.	RS-12-60
حامل الوظائف	Sigmakoki، Co.، Ltd.	RS-12-80
حامل المشاركات	Sigmakoki، Co.، Ltd.	RS-12-130
الناقل	Sigmakoki، Co.، Ltd.	حامل الكاميرا CAA-25LS
	Sigmakoki، Co.، Ltd.	CMH-2
السكك الحديدية البصرية المتوسطة	Sigmakoki، Co.، Ltd.	OBA-500SH
lenstube	Tomytech ، BORG	lenstube BK	80 &phi ؛ L25 مم ؛
lenstube	Tomytech, BORG	lenstube BK	80φ, L50 mm
توميتك متعددة	النطاقات ، BORG		80 & phi ؛
لوحة V	Tomytech ، حامل لوحة BORG	V 60S
	Viexen ، Co.، Ltd.	حامل اللوحة SX
EOS Kiss X7i	Canon Inc., Japan	8594B001	مع عدسة تكبير قياسية, EFP 18-55 مم
برنامج التصوير الفوتوغرافي	Canon Inc. ، اليابان	EOS Utility
PC	Microsoft	مجهر الاستقطاب السطحي
	أوليمبوس	BX51
التخلف من الدرجة الأولى	أوليمبوس	U-TP530	λ = 530 نانومتر
كاميرا CCD	أوليمبوس	DP80
برنامج التصوير الفوتوغرافي	Olympus	cellSens برنامج معالجة الصور القياسي
المستند إلى Java	المعاهد الوطنية للصحة	ImageJ

1 مم 80 مم لوحة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Flemming, H. -C., Wingender, J. The biofilm matrix. Nat. Rev. Microbiology. 8 (9), 623-633 (2010).
Osada, Y., Kawamura, R., Sano, K. Hydrogels of cytoskeletal proteins. , Springer. (2016).
Rothemund, P. W. K. Folding DNA to create nanoscale shapes and patterns. Nature. 440, 297-302 (2006).
Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Milliscale self-integration of megamolecule biopolymers on a drying gas-aqueous liquid crystalline interface. Biomacromolecules. 17 (6), 2096-2103 (2016).
De Gennes, P. G., Prost, J. The physics of liquid crystals. , Oxford University Press. Oxford, UK. (1993).
De Gennes, P. G., Brochard-Wyart, F., Quere, D. Capillarity and wetting phenomena: drops, bubbles, pearls, waves. , Springer. (2003).
Okajima, M. K., Kaneko, D., Mitsumata, T., Kaneko, T., Watanabe, J. Cyanobacteria that produce megamolecules with efficient self-orientations. Macromolecules. 42 (8), 3058-3062 (2009).
Okeyoshi, K., Kawamura, R., Yoshida, R., Osada, Y. Thermo- and photo-enhanced microtubule formation from Ru(bpy)32+-conjugated tubulin. J. Mater. Chem. B. 2, 41-45 (2014).
Olympus. Support BX51P. , Available from: http://www.olympus-ims.com/microscope/bx51p/ (2016).
Matsuo, E. S., Tanaka, T. Kinetics of discontinuous volume-phase transition of gels. J. Chem. Phys. 89, 1695-1703 (1988).
Okajima, K., Mishima, R., Amornwachirabodee, K., Mitsumata, T., Okeyoshi, K., Kaneko, T. Anisotropic swelling in hydrogels formed by cooperatively aligned megamolecules. RSC Adv. 5, 86723-86729 (2015).
Joshi, G., Okeyoshi, K., Okajima, M. K., Kaneko, T. Directional control of diffusion and swelling in megamolecular polysaccharide hydrogels. Soft Matter. 12, 5515-5518 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

طرق لالتكامل الذاتي للMegamolecular البوليمرات الحيوية على تجفيف الهواء-LC واجهة

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة