مقالة منهجية

تحليل النسب الخلية ودراسات وظائف الجينات عن طريق التوأم بقعة MARCM

DOI:

10.3791/55278

⸱

مارس 2, 2017

 ,  ,  , 
1Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica, 2Graduate Institute of Life Sciences, National Defense Medical Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكول لمعدات وضع العلامات الفسيفساء الذي يسمح التصور من الخلايا العصبية المشتقة من خلية سلفية مشتركة في لونين مميزة. هذا يسهل تحليل النسب العصبية لديها القدرة على الخلايا العصبية الفردية التي يرجع تاريخها ولادة ودراسة وظيفة الجين في نفس الخلايا العصبية من مختلف الأفراد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

M osaic على nalysis مع ص epressible ج الذراع م arker (MARCM) هو عبارة عن فسيفساء نظام وضع العلامات الإيجابية التي تم تطبيقها على نطاق واسع في الدراسات العصبية ذبابة الفاكهة لتصوير الأشكال التضاريسية معقدة والتلاعب وظيفة الجينات في مجموعات فرعية من الخلايا العصبية داخل إنفراد خلاف ذلك، ورابط الجأش الكائنات الحية. وتتوسط الفسيفساء الوراثية الناتجة في النظام MARCM من خلال إعادة التركيب في مواقع محددة بين الكروموسومات المتجانسة داخل الخلايا المنقسمة تمهيدا لإنتاج كلا ملحوظ (استنساخ MARCM) والخلايا الوليدة لا تحمل علامات مميزة خلال الانقسام. امتدادا للطريقة MARCM، ودعا التوأم بقعة MARCM (tsMARCM)، والعلامات كلا من الخلايا التوأم مستمدة من سلف مشترك مع اثنين من ألوان مختلفة. وقد تم تطوير هذه التقنية لتمكين استرجاع المعلومات المفيدة من كلا نصفي الأنساب. من خلال تحليل شامل أزواج مختلفة من الحيوانات المستنسخة tsMARCM، يسمح نظام tsMARCM عالية الدقة النسب العصبي mappinز لتكشف بالضبط ولادة النظام من الخلايا العصبية المسماة المنتجة من الخلايا الاولية المشتركة. وعلاوة على ذلك، فإن النظام tsMARCM يمتد أيضا الدراسات وظيفة الجين من خلال السماح للتحليل المظهري من الخلايا العصبية متطابقة من الحيوانات المختلفة. هنا، نحن تصف كيفية تطبيق نظام tsMARCM لتسهيل دراسات التنمية العصبية في ذبابة الفاكهة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الدماغ، تتألف من عدد كبير وأنواع مختلفة من الخلايا العصبية، يمنح الحيوانات مع القدرة على إدراك، عملية، والاستجابة للتحديات من العالم الخارجي. وتستمد الخلايا العصبية في الدماغ الكبار ذبابة الفاكهة المركزي من عدد محدود من الخلايا الجذعية العصبية، ودعا neuroblasts (مصلحة الدولة للاحصاء)، أثناء التطور 1 و 2. أكثر من مصلحة الدولة للاحصاء المشاركة في تكوين الخلايا العصبية في الدماغ في ذبابة الفاكهة الخضوع لتقسيم غير المتماثلة لتوليد مصلحة الدولة للاحصاء تجديد الذات وخلايا العقدة الأم (شهامة)، وشهامة ثم تذهب من خلال جولة أخرى من تقسيم لإنتاج خليتين ابنة أن تفرق في الخلايا العصبية 3 (الشكل 1A ). ونظرا لتعقيد التشكل العصبية والتحديات المرتبطة بتحديد الخلايا العصبية محددة، والإيجابية الفسيفساء التكنولوجيا وضع العلامات، وتحليل الفسيفساء مع علامة الخلية كظوم (MARCM)، اخترع لتمكين visualizatأيون من الخلايا العصبية واحدة أو مجموعة فرعية صغيرة من الخلايا العصبية من سكان المحيطة، الخلايا العصبية غير المسماة 4.

MARCM يستخدم flippase (FLP) / FLP الاعتراف الهدف (FRT) نظام للتوسط إعادة التركيب في مواقع محددة بين الكروموسومات المتجانسة داخل الخلية الفاصل السلائف تحمل أليل متخالف من الجين كاظمة، الذي عادة يحول دون التعبير عن الجينات مراسل 4 التعبير. بعد تقسيم الإنقسامية، يتم فصل الكروموسومات المؤتلف إلى الخلايا التوأم، مثل أن خلية واحدة تحتوي على الأليلات متماثل من الجين كاظمة وخلية أخرى لا يوجد لديه كاظمة الجينات التعبير عن مراسل في تلك الخلية (ونسله) لم يعد منعت 4. عادة ما تكون موجودة ثلاثة أنماط نسيلي في تجربة MARCM عند يسببها FLP عشوائيا في مصلحة الدولة للاحصاء أو شهامة: وحيدة الخلية واثنين من خلية GMC الحيوانات المستنسخة، التي تصور مورفولوجيا الخلايا العصبية في resolutio وحيدة الخليةن، ومتعدد الخلوي-NB الحيوانات المستنسخة، التي تكشف عن أنماط شكلية كاملة من الخلايا العصبية المستمدة من ملاحظة المشترك (الشكل 1B). وقد تم تطبيق هذه التقنية MARCM على نطاق واسع في الدراسات العصبية ذبابة الفاكهة، بما في ذلك في تحديد نوع الخلايا العصبية لإعادة إعمار شبكات الأسلاك على نطاق الدماغ، وتحليل النسب العصبية للكشف عن تاريخ التنموي من الخلايا العصبية، وتوصيف المظهري وظائف الجينات المعنية في مواصفات مصير الخلايا، والتشكل العصبية والتمايز يدرس 5، 6، 7، 8، 9، 10. لأن MARCM التقليدية تسميات واحد فقط من خليتين ابنة (والأنساب) بعد وقوع الحدث الإنقسامية إعادة التركيب التي يسببها، يتم فقدان المعلومات يمكن أن تكون مفيدة من الجانب غير المراقب. هذا القيد ما يحول دون تطبيق الأساسي Mنظام ARCM إلى عالية الدقة يحلل الكثير من الأنساب العصبية التي تبديل مصائر خلية في وتيرة سريعة أو لدقة التحليلات من وظائف الجينات في الخلايا العصبية متطابقة من مختلف الحيوانات 11 و 12.

التوأم بقعة MARCM (tsMARCM) هو نظام متطور التسميات الخلايا العصبية مشتقة من سلف مشترك مع اثنين من ألوان مختلفة، والتي تمكن من التعافي من المعلومات المفيدة من كلا الجانبين من الخلايا التوأم، وبالتالي التغلب على قيود على نظام MARCM الأصلي 11 ( الشكل 2A - 2C). في نظام tsMARCM، واثنين من الحمض النووي الريبي التدخل (رني) القائم على تقع المكثفات في مواقع المتحولة من الكروموسومات المتجانسة داخل الخلية السلائف، والتعبير عن تلك المكثفات تمنع بشكل مستقل التعبير عن صحفيين كل منها (الشكل 2B). وبعد الإنقسامية إعادة التركيب في مواقع محددة بوساطة من خلال نظام FLP / FRT، وطوماس فيبسفصلت المكثفات س أساس رني تصبح في خلايا التوأم للسماح للتعبير عن صحفيين متميزة (الشكل 2B). نمطين نسيلي، وحيدة الخلية المرتبطة استنساخ وحيدة الخلية والخلية يومين GMC المرتبطة استنساخ عديد الخلايا-NB، وينظر عادة في تجربة tsMARCM (الشكل 2C). معلومات مستمدة من جانب واحد من يمكن استخدامها كمرجع بالنسبة للجانب الآخر الخلايا التوأم، مما عالية الدقة تحليل النسب العصبي، مثل الخلايا العصبية المسماة التي يرجع تاريخها الولادة، والمظهرية ويحلل الخلايا العصبية متطابقة في الحيوانات المختلفة للتحقيق الدقيق وظيفة الجينات العصبية 11 و 12. هنا، نقدم بروتوكول خطوة بخطوة تصف كيفية إجراء التجربة tsMARCM، والتي يمكن استخدامها من قبل مختبرات أخرى لتوسيع نطاق دراستهم التنمية العصبية (فضلا عن تطوير الأنسجة الأخرى، إن وجدت) في ذبابة الفاكهة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. بناء tsMARCM جاهزة الذباب عن طريق الجينات المحورة مطلوب 11 و 13

  1. تولد النسخة الأصلية من الذباب tsMARCM جاهزة من الجينات المحورة التي تتم عن طريق الذباب الفردية 11 (انظر الجدول 1). إجراء مخططات القياسية ذبابة الوراثية المعبر، والتي تم وصفها سابقا، من خلال وضع الجينات المحورة متعددة في أسهم الطيران نفسها 13.
    1. في خط الوالدين واحد، تجميع الجينات المحورة من FRT 40A، UAS-mCD8 :: GFP (اول صحفي، mCD8 :: GFP، تعبير عن التحوير تحت سيطرة المنبع تسلسل تفعيل المروج، التي تنتج مراسل غشاء المربوطة الكتلة الماوس التمايز 8 البروتين تنصهر مع بروتين فلوري الأخضر)، وUAS-rCD2RNAi (القامع الذي يمنع التعبير عن مراسل الثاني، ورني ضد التعبير عن مجموعة الفئران سو التمايز 2، rcd2) على الذراع الأيسر من كروموسوم 2 الثانية. مكان الأنسجة محددة سائق -GAL4 على X أو 3 الثالثة كروموسوم، إن أمكن.
    2. في خط الوالدين الآخرين، تجميع الجينات المحورة من FRT 40A، UAS-rCD2 :: طلب تقديم العروض (مراسل الثاني، rCD2 :: طلب تقديم العروض، ومراسل آخر غشاء المربوطة تتكون من البروتين rCD2 تنصهر مع بروتين أحمر فلوري)، وUAS-GFPRNAi (القامع الذي يمنع التعبير عن mCD8 :: GFP، ورني ضد التعبير عن GFP) على الذراع الأيسر من كروموسوم 2 الثانية. ضع الحرارة صدمة (HS) -FLP أو FLP الأنسجة بخاص على X أو 3 الكروموسوم الثالث، إذا كان ذلك ممكنا.
  2. تولد النسخة الجديدة من الذباب tsMARCM جاهزة من الجينات المحورة التي تتم عن طريق الذباب الفردية 14 (انظر الجدول 1). إجراء مخططات معبر الطيران الجيني القياسية، والتي تم وصفها صreviously، من خلال وضع الجينات المحورة متعددة في أسهم الطيران نفسها 13.
    1. في خط الوالدين واحد، تجميع الجينات المحورة من موقع FRT وUAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i (التحوير مجتمعة mCD8 :: GFP والقامع الذي يمنع التعبير عن rCD2 :: طلب تقديم العروض) جنبا إلى جنب في نفس ذراع الثانية 2 أو 3 الثالثة كروموسوم (يشار أزواج المناسبة من الجينات المحورة من FRT وUAS-mCD8.GFP.UAS-rCD2i في الجدول 1). وضع سائق الأنسجة محددة، GAL4 على الكروموسومات الأخرى من كروموسوم الموقع FRT المختار، إن أمكن.
    2. في خط الوالدين الآخرين، تجميع الجينات المحورة من موقع FRT وUAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi (التحوير الآخرين مجتمعين من rCD2 :: طلب تقديم العروض والقامع الذي يمنع التعبير عن mCD8 :: GFP) في نفس الذراع من الثانية 2 أو 3 الكروموسوم الثالث (أزواج المناسبة من الجينات المحورة من FRT وUAS-rCD2.RFP.UAS-GFPi في الجدول 1). مكان HS-FLP أو الأنسجة محددة، FLP على الكروموسومات الأخرى من كروموسوم الموقع FRT المختار، إن أمكن.

2. الصليب tsMARCM جاهزة الذباب لتوليد tsMARCM النسخ في ذريتها

  1. الذباب عبر tsMARCM جاهزة معا (على سبيل المثال، وضعت 10-15 الذباب الذكور من الخطوة 1.1.1 أو 1.2.1 و 20-30 أنثى عذراء الذباب من الخطوة 1.1.2 أو 1.2.2 معا) في قارورة ذبابة الغذاء مع الطازجة من صنع عجينة الخميرة على جدار القارورة.
  2. الحفاظ على عبروا الذباب tsMARCM جاهزة عند 25 درجة مئوية لمدة 2 أيام لتعزيز فرصة التزاوج قبل جمع البويضات المخصبة.
  3. وكثيرا ما نقل عبر الذباب tsMARCM جاهزة في قوارير yeasted الطازجة لتجنب الازدحام (نزولا الذباب أو استخدام ثاني أكسيد الكربون لتخدير الذباب لتسهيل نقل، الحفاظ على ما لا يزيد عن 80-100 البويضات المخصبة في 10 مل يطير الغذائية عن طريقل لتجنب الكثير من اليرقات).
  4. ثقافة الحيوانات tsMARCM (أي البويضات المخصبة، مثال على التركيب الوراثي للحيوانات tsMARCM، كما تستخدم في الشكل (3)، هو HS-FLP [22]، ث / ث، UAS-mCD8 :: GFP، UAS-rCD2RNAi، FRT 40A ، GAL4-GH146 / UAS-rCD2 :: طلب تقديم العروض، UAS-GFPRNAi، FRT 40A، +، +) التي وضعت في قارورة نقل متسلسل عند 25 درجة مئوية حتى أن تتطور إلى مراحل المطلوب (على سبيل المثال، أجنة ويرقات، أو الشرانق).
  5. ضع قارورة نقل التي تحتوي على الحيوانات tsMARCM في هذه المرحلة التنموية نفسها إلى 37 درجة مئوية حمام الماء لمدة 10، 20، 30، 40، و 50 دقيقة لتحديد الوقت الأمثل للحرارة صدمة أن يدفع التعبير عن FLP لتوليد استنساخ tsMARCM من الفائدة. تخطي هذه الخطوة في حالة استخدام FLP الأنسجة بخاص في التجربة tsMARCM (يفضل HS-FLP عن النسب العصبي التحليلات؛ وقد وصفت أسباب هذا التفضيل السابق 15).
    ملاحظة: كرر الخطوة 2.5 استخدام الوقت الأمثل للحرارة صدمة في التجارب tsMARCM في المستقبل إذا أراد المزيد من الحيوانات المستنسخة tsMARCM المصالح؛ عموما، هو فعل المزيد من التعبير FLP في HS-FLP [22] مقارنة HS-FLP [1] بنفس الوقت الحرارة صدمة.
  6. ثقافة-صدمت حرارة الحيوانات tsMARCM عند 25 درجة مئوية حتى أنها وصلت إلى مرحلة النمو المناسبة، ومن ثم الانتقال إلى الخطوة 3.

3. إعداد، وصمة عار، وأدمغة جبل يطير تحتوي على tsMARCM النسخ

  1. إعداد أطباق ملقط الحماية. مزيج الجزء ألف (30 ز) والجزء باء (3 ز) من كيت سيليكون إلاستومر مع الفحم المنشط (0.25 جم). يصب الخليط في أطباق مناسبة.
  2. تشريح اليرقات، العذراء، أو أدمغة البالغين من الحيوانات tsMARCM في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام ملقط على طبق ملقط حماية ينظر اليها من خلال المجهر تشريح. وكان من بروتوكول لتشريح ذبابة الدماغ تنازلي ملاحظة:ribed سابقا 16.
  3. إصلاح العقول ذبابة في لوحة بقعة الزجاج مع برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 4٪ الفورمالديهايد في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. معالجة العقول ذبابة في هذه اللوحة بقعة الزجاج للفترة المتبقية من الخطوات.
  4. شطف أدمغة ذبابة ثلاث مرات مع 1٪ PBT (برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 1٪ تريتون X-100) وغسلها ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في كل من 1٪ PBT (شطف: إزالة PBT وإضافة PBT جديد بسرعة، غسل: إزالة PBT، إضافة PBT جديد، واحتضان العقول ذبابة في PBT جديد باستخدام شاكر المداري).
  5. احتضان العقول الطاير مع خليط من الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة. مثال على مزيج من الأجسام المضادة الأولية غير الفئران CD8 مكافحة الأجسام المضادة (1: 100)، أرنب الأجسام المضادة لمكافحة عن dsRed (1: 800)، ومكافحة Bruchpilot (بدر) الضد الماوس (01:50) في 1٪ PBT تحتوي على 5٪ مصل الماعز العادي (خ ع).
  6. شطف أدمغة ذبابة ثلاث مرات مع 1٪ PBT، ثم غسلها ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل منهما مع 1٪ PBT.
    7. احتضان العقول الطاير مع خليط من الأجسام المضادة الثانوية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة. مثال على مزيج من الأجسام المضادة الثانوية هو الماعز المضادة للفأر مفتش الأضداد مترافق مع صبغ الأخضر الفلورسنت (1: 800)، الماعز المضادة للأرنب مفتش الأضداد مترافق مع صبغ أصفر فلوري (1: 800)، والماعز المضادة للماوس مفتش الأضداد مترافق مع صبغ بعيدة الحمراء الفلورسنت (1: 800) في 1٪ PBT تحتوي على 5٪ خ ع.
  7. شطف أدمغة ذبابة ثلاث مرات مع 1٪ PBT، ثم غسلها ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة لكل منهما مع 1٪ PBT. جبل لهم على شريحة صغيرة مع كاشف مضادة للتبريد. وضع غطاء من الزجاج الصغيرة على الشريحة الصغيرة لتغطية وحماية العقول ذبابة. ختم حواف الزجاج غطاء والجزئي شريحة متناهية الصغر باستخدام طلاء الأظافر واضحة. تخزين هذه المركبة ومختومة يطير عينات الدماغ في 4 درجات مئوية.

4. خذ، عملية، وتحليل الصور فلوري من tsMARCM النسخ

  1. التقاط الصور الفلورسنت من tsMARCM استنساخ الابأوم عينات تم إنشاؤه في الخطوة 3.8 باستخدام نظام الفحص المجهري متحد البؤر الاختيار.
  2. مداخن مشروع tsMARCM الصور الفلورسنت مبائر إلى ثنائية الأبعاد، بالارض الصور باستخدام برامج معالجة الصور المرفق مع نظام الفحص المجهري متحد البؤر من اختيار (انظر الشكل 3B - 3E، الجيل الثالث 3G - 3J، 3L - 3O، و3Q - 3T للحصول على أمثلة من بالارض صور الفلورسنت مبائر).
  3. حساب عدد الخلايا من الجانبين متعددة الخلوية-NB من الحيوانات المستنسخة tsMARCM باستخدام برامج معالجة الصور المناسبة (على سبيل المثال، فإن وظيفة "خلية مكافحة" في ImageJ 17؛ انظر الشكل 3E، 3J، 3O، و3T للحصول على أمثلة للخلية هيئات من الخلايا العصبية).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استخدم النظام tsMARCM لتسهيل النسب العصبي التحليلات والدراسات وظيفة الجين من خلال استرجاع المعلومات الهامة على الخلايا العصبية المستمدة من مصلحة الدولة للاحصاء المشتركة. وقد استخدم هذا النظام لتحديد معظم (إن لم يكن كل) أنواع الخلايا العصبية، وتحديد عدد الخلايا من كل نوع الخلايا العصبية، والتأكد من الولادة ترتيب هذه الخلايا العصبية 11، 12، 18 (انظر

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خطوات حاسمة في إطار بروتوكول

الخطوات 1.1.1، 1.2.1، 2.3، 2.5، و 3.2 حاسمة للحصول على نتائج جيدة tsMARCM. ويفضل السائقين -GAL4 الأنسجة المحددة التي لا تعبر عن GAL4 في الأسلاف العصبية للخطوات 1.1.1 و 1.2.1. تجنب الإفراط في الازدحام-الحيوانات التي تزرع في قارورة ذبابة المواد الغذائية في الخطوة 2.3. لأن الكمون الاستقراء، ومستوى التعبير FLP على حرارة صدمة، ومتوسط الوقت الفاصل الأسلاف العصبية (أي مصلحة ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا (MOST 104-2311-B-001-034) ومعهد الخلوية والبيولوجيا العضوية، أكاديمية سينيكا، تايوان.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ثاني أكسيد الكربون (CO2< / sub>)البائع المحليn.a.التخديرالذباب
CO2< / sub> padالبائع المحليn.a.فرزوعبر ونقل الذباب
10x PBS درجة الحموضة 7.4Uniregion Bio-Tech (أو بائعين آخرين)PBS001تشريح وشطف وغسل ومناعة أدمغة الذبابة
الفورمالديهايدسيجما ألدريتش252549إصلاح أدمغة الذبابة
Triton X-100Sigma-AldrichT8787شطف, غسل ومناعة ذبابة أدمغة
الماعز العاديجاكسون ImmunoResearch 005-000-121مصل
الفئران المضادة للفأر CD8 الأجسام المضادةInvitrogenMCD0800أدمغة ذبابة
Immunostain الأرانب المضادة للجسم المضاد الأحمرClonetech632496أدمغة ذبابة Immunostain دماغة ذبابة
الفأر المضادة للأجسام المضادة ل Brpدراسات تنموية الورم الهجين بنكnc82أدمغة
ذبابة Immunostainالماعز المضاد للجرذان الجسم المضاد IgG المقترن مع Alexa Fluor 488InvitrogenA11006أدمغة ذبابة Immunostain
الماعز الجسم المضاد IgG المضاد للماعز المقترن مع Alexa Fluor 546InvitrogenA11035أدمغة الذبابة المناعية
الماعز المضادة للفأر الجسم المضاد IgG المقترن مع Alexa Fluor 647InvitrogenA21236أدمغة الذبابة المناعية
SlowFade كاشف الذهب المضاد للبهتانالمجسات الجزيئيةS36936جبل أدمغة الذباب وحماية التبريد من التألق   ؛
PYREX 9 لوحة بقعة زجاجية للاكتئابCorning7220-85تشريح وشطف وغسل ومناعة أدمغة ذبابة
Sylgard 184الدقة العالميةSYLG184اصنع أطباق Sylgard السوداء لحماية الملقط أثناء تشريح الدماغ
الفحم المنشطSigma-Aldrich242276-250Gاصنع أطباق Sylgard السوداء
Dumont # 5ملقط العلوم الدقيقة أدوات11252-30تشريح وتركيب أدمغة الذبابة الشريحة
الصغيرةCorning2948-75x25جبل ذبابة الدماغ
الغطاء الصغير رقم 1.5VWR International48366-205جبل أدمغة الذبابة
طلاء الأظافرالبائع المحليغير متوفرختم زجاج الغطاء الصغير على الشرائح الصغيرة
حاضنة  Kansin InstrumentsLTI603عند 25 درجة ؛ C
(أو بائعين آخرون)
حمام مائيKansin InstrumentsWB212-B2إحداث صدمة حرارية في الذباب عند 37 درجة ؛ C
(أو بائعين آخرين)
شاكر مداريKansin InstrumentsOS701غسل أدمغة ذبابة
البقع المناعية (أو بائعين آخرين) مجهر
تشريحLeicaEZ4فرز الذباب وصلبه ونقله ؛ تشريح وشطف وغسل ومناعة أدمغة ذبابة
مجهر متحد البؤرZeiss (أو بائعين آخرين)LSM 700 (أو نماذج أخرى)صورة tsMARCM استنساخ
برنامج معالجة الصور 1
(e.g.< / em> ، متصفح الصور Zeiss LSM)  		Zeissغير متوفرProject stacks of images
confocal image-processing software 2
(e.g., ImageJ) 		غير متوفرغير متوفرعدد خلايا نسخ tsMARCM
أدمغة ذبابة البقع المناعية أدوات زجاج تطير ثقافة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ito, M., Masuda, N., Shinomiya, K., Endo, K., Ito, K. Systematic analysis of neural projections reveals clonal composition of the Drosophila brain. Curr Biol. 23 (8), 644-655 (2013).
  2. Yu, H. H., et al. Clonal development and organization of the adult Drosophila central brain. Curr Biol. 23 (8), 633-643 (2013).
  3. Goodman, C. S., Doe, C. Q. The Development of Drosophila melanogaster. Bate, M., Arias, A. M. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1993).
  4. Lee, T., Luo, L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).
  5. Lee, T., Lee, A., Luo, L. Development of the Drosophila mushroom bodies: sequential generation of three distinct types of neurons from a neuroblast. Development. 126 (18), 4065-4076 (1999).
  6. Lee, T., Marticke, S., Sung, C., Robinow, S., Luo, L. Cell-autonomous requirement of the USP/EcR-B ecdysone receptor for mushroom body neuronal remodeling in Drosophila. Neuron. 28 (3), 807-818 (2000).
  7. Chiang, A. S., et al. Three-dimensional reconstruction of brain-wide wiring networks in Drosophila at single-cell resolution. Curr Biol. 21 (1), 1-11 (2011).
  8. Jefferis, G. S., Marin, E. C., Stocker, R. F., Luo, L. Target neuron prespecification in the olfactory map of Drosophila. Nature. 414 (6860), 204-208 (2001).
  9. Hong, W., Luo, L. Genetic control of wiring specificity in the fly olfactory system. Genetics. 196 (1), 17-29 (2014).
  10. Zhu, S., et al. Gradients of the Drosophila Chinmo BTB-zinc finger protein govern neuronal temporal identity. Cell. 127 (2), 409-422 (2006).
  11. Yu, H. H., Chen, C. H., Shi, L., Huang, Y., Lee, T. Twin-spot MARCM to reveal the developmental origin and identity of neurons. Nat Neurosci. 12 (7), 947-953 (2009).
  12. Yu, H. H., et al. A complete developmental sequence of a Drosophila neuronal lineage as revealed by twin-spot MARCM. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
  13. Greenspan, R. J. Fly pushing : the theory and practice of Drosophila genetics. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  14. Awasaki, T., et al. Making Drosophila lineage-restricted drivers via patterned recombination in neuroblasts. Nat Neurosci. 17 (4), 631-637 (2014).
  15. Lee, T. Generating mosaics for lineage analysis in flies. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 3 (1), 69-81 (2014).
  16. Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat Protoc. 1 (4), 2110-2115 (2006).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Lin, S., Kao, C. F., Yu, H. H., Huang, Y., Lee, T. Lineage analysis of Drosophila lateral antennal lobe neurons reveals notch-dependent binary temporal fate decisions. PLoS Biol. 10 (11), e1001425(2012).
  19. Zhan, X. L., et al. Analysis of Dscam diversity in regulating axon guidance in Drosophila mushroom bodies. Neuron. 43 (5), 673-686 (2004).
  20. Griffin, R., et al. The twin spot generator for differential Drosophila lineage analysis. Nat Methods. 6 (8), 600-602 (2009).
  21. Potter, C. J., Tasic, B., Russler, E. V., Liang, L., Luo, L. The Q system: a repressible binary system for transgene expression, lineage tracing, and mosaic analysis. Cell. 141 (3), 536-548 (2010).
  22. Lai, S. L., Lee, T. Genetic mosaic with dual binary transcriptional systems in Drosophila. Nat Neurosci. 9 (5), 703-709 (2006).
  23. Kao, C. F., Yu, H. H., He, Y., Kao, J. C., Lee, T. Hierarchical deployment of factors regulating temporal fate in a diverse neuronal lineage of the Drosophila central brain. Neuron. 73 (4), 677-684 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة