ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان البولي أجهزة ميكروفلويديك لخلية دراسات الهجرة تحت عمودي الكيميائية والتدرجات الأوكسجين

Hung-Ju Chiang; Sih-Ling Yeh; Chien-Chung Peng; Wei-Hao Liao; Yi-Chung Tung

doi:10.3791/55292

Method Article

ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان البولي أجهزة ميكروفلويديك لخلية دراسات الهجرة تحت عمودي الكيميائية والتدرجات الأوكسجين

DOI:

10.3791/55292

⸱

February 23rd, 2017

Hung-Ju Chiang¹ , Sih-Ling Yeh¹ , Chien-Chung Peng¹ , Wei-Hao Liao¹ , Yi-Chung Tung¹

¹Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعد التحكم في التدرجات الكيميائية والأكسجين أمرا ضروريا لمزارع الخلايا. تشير هذه الورقة إلى جهاز موائع دقيقة بولي ثنائي ميثيل سيلوكسان بولي كربونات (PDMS-PC) قادر على توليد مجموعات موثوقة من التدرجات الكيميائية والأكسجين لدراسات هجرة الخلايا ، والتي يمكن استخدامها عمليا في المختبرات البيولوجية بدون أجهزة متطورة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقارير هذه الورقة جهاز ميكروفلويديك مصنوعة من ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) مع البولي جزءا لا يتجزأ من (PC) رقيقة لدراسة الهجرة الخلية تحت مجموعات من التدرجات الكيميائية والأكسجين. ويمكن لكل من التدرجات الكيميائية والأكسجين تؤثر بشكل كبير الهجرة خلية في الجسم الحي. ومع ذلك، بسبب القيود التقنية، وقد تم تنفيذ القليل جدا من البحوث لتحقيق آثارها في المختبر. الجهاز المتقدمة في هذا البحث يستفيد من مجموعة من القنوات على شكل اعوج لتوليد التدرجات الكيميائية المطلوبة ويستغل طريقة التفاعل الكيميائي تقتصر مكانيا لتوليد الأوكسجين التدرج. توجيهات التدرجات الكيميائية والأكسجين هي متعامدة مع بعضها البعض لتمكين واضحة تفسير نتيجة الهجرة. من أجل توليد بكفاءة التدرجات الأوكسجين مع استهلاك المواد الكيميائية الحد الأدنى، ويستخدم جهاز الكمبيوتر رقيقة جزءا لا يتجزأ من كحاجز نشر الغاز. الجهاز ميكروفلويديك المتقدمةيمكن أن يفجرها مضخات المحاقن وضعها في حاضنة الخلية التقليدية خلال التجارب الهجرة الخلية للسماح لتبسيط الإعداد والظروف زراعة الخلايا الأمثل. في تجارب الخلايا، استخدمنا جهاز لدراسة الهجرات من خلايا adenocarcinomic الإنسان السنخية القاعدية الظهارية، A549، تحت مجموعات من chemokine (اللحمية عامل المشتقة من خلية، SDF-1α) والتدرجات الأوكسجين. وتظهر النتائج التجريبية أن الجهاز يمكن أن تولد ثابت عمودي chemokine والأكسجين التدرجات ومتوافق مع الخلايا. وتشير نتائج الدراسة الهجرة التي التدرجات الأوكسجين قد تلعب دورا أساسيا في توجيه الهجرة الخلية، والسلوك الخلوي تحت مجموعات من التدرجات لا يمكن التنبؤ بها من هم دون التدرجات واحدة. ويوفر الجهاز أداة قوية وعملية للباحثين لدراسة التفاعلات بين التدرجات الكيميائية والأكسجين في زراعة الخلايا، التي يمكن أن تعزز أفضل دراسات الهجرة خلية في أكثر في الجسم الحي تشبه microenvironments.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التوزيع المكاني من العوامل القابلة للذوبان وتوتر الأوكسجين يمكن تنظيم عدد من الوظائف الخلوية الهامة في الجسم الحي ^{^1،} ^{^2،} ^{^3،} ^4. من أجل تحقيق أفضل تأثير على الخلايا في المختبر خلية ثقافة منصة قادرة على توليد ثابت التدرجات الكيميائية والأكسجين هو المطلوب للغاية. العوامل القابلة للذوبان مختلفة تلعب دورا رئيسيا في الأنشطة البيولوجية وتؤثر على سلوك الخلوية. في الآونة الأخيرة، ويرجع ذلك إلى النهوض تقنيات الموائع الدقيقة، وقد تم وضع عدد من الأجهزة ميكروفلويديك قادرة على توليد ثابت التدرجات الكيميائية لدراسة الخلية الهجرة ^5. وعلاوة على ذلك، فقد كشفت العديد من الدراسات أيضا على ضرورة توتر الأوكسجين للثقافات في المختبر خلية ^{^6،} ^{^7،} ^8. ومع ذلك،السيطرة على التوتر الأكسجين لزراعة الخلايا يعتمد بشكل رئيسي على إضافة المواد الكيميائية مباشرة لالكسح الأكسجين أو خلية حاضنات مع اسطوانات الغاز المضغوط. بالإضافة الكيميائية المباشرة يغير مستنبت الخلية وتؤثر على الاستجابات الخلوية. تتطلب حاضنات مراقبة الأكسجين تصميم خاص حاضنة ودقيقة تحكم تدفق الغاز، وكمية كبيرة من غاز النيتروجين من أجل تحقيق شروط نقص الأكسجة. وعلاوة على ذلك، أصبح في حكم المستحيل للسيطرة على التوزيع المكاني للأكسجين باستخدام هذا الإعداد، الذي يؤخر دراسة سلوك الخلوية في إطار مختلف التوترات الأكسجين والتدرجات. للتغلب على هذه القيود، فقد تم وضع عدد من الأجهزة ميكروفلويديك لتوليد التدرجات الأوكسجين لتطبيقات زراعة الخلايا ^9. ومع ذلك، ومعظمهم من يتم تشغيلها باستخدام الغازات المضغوطة، والتي قد تتسبب في تبخر وتوليد فقاعة المشاكل. ولذلك، فإنها غالبا ما تتطلب أجهزة متطورة وقد لا تكون موثوقة على المدى الطويل الى الدراسات زراعة الخلاياالصورة.

للتغلب على التحديات ومواصلة دراسة التفاعلات بين التدرجات الكيميائية والأكسجين للهجرة الخلايا، قمنا بتطوير جهاز ثقافة الخلية ميكروفلويديك مصنوعة من ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) مع البولي جزءا لا يتجزأ من (PC) رقيقة فيلم ^10. ويتكون الجهاز من طبقتين قناة ميكروفلويديك مفصولة الغشاء PDMS. الطبقة العليا هي طبقة PDMS-PC لتوليد الأوكسجين التدرج. تتكون طبقة السفلية من PDMS لتوليد التدرج الكيميائي وزراعة الخلايا. الجهاز يمكن أن تولد في وقت واحد عمودي التدرجات الكيميائية والأكسجين دون استخدام اسطوانات الغاز وأنظمة متطورة التحكم في التدفق. في الجهاز، يوفر PDMS بشفافية كبيرة البصرية، نفاذية الغاز، والتوافق البيولوجي للثقافة الخلية والتصوير. يقدم الفيلم الكمبيوتر جزءا لا يتجزأ من كحاجز نشر الغاز عن كفاءة السيطرة توتر الأوكسجين. في قناة ميكروفلويديك، كنا مجموعة من القنوات على شكل اعوجالصورة لتوليد التدرجات الكيميائية. وقد استغل تصميم على نطاق واسع لتوليد التدرجات الكيميائية في أجهزة ميكروفلويديك لمختلف التطبيقات نظرا لموثوقيتها والإعداد التجريبية سهلا. وعلاوة على ذلك، لمحات التدرج الكيميائية يمكن أن تصمم من خلال تغيير هندستها قناة مسبقا مع المحاكاة العددية. لتوليد التدرج الأوكسجين، اتخذنا الاستفادة من طريقة التفاعل الكيميائي تقتصر مكانيا التي وضعت سابقا في مختبرنا ¹⁰ ^و ¹¹ ^و ^12. الأكسجين يمكن بكسح من مناطق معينة دون تطهير النيتروجين. للاستخدام العملي في المختبرات البيولوجية، والإعداد التجريبية كامل متوافق مع حاضنات ثقافة الخلية التقليدية. من خلال دمج هذه الأساليب، ونحن يمكن أن تولد في نفس الوقت مستقرة التدرجات الكيميائية والأكسجين بدون اسطوانات الغاز بكميات كبيرة وأجهزة متطورة لدراسة الهجرة الخلية.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصنيع الجهاز ميكروفلويديك

ملاحظة: يتم ملفقة الجهاز ميكروفلويديك بأكمله باستخدام لينة الطباعة الحجرية نسخة عملية صب ^13.

تصنيع قوالب للطبقات PDMS في الجهاز ميكروفلويديك
1. تصميم أنماط قناة ميكروفلويديك باستخدام التوضيح المتاحة تجاريا أو برامج الرسم. إرسال ملف إلى شركة عالية الدقة الشفافية الضوئية الرئيسية طباعة ^14.
2. رقائق السيليكون نظيفة مع الأسيتون (≥99.5٪)، ايزوبروبيل (IPA؛ ≥99.9٪)، ومخزنة حفر أكسيد (البنك المركزي البريطاني؛ 6: 1 NH ₄ F.HF). شطف مع الماء (DI) منزوع الأيونات ويذوى ويفر بمسدس النيتروجين.
3. معطف تدور تقريبي 20 غراما من مقاومة للضوء لهجة السلبية، SU-8 2050، على رقائق في 500 دورة في الدقيقة لمدة 15 ثانية ثم 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.
  ملاحظة: حالة تدور طلاء ينبغي أن تسفر SU-8 2050 صورمقاومة طبقات بسماكة حوالي 75 ميكرون على رقائق بعد الطباعة الحجرية الضوئية.
4. خبز لينة رقائق على 65 درجة مئوية موقد لمدة 3 دقائق، ثم في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 9 دقائق. بعد خبز لينة، وفضح الرقائق باستخدام اليجنر قناع مع أقنعة الشفافية مصممة تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. يجب أن يكون مجموع الطاقة تعرض حوالي 300 ميغا جول / سم ^2. خبز بعد التعرض (الجاهزة) رقائق عند 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ثم على درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
5. بعد الجاهزة، تزج رقائق في SU-8 المطور مع الانفعالات قوية أو في حمام بالموجات فوق الصوتية (37 كيلوهرتز و 180 W السلطة بالموجات فوق الصوتية فعالة) لمدة 7 دقائق. شطف الرقاقة مع الأسيتون وIPA لإزالة المتبقي SU-8.
6. وضع رقاقة و 100 ميكرولتر من سيلاني (1H، 1H، 2H، 2H-perfluorooctyltrichlorosilane) إلى 6 سم القطر طبق بيتري في مجفف على اتصال مع مضخة فراغ الحجاب الحاجز لرقاقة silanization سطح من أجل منع ارتباط غير مرغوب فيها. بدوره على مضخة لمدة 15 دقيقة، إيقاف تشغيلهوختم مجفف مع فراغ لمدة 30 دقيقة.
7. خذ رقائق silanized من المجفف والشريط لهم إلى 15 سم أطباق بتري قطر لعملية الطباعة الحجرية الناعمة التالية:
تصنيع وتجميع طبقات PDMS
1. إعداد PDMS قبل البوليمر
  1. مزيج PDMS مونومر (القاعدة) وكيل علاج في نسبة 10: 1 (ت / ت). ديغا الخليط في الإعداد المجفف لمدة 60 دقيقة.
2. تصنيع الطبقة العليا جزءا لا يتجزأ من جهاز الكمبيوتر
  1. نقل 2 غرام من PDMS قبل البوليمر داخل القالب مع أنماط قناة الموائعية أعلى طبقة لجعل طبقة رقيقة من PDMS. وضع القالب في الإعداد مجفف لديغا في PDMS لمدة 60 دقيقة.
  2. ضع بين عشية وضحاها العفن في 60 درجة مئوية الفرن لمدة PDMS علاج. تأكد من أن القالب هو على المستوى الأفقي.
  3. يبرد القالب لدرجة حرارة الغرفة. صب على 13 غرام إضافي من PDMS قبل البوليمر داخل القالب وديغا في PDMS في الالإعداد مجفف ه لمدة 60 دقيقة.
  4. تضمين ببطء سميكة فيلم PC 1 مم في طبقة PDMS جديدة كحاجز نشر الغاز. طرد أي فقاعات إذا لزم الأمر.
  5. وضع بين عشية وضحاها العفن في 60 ° C الفرن، والتأكد من أنه على المستوى الأفقي.
  6. تهدئة PDMS الشفاء إلى درجة حرارة الغرفة. قطع الجهاز مع مشرط لتبلغ مساحتها حوالي 5.5 × 5 سم ^2، والتي يمكن أن تغطي جميع أنماط القناة، وانزع بلاطة PDMS من القالب.
  7. لكمة ثقوب للمداخل ومنافذ باستخدام 2 مم القطر خزعة لكمة. تخزين أعلى طبقة PDMS-PC ملفقة بعيدا عن الغبار المحيط للتجميع في وقت لاحق.
3. تصنيع طبقة PDMS القاع
  1. صب 11 غرام من PDMS قبل البوليمر داخل القالب للطبقة السفلية. وضع القالب في مجفف لديغا في PDMS لمدة 60 دقيقة. حافظ على ليلة وضحاها القالب في الفرن C 60 درجة لعلاج PDMS. تأكد من أنه يكذب على المستوى الأفقي.
  2. تهدئة عشرالبريد PDMS إلى درجة حرارة الغرفة. قطع الجهاز لتبلغ مساحتها حوالي 5.5 × 5 سم ^2، والتي يمكن أن تغطي جميع أنماط القناة، وقشر تشغيله من العفن. تخزين طبقة PDMS أسفل ملفقة بعيدا عن الغبار المحيط للتجميع في وقت لاحق.
4. تصنيع غشاء PDMS
  1. معطف تدور تقريبي 4 غرام من PDMS قبل البوليمر على رقاقة فارغ silanized في 100 دورة في الدقيقة لمدة 90 ثانية ثم 3000 دورة في الدقيقة لمدة 4 ثانية. خبز الرقاقة المغلفة تدور في 60 درجة مئوية فرن بين عشية وضحاها.
5. تجميع الجهاز
  1. وضع ملفقة PDMS-PC الطبقة العليا ورقاقة مع الغشاء PDMS المغلفة تدور في O ₂ البلازما آلة المعالجة السطحية مع الأسطح الترابط مواجهة. علاج السطوح PDMS مع 90 واط من O ₂ البلازما لمدة 40 ثانية.
  2. السندات الطبقة العليا على الغشاء PDMS مباشرة بعد المعالجة السطحية البلازما O _2. وضع الوزن (حوالي 600 غرام) على رأس طبقات المستعبدين ووضعها في60 درجة مئوية خلال الليل الفرن إلى تعزيز الترابط.
  3. تهدئة طبقات المستعبدين لدرجة حرارة الغرفة وقطع غشاء المستعبدين من الطبقة العليا مع مشرط لتبلغ مساحتها حوالي 5.5 × 5 سم ^2، والتي يمكن أن تغطي جميع أنماط القناة. تقشر هيكل المستعبدين من رقاقة السيليكون ولكمة ثقوب في مداخل ومخرج القناة التدرج الكيميائية باستخدام ملم قطرها 2 خزعة لكمة.
  4. وضع الطبقة العليا المستعبدين الغشاء وPDMS ملفقة الطبقة السفلية في O ₂ البلازما آلة المعالجة السطحية، مع الأسطح الترابط مواجهة، لتفعيل السطوح PDMS باستخدام البلازما في 90 واط لمدة 40 ثانية.
  5. إرفاق الطبقات العليا والسفلى معا من أجل الترابط مباشرة بعد المعالجة السطحية. وضع الوزن (حوالي 600 غرام) على رأس الجهاز المستعبدين كامل ووضعها في الفرن 60 درجة مئوية خلال الليل.
  6. خذ جهاز ملفقة بالكامل من الفرن وتبرد إلى درجة حرارة الغرفة.

2. ميكروفلويديك الفحص الهجرة الخلية

ملاحظة: في هذه الورقة، ونحن نستخدم خط يشيع استخدامها الخلية، adenocarcinomic الإنسان السنخية الخلايا الظهارية القاعدية (A549)، وchemokine، عامل الخلايا اللحمية المشتقة (SDF-1α)، على سبيل المثال. لالباحثين العاملين في مجال الخلايا وكيموكينات أخرى، يرجى ضبط العمليات التجريبية وفقا لذلك.

اليوم 0: إعداد خلية
1. ثقافة المخزون من خلايا A549 في متوسط النمو الكامل تحتوي على DMEM F12-L الجلوتامين بديلا، و 10٪ (ت / ت) مصل بقري جنيني (FBS)، و 1٪ (ت / ت) حل antimicrob فطري. الثقافة الفرعية التي التفكك مع 0.25٪ التربسين-EDTA.
2. إعداد تعليق خلية للتجارب بواسطة الطرد المركزي الخلايا فصل في 140 x ج لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. للتجارب جهاز ميكروفلويديك، عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات والبذور لا يقل عن 1 × 10 ⁶ خلايا في قارورة T75 مع 10 مل من كاملمتوسطة النمو.
  ملاحظة: يتم تنفيذ كافة عمليات زراعة الخلايا في حاضنة مع 37 درجة مئوية و 5٪ CO ₂ الغلاف الجوي.
يوم 1: إعداد جهاز
1. وضع الجهاز في الجهاز البلازما O ₂ والتعامل معه O ₂ البلازما في 90 واط لمدة 40 ثانية لجعل قناة ميكروفلويديك السطوح المائية.
2. مباشرة بعد المعالجة السطحية، وتثبيت اثنين 14 G الإبر حادة عن طريق إدراج مباشرة الإبر في الثقوب قطرها 2 ملم لكمات في طبقة PDMS في مداخل قناة التدرج كيميائية. تأكد من أن الإبر لا تمنع القنوات ميكروفلويديك. رسم 0.8 مل من ده ₂ O باستخدام حقنة 1 مل مع حادة 14 G إبرة. حقن ده ₂ O في قناة التدرج كيميائية من المخرج حتى يتدفق الماء خارجا من كل من الإبر في مداخل.
3. إعداد 1 مل من محلول فبرونيكتين 50 ميكروغرام / مل عن طريق تمييع الأسهم فبرونيكتين مع Dulbecco & #39؛ ق الفوسفات مخزنة المالحة (DPBS).
4. يبث في حل فبرونيكتين من مخرج القناة التدرج الكيميائية باستخدام حقنة 1 مل مع حادة 14 G الإبرة حتى تتدفق الحل للخروج من كل الإبر في مداخل.
5. احتضان بين عشية وضحاها الجهاز بأكمله في حاضنة الثقافة الخلية التقليدية.
يوم 2: البذر الخلية والمجهري التصوير
1. بذر خلية
  1. نضح المتوسطة من الخلايا التي كانت تربيتها منذ اليوم 0 وغسل الخلايا مع 5 مل من DPBS 2 مرات. نضح DPBS، إضافة 2 مل من التربسين-EDTA، واحتضان الخلايا في الحاضنة لمدة 5 دقائق لفصل الخلايا من سطح القارورة.
  2. انتظر حتى يتم فصل الخلايا وعلقت في حل وإضافة 8 مل من المصل خالية المتوسطة (DMEM F12 + 1٪ (ت / ت) antimicrob مضاد فطري-حل) إلى القارورة. نقل كل من السائل في أنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي لذلك في 140 x ج لمدة 5 دقائق تحت درجة حرارة الغرفة.
  3. نضح طاف بعد الطرد المركزي، وإضافة كمية مناسبة من المصل خالية المتوسطة لجعل كثافة الخلية النهائية 1 × 10 ⁶ خلية / مل. إخراج الجهاز ميكروفلويديك أعد في يوم 1. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات أو التلقائي أداة العد خلية أخرى.
  4. حقن المصل خالية المتوسطة من مخرج القناة التدرج الكيميائية باستخدام حقنة 1 مل مع حادة 14 G الإبرة حتى يتدفق المتوسطة الخروج من كل من الإبر في مداخل. ضخ 200 ميكرولتر من تعليق خلية من مخرج القناة التدرج الكيميائية.
  5. مراقبة غرفة زراعة الخلايا في الجهاز تحت المجهر للتأكد من أن الخلايا قد أدخلت على قناة ميكروفلويديك. وضع الجهاز في وعاء الرطبة (على سبيل المثال، مربع من البلاستيك مع ده ₂ O في الداخل) وابقائه في حاضنة الثقافة خلية لمدة 5 ساعة إلى تعزيز التصاق الخلايا على سطح الجهاز.
2. إعداد reagالوالدان لتوليد التدرج كيميائية
  1. إعداد (SDF-1α) المادة الكيميائية في التركيز المطلوب (100 نانوغرام / مل) في المصل خالية المتوسطة. رسم المتوسط خالية من المصل مع وبدون الكيميائية إلى قسمين منفصلين 3 مل الحقن متصلة أنابيب عالية النقاء. إعداد الحقن على ضخ حقنة مع معدل التدفق من 1 ميكرولتر / دقيقة لاستخدامها لاحقا.
3. إعداد الكواشف لتوليد الأوكسجين التدرج
  1. جعل 15 مل من 1 حل M هيدروكسيد الصوديوم و 15 مل من 200 ملغ / مل بيروغالول حل. رسم هيدروكسيد الصوديوم والحلول بيروغالول إلى قسمين منفصلين 15 مل الحقن متصلة عالية النقاء أنابيب PTFE وأنابيب عالية النقاء، على التوالي. إعداد الحقن على ضخ حقنة مع معدل التدفق من 5 ميكرولتر / دقيقة لاستخدامها لاحقا.
4. إعداد الجهاز ميكروفلويديك
  1. بعد حضانة 5 ساعة، واتخاذ الجهاز بأكمله من وضعه على 15 سم القطر طبق بيتري. إصلاح الجهاز في طبق بيتري باستخدام المعجون اللاصق. نقلطبق بيتري لالمجهر تصوير الخلايا الحية في حاضنة.
  2. قم بتوصيل أنابيب من الحقن للجيل التدرج الكيميائية إلى مداخل للقناة التدرج كيميائية. قم بتوصيل منفذ لأنابيب مما يؤدي إلى خزان النفايات. بدوره على ضخ حقنة مع الحقن لتوليد التدرج الكيميائية.
  3. توصيل أنابيب عالية النقاء من الحقن التي تحتوي على هيدروكسيد الصوديوم وبيروغالول إلى مداخل القناة الأكسجين التدرج. ربط أنابيب إلى منفذ لجمع النفايات. بدوره على ضخ حقنة مع الحقن لتوليد الأوكسجين التدرج.
  4. إضافة حوالي 15 مل من ده ₂ O إلى طبق بيتري للحفاظ على جهاز رطب. إعداد الحية المجهر التصوير الخلية لالتقاط صورة ساقطا الوقت، وتأخذ صورة كل 15 دقيقة.
يوم 3: جمع وتحليل المعطيات
1. نقل ملفات الصور الملتقطة إلى الكمبيوتر. تحليل الصور باستخدام صورة مفتوحة المصدربرنامج alysis، يماغيج، مع المساعد مفتوحة المصدر لتتبع يدوي (https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/track.html) والبرمجيات أداة الكيميائي مجانا (http://ibidi.com/xtproducts / EN / البرمجيات وصورة-تحليل / يدوي-صورة-تحليل / الكيميائي و-الهجرة-أداة) ^{^15،} ^16.

3. توصيف التدرجات

ملاحظة: يمكن وصف التدرجات الكيميائية والأكسجين قبل أو بعد التجارب الخلية.

المحاكاة العددية التدرج كيميائية
1. تقدير طبيعة تدفق الصفحي من على microfluidics باستخدام ديناميات الموائعية الحسابية (CFD) المحاكاة.
توصيف التجريبية من التدرج الأوكسجين
1. إعداد صبغة حساسة للأكسجين الفلورسنت، تريس (2،2'-bipyridyl) الروثينيوم (III) هيدرات كلوريد، حل في الماء بتركيز 5ملغ / مل.
2. رسم محلول الصبغة الحساسة للأكسجين إلى قسمين منفصلين 3 مل الحقن متصلة أنابيب عالية النقاء. إعداد الحقن على ضخ حقنة مع معدل التدفق من 1 ميكرولتر / دقيقة (مماثلة لمعدلات تدفق المستخدمة في توليد التدرج الكيميائية).
3. قم بتوصيل أنابيب من الحقن إلى مداخل للقناة التدرج كيميائية. قم بتوصيل منفذ لأنابيب مما يؤدي إلى خزان النفايات. بدوره على ضخ حقنة مع الحقن لتوليد التدرج الكيميائية.
4. قياس كثافة مضان باستخدام المجهر مضان مقلوب مع ضوء الإثارة يمر 470 ± 20 مرشح بصري نانومتر. جمع ضوء الانبعاثات من خلال 515 نانومتر تصفية الانبعاثات تمريرة طويلة باستخدام كاميرا CCD باردة.
5. توصيل أنابيب عالية النقاء من الحقن التي تحتوي على هيدروكسيد الصوديوم وبيروغالول إلى مداخل القناة الأكسجين التدرج. ربط أنابيب إلى منفذ لجمع النفايات. بدوره على ضخ حقنة مع الحقن للأوكسجينجيل الانحدار.
6. جمع الصور مضان من صبغ حساس الأكسجين التي تتدفق في غرفة زراعة الخلايا.
7. وقف تدفق لتوليد الأوكسجين التدرج وقطع جميع أنابيب إلى قناة توليد الأوكسجين. ربط أنابيب عالية النقاء من اسطوانات الغاز للمخرج القناة الأكسجين التدرج.
8. جمع الصور مضان من صبغ حساس الأكسجين التي تتدفق في غرفة زراعة الخلايا عندما يتدفق الهواء والنيتروجين النقي، والأكسجين النقي في أنابيب متصلة قناة الأكسجين التدرج.
9. تقدير التدرجات الأوكسجين عن طريق تحليل الصور مضان باستخدام معادلة شتيرن، فولمر وفقا لمراجع 10 و 11.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملفقة PDMS-PC الهجين ميكروفلويديك جهاز زراعة الخلايا. تين. 1 يظهر صورة ومثال على الجهاز ميكروفلويديك. الطبقة السفلية تحتوي على أربعة مستويات من القنوات على شكل اعوج لإيجاد حلول من الكواشف عرض من اثنين من مداخل فصل مع ستة نسب خلط مختلفة. من الناحية النظرية، وستة نسب خلط مختلفة هي 1: 0، 4: 1، 3: 2، 2: 3، 1: 4، و0: 1 (إلى اليسار: الحق) بين اثنين من الحلول وعرض من مداخل. التدرجات الكيميائية التي شيدت من قبل ستة مختلف الحلول خلط نسبة يمكن أن تتولد في غرفة زراعة الخلايا، وتقع المصب. يتم فصل الطبقات العليا والسفلى بواسطة غشاء PDMS. في الطبقة العليا، وقدم الكاشف لالأكسجين رد فعل الكسح الكيميائية في قناة ميكروفلويديك من اثنين من مداخل منفصلة. يتم خلط المواد الكيميائية مع بعضها البعض للتفاعل على الفور قبل أن يصب على رأس غرفة زراعة الخلايا لمسح الأكسجين من القناة السفلي، من دون اتصال الكيميائية المباشر. الفيلم الكمبيوتر جزءا لا يتجزأ، مع معامل أصغر نشر الغاز مقارنة PDMS، بمثابة حاجز نشر أن يجعل الكسح الأكسجين بشكل أكثر كفاءة. الأكسجين ينتشر تدريجيا الى غرفة زراعة الخلايا من خلال PDMS في منطقة المصب لتشكيل التدرج الأكسجين على طول اتجاه التدفق. منذ يقتصر التفاعل الكيميائي الأكسجين الكسح مكانيا، تتأثر فقط التوترات الأكسجين المحلية. ونتيجة لذلك، يمكن استخدام الجهاز في حاضنة الخلية التقليدية دون تغيير التوتر على الأوكسجين العالمي. في تجارب الهجرة، هي المصنفة خلايا داخل غرفة زراعة الخلايا للمراقبة. وقدم متوسطة النمو والكواشف الكيميائية إلى الجهاز باستخدام مضخات المحاقن مع معدلات تدفق تسيطر على وجه التحديد.

توصيف التدرجات الكيميائية والأكسجين ولدت داخل الجهاز. بسبب ركان تدفق رقائقي طبيعة على microfluidics، يمكن توقع السلوكيات تدفق باستخدام ديناميات الموائعية الحسابية (CFD) المحاكاة. في هذه الورقة، ونحن شيدت نموذج 3D وإجراء محاكاة باستخدام البرمجيات المتاحة تجاريا multiphysics النمذجة. تين. 2 (أ) يبين مقارنة بين الشخصية تركيز فلوريسئين تتميز تجريبيا عبر عرض غرفة زراعة الخلايا استنادا إلى قياسات كثافة مضان ونتائج المحاكاة العددية. الاتفاق بين النتائج التجريبية والمحاكاة تشير إلى أن نموذج CFD يمكن أن يقدر جيدا التدرجات الكيميائية ولدت داخل الجهاز. تين. 2 (ب) يرسم محاكاة التدرج SDF-1α ولدت في غرفة زراعة الخلايا. تين. 3 يبين النتائج توصيف الأكسجين التدرج تتدفق الصبغة مضان حساس الأكسجين داخل غرفة زراعة الخلايا قبل التجارب الخلية. تشير النتيجة أن غرادي الأكسجينوالأنف والحنجرة، تتراوح ما بين 1-16٪، ويمكن أن تنشأ باستخدام بروتوكول المذكور.

نتائج الهجرة الخلية. كما مظاهرة، أجرينا A549 دراسات الهجرة الخلية أقل من 4 مجموعات من chemokine (SDF-1α) والتدرجات الأوكسجين: (1) لا chemokine ولا التدرجات الأكسجين كعنصر تحكم، (2) مع التدرج chemokine ودون التدرج الأوكسجين، (3) مع التدرج الأوكسجين ودون التدرج chemokine، و (4) مع كل chemokine والتدرجات الأوكسجين. تين. 4 يظهر في الصورة من الإعداد التجريبية بأكمله. وأجريت التجارب كلها في حاضنة الثقافة الخلية التقليدية مع الإعداد بأكمله (بما في ذلك أجهزة ميكروفلويديك، مضخات الحقنة، ويعيش المجاهر التصوير الخلية) وضعت في داخله. وأظهرت نتائج الهجرة الخلية في الشكل. 5. تين. 5 (أ) يدل على الصور التي تم جمعها خلال التجارب باستخدام الخلايا التصوير الحي آنا lyzer، والشكل. 5 (ب) و (ج) يرسم مسارات هجرة الخلايا ومتوسط الحركات تحت الأربعة مجموعات تحليلها بواسطة برنامج يماغيج مع الإضافات. وأظهرت النتائج أن متوسط المسافة الهجرة خلية في عنصر التحكم نهج الصفر، مما يشير إلى حركة عشوائية من الخلايا في التجربة. في المقابل، فقط مع التدرج chemokine، متوسط حركة الخلايا في جهة اليسار، حيث تركز قوات الدفاع الذاتى-1α أعلى. وتشير النتائج إلى أن السلوك الكيميائي SDF-1α الخلايا A549، التي تم الإبلاغ سابقا. في التجربة مع التدرجات الأكسجين فقط، ومتوسط حركة الخلايا هي الأعلى، حيث التوتر الأكسجين أقل. المثير للاهتمام أكثر، في التجربة مع عمودي chemokine والأكسجين التدرجات، متوسط حركة الخلايا هي صعودا ودون أي حركة واضحة في الاتجاه الأفقي (chemokine الاتجاه التدرج).

together.within الصفحات = "1"> figure-results-1
الشكل 1: ملفقة PDMS-PC جهاز ثقافة الخلية ميكروفلويديك. (أ) صورة التجريبية من الجهاز ملفقة قادرة على توليد موثوق عمودي التدرجات الكيميائية والأكسجين للدراسات الهجرة الخلية. يتم تعبئة قناة التدرج كيميائية مع الأصباغ الغذائية الأزرق والأصفر للتدليل على جيل التدرج داخل غرفة زراعة الخلايا. يتم تعبئة قناة التدرج الأوكسجين مع صبغة الطعام الأحمر. شريط المقياس هو 1 سم. (ب) التخطيطي للجهاز ميكروفلويديك. ملفقة الطبقة العليا باستخدام PDMS مع طبقة الكمبيوتر جزءا لا يتجزأ من كحاجز نشر الغاز عن كفاءة مراقبة الأكسجين التدرج داخل غرفة زراعة الخلايا. (ج) والقوالب الرئيسية لتصنيع الطبقات العلوية والسفلية. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: التدرج الكيميائية داخل الجهاز ثقافة الخلية ميكروفلويديك. (أ) محاكاة عدديا وتتميز تجريبيا فلوريسئين التدرج تركيز داخل غرفة زراعة الخلايا عبر عرض غرفة زراعة الخلايا (الاتجاه Y). التشابه بين التدرجات محاكاة وقياس تجريبيا يشير إلى أن محاكاة يمكن التنبؤ بشكل جيد التدرج الكيميائية. يظهر أقحم الرقم ثلاثي الأبعاد نموذج (3D) التي شيدت لمحاكاة. (ب) المحاكاة العددية نتيجة chemokine التدرج SDF-1α عبر عرض غرفة زراعة الخلايا للدراسات الهجرة الخلية. الرجاء انقر هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل (3): الأوكسجين التدرج داخل الجهاز ثقافة الخلية ميكروفلويديك. تقاس تجريبيا التدرجات الأوكسجين داخل غرفة زراعة الخلايا على طول اتجاه التدفق. وقدرت التدرجات باستخدام صبغ مضان الحساسة للأكسجين وتحليل الصور. التدرجات، من اليسار إلى اليمين من الغرفة، وتتميز، والنتائج تظهر ملامح التدرج متسقة عبر عرض الغرفة.

figure-results-4
الشكل 4: صور من الإعداد التجريبية. الإعداد بأكمله، بما في ذلك أجهزة ميكروفلويديك، مضخات الحقنة، ويعيش المجهر التصوير الخلية، يتم وضعها داخل حاضنة زراعة الخلايا التقليدية للالأمثلشروط زراعة الخلايا خلال التجارب. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الرقم 5: الهجرة خلية نتائج الدراسة تحت عمودي SDF-1α والأكسجين التدرجات. (أ) الصور الملتقطة قبل وبعد دراسة الهجرة الخلية 12 ساعة. ويمكن تحليل مسارات هجرة الخلايا من الصور، ساقطا الوقت استولت باستخدام الحية المجهر التصوير الخلية. (ب) مسارات هجرة الخلايا وتحليلها متوسط حركة الهجرة من الصور التي تم التقاطها تحت 4 مجموعات مختلفة التدرج: لا الانحدار، فقط chemokine التدرج، إلا التدرج الأوكسجين، وكلا chemokine والأكسجين التدرجات. تم القبض على الصور كل 15 دقيقة. شريط المقياس هو 250 ميكرون. (ج) قطع من متوسط المسافات هجرة الخلايا في عمودي (التدرج الأوكسجين) والأفقي (chemokine التدرج) الاتجاهات تحت أربع مجموعات التدرج مختلفة. يتم التعبير عن البيانات كمتوسط ± SD، تم الحصول عليها من ثلاث مجموعات تجريبية مستقلة، وتم تحليل 10 خلايا في كل تجربة. وعينت مختلفة إلى حد كبير (اختبار t أونبايريد الطالب، ف <0.01) النتائج الإحصائية التي كتبها أحرف مختلفة (أ و ب). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخطوات الأكثر أهمية لافتعال PDMS الجهاز ميكروفلويديك مع طبقة رقيقة الكمبيوتر جزءا لا يتجزأ هي: (1) طرد جميع الفقاعات عند إدراج فيلم الكمبيوتر في PDMS قبل البوليمر في حين افتعال طبقة PDMS-PC أعلى و(2) التأكد من يتم تنفيذ جميع العمليات PDMS علاج على مستوى أفقي وجهت جيدا. للتجارب الهجرة الخلية، وأهم الخطوات هي: (1) القضاء على فقاعات داخل الجهاز ميكروفلويديك والأنابيب، ومضخات حقنة خلال التجارب، (2) التأكد من أن الجهاز ميكروفلويديك يتم وضعها على مستوى أفقي وجهت جيدا خلال تصوير الخلايا الحية لمراقبة الهجرة الخلية؛ و (3) الحفاظ على جهاز رطب بإضافة ده ₂ O إلى طبق بتري خلال التجارب، والتأكد من أن المياه لا جفت.

من أجل افتعال الجهاز ميكروفلويديك PDMS-PC الهجين بنجاح دون التبطين، فمن الأهمية بمكان لإزالة جميع فقاعات أثناء فاي PCLM الإدراج. الفيلم الكمبيوتر يمكن إدراجها ببطء من زاوية (حوالي 15 إلى 30 درجة بعيدا عن PDMS سطح قبل البوليمر) لمنع توليد فقاعات خلال ادراج الفيلم الكمبيوتر في PDMS قبل البوليمر. إذا لزم الأمر، وPDMS كامل قبل البوليمر مع الفيلم الكمبيوتر جزءا لا يتجزأ من يمكن وضعها في مجفف متصلة مضخة فراغ لمدة 10 دقيقة لطرد فقاعات المحاصرين. إذا كان الفيلم الكمبيوتر يطفو تصل بعد عملية فراغ، وهي غيض ماصة يمكن استخدامها للضغط على فيلم جهاز الكمبيوتر إلى أسفل على طبقة PDMS الشفاء. تكرار عمليات الفراغ واضغط إذا لزم الأمر.

للتجارب الخليوي، وعدم وجود فقاعات الهواء أمر بالغ الأهمية للثقافة الخلية ميكروفلويديك. تأكد من أن يتم إدخال أي فقاعات الهواء إلى الإعداد ميكروفلويديك بأكمله (بما في ذلك مضخات المحاقن، وأنابيب، والجهاز ميكروفلويديك) عندما جعل الاتصالات. إذا تم إنشاء فقاعات الهواء داخل الإعداد ميكروفلويديك نتيجة لانخفاض الذوبان الغاز تحت درجة حرارة مرتفعة للبةriments داخل الحاضنة، جميع مكونات التجريبية (بما في ذلك الحقن والأنابيب) والكواشف (بما في ذلك متوسط النمو، بيروغالول، وهيدروكسيد الصوديوم) يمكن وضعها في حاضنة مسبقا (على الأقل 20 دقيقة قبل الاستخدام) لتقليل التباين في درجة الحرارة . مضخات حقنة كثيرا ما تولد الحرارة من تشغيل المحركات داخل المضخات. فمن المقبول عادة لتشغيل مضخات حقنة داخل الحاضنات. ومع ذلك، لا تحقق درجة حرارة الحاضنة خلال التجارب. إذا ترفع درجة الحرارة خلال التجارب، تحتاج إلى أن تتم إجراءات تبريد إضافية. عدة طرق التبريد مجدية يمكن استخدامها، مثل وضع مربع من الجليد في الحاضنة، والحد من عدد من مضخات المحاقن وضعت داخل الحاضنة، أو استخدام حاضنة مع نظام تبريد قوة.

الجهاز ثقافة الخلية ميكروفلويديك PDMS-PC وضعت في هذه الورقة هو قادر على توليد موثوق عمودي التدرجات الكيميائية والأكسجين FOص دراسات الهجرة الخلية. الحد من الجهاز المتقدمة هو أن ملامح الأكسجين التدرج الناتجة تعتمد على التوازن بين تدفق الأكسجين، مدفوعا الكسح تفاعل كيميائي، وانتشار الأوكسجين من الغلاف الجوي المحيط، من خلال الجهاز، وفي المتوسط. ونتيجة لذلك، لمحات الأكسجين التدرج لا يمكن السيطرة عليها بشكل تعسفي داخل الجهاز. بالمقارنة مع منصات ثقافة الخلية ميكروفلويديك القائمة، وجهاز وضعت في هذه الورقة هو أول واحد قادر على إجراء دراسات ثقافة الخلية تحت مجموعات من التدرجات الكيميائية والأكسجين. يمكن أن تكون ملفقة الجهاز بأكمله باستخدام الناعمة عملية صب الطباعة الحجرية نسخة التقليدية، دون محاذاة شاقة والأجهزة باهظة الثمن. التدرجات يمكن محاكاة عدديا وتتميز تجريبيا لتوفير ظروف تشبه المكروية أكثر الفسيولوجية لفي الدراسات المختبرية الخلية. باستخدام تقتصر مكانيا طريقة تفاعل كيميائي مع فيلم PC باعتباره دي الغازحاجز ffusion، يمكن أن تتولد التدرج الأوكسجين دون استخدام اسطوانات الغاز المضغوط السيطرة على وحدات تدفق الغاز المتطورة. وبالإضافة إلى ذلك، والإعداد يتطلب كميات صغيرة فقط من المواد الكيميائية (أقل من 10 مل لكل يوم) للحفاظ على التدرجات الأوكسجين. منذ يقتصر على مراقبة توتر الأوكسجين محليا حول قناة ميكروفلويديك، ولن يؤثر على تركيز الأكسجين المحيطة، والإعداد كله يمكن وضعها داخل حاضنة زراعة الخلايا التقليدية، دون مزيد من الحرارة والرطوبة وثاني أكسيد الكربون ₂ أجهزة التحكم. ونتيجة لذلك، فإن الجهاز المتقدمة لديها امكانات كبيرة لاستخدامها عمليا في مختبرات بيولوجية.

بسبب القيود التقنية، ونادرا ما تمت دراسة السلوكيات الخلوية تحت التوتر الأكسجين في الأدبيات الموجودة. مع مساعدة من الجهاز وضعت في هذه الورقة، وزراعة الخلايا تحت التدرجات الأوكسجين لا يمكن أن يؤديها بطريقة سطحية أن يعزز إلى حد كبير دراسات الخلايا تحت التدرجات الأوكسجين. Furthermore، يمكن تطبيق مبدأ عملية مشابهة لتوليد التدرجات الغازية ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية الأخرى، مثل ثاني أكسيد الكربون وأكسيد النيتريك، للثقافة في المختبر خلية دراسات ^17. وتظهر هذه القدرات أن PDMS-PC جهاز ميكروفلويديك يظهر إمكانات كبيرة لمختلف التطبيقات زراعة الخلايا، بما في ذلك اختبار المخدرات وتكاثر الخلايا والمقايسات الهجرة، للمضي قدما في دراسات زراعة الخلايا في المختبر.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تستند هذه الورقة إلى العمل المدعوم من قبل معاهد البحوث الصحية الوطنية (NHRI) في تايوان في إطار منحة البحث المبتكر (IRG) (EX105-10523EI) ، ووزارة العلوم والتكنولوجيا التايوانية (MOST 103-2221-E-001-001-MY2 ، 104-2221-E-001-015-MY3 ، 105-2221-E-001-002-MY2) ، والمشروع المواضيعي Academia Sinica (AS-105-TP-A06) ، وبرنامج البحث في علوم النانو وتكنولوجيا النانو. يود المؤلفون أن يشكروا السيدة راشيل أ. لوكاس على تدقيق المخطوطة.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
1 مل حقنة	بيكتون ديكنسون ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي	302104
1.5 مل أنبوب طرد مركزي	دقيق Smartgene	6011-000
10 مل حقنة	بيكتون ديكنسون ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي	302151
15 مل أنبوب الطرد المركزي	ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA	Falcon 352096
150 مم طبق بتري	Dogger Science	DP-43151
1H ، 1H ، 2H ، 2H-Perfluorooctyltrichlorosilane	Alfa Aesar ، وارد هيل ، MA	78560-45-9
3 مل حقنة	بيكتون ديكنسون ، فرانكلين ليكس ، نيوجيرسي	302118
4 بوصات رقاقة دمية من السيليكون	Wollemi Technical ، Taoyuan ، تايوان
Acetone	ECHO Chemical ، Miaoli ، تايوان	AH3102-000000-72EC
AG تقويم قناع مزدوج التعرض	M & R Nano Technology ، Taoyuan ، تايوان	AG500-4D-D-V-S-H
محلول مضاد للمضادات الحيوية ومضاد للعضل	ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA	GIBCO 15240-062
خزعة لكمة	Miltex ، Plainsboro ، NJ	33-31
إبرة حادة	JensenGlobal ، سانتا باربرا ، CA	Gauge 14
مقياس كثافة الدم ذو الخط الساطع	Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، ميزوري	Z359629	لعد الخلايا
حفر الأكسيد المخزن	ECHO Chemical ، Miaoli ، تايوان	PH3101-000000-72EC
حاضنة ثقافة الخلايا	Caron ، Marietta ، OH	6016-1
COMSOL Multiphysics	COMSOL ، Burlington ، MA	الإصدار 4.3b	للمحاكاة العددية للتدرجات الكيميائية في الجهاز
D-PBS	ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA	GIBCO 14190-144
Desicattor	A-VAC Industries ، أنهايم ، كاليفورنيا	35.10001.01
DMEM / F12 + GlutaMax-1	ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA	GIBCO 10565-018
مصل الأبقار الجنيني	ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA	GIBCO 10082
Fibronectin من البلازما البشرية	Sigma-Aldrich ، سانت لويس ، MO	F2006
مقلوب مجهر مضان	Leica Microsystems ، Wetzlar ، ألمانيا	DMIL LED
كحول الأيزوبروبيل (IPA)	ECHO الكيميائية ، ميالي ، تايوان	CMOS112-00000-72EC
JuLi Smart Fluorescence Cell Imager	NanoEnTek ، سيول ، كوريا	DBJ01B
فرن المؤتمرات الميكانيكية	ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA	Lindberg Blue M MO1450C
NaOH	شوا للصناعة الكيميائية ، طوكيو ، اليابان	1943-0150
نظام البلازما	نوردسون مارس ، كونكورد CA	PX-250	للمعالجة السطحية لبلازما الأكسجين
البولي كربونات (PC)	تقنيات شعاع الكم ، تاينان تايوان
بولي ديميتيل سيلوكسان (PDMS)	داو كورنينج ، ميدلاند ، ميشيغان	سيلجارد 184
بيروجالول	ألفا إيسار ، وارد هيل ، MA	A13405
معجون لاصق قابل للإزالة	3M	860
Sorvall Legend Mach 1.6R جهاز طرد مركزي منضدي	ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA
Spin Coater	ELS Technology ، Hsinchu ، تايوان	ELS 306MA
SU-8 2050	MicroChem ، ويستبورو ، ماساتشوستس	SU-8 2050
SU-8 مطور	MicroChem ، ويستبورو ، ماساتشوستس	Y020100
ريشة الشفرة الجراحية	، أوساكا ، اليابان	5005093	لقطع PDMS
مضخة حقنة	Chemyx ، هيوستن ، تكساس	فيوجن 400
T75 قارورة ثقافة الخلايا	ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA	Nunc 156367
Trypan Blue Solution ، 0.4٪	ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA	15250061
Trypsin-EDTA	ThermoFisher Scientific ، Waltham ، MA	GIBCO 25200
Tygon PTFE Tubing	Saint-Gobain Performance Plastics ، Akron ، OH
Tygon Tubing	Saint-Gobain Performance Plastics ، أكرون ، أوهايو	621

فيلم

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Engineering graded tissue interfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (34), 12170-12175 (2008).">Phillips, J. E., Burns, K. L., Le Doux, J. M., Guldberg, R. E., García, A. J. Engineering graded tissue interfaces. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105 (34), 12170-12175 (2008).
The signaling mechanisms underlying polarity and chemotaxis. Cold Spring Harb. Perspect Biol. 1 (4), 1-16 (2009).">Wang, F. The signaling mechanisms underlying polarity and chemotaxis. Cold Spring Harb. Perspect Biol. 1 (4), 1-16 (2009).
Oxygen generating scaffolds for enhancing engineering tissue survival. Biomaterials. 30 (5), 757-762 (2009).">Oh, S. H., Ward, C. L., Atala, A., Yoo, J. J., Harrison, B. S. Oxygen generating scaffolds for enhancing engineering tissue survival. Biomaterials. 30 (5), 757-762 (2009).
Influence of the oxygen microenvironment on the proangiogenic potential of human endothelial colony forming cells. Angiogenesis. 12, 303-311 (2009).">Decaris, M. L., Lee, C. I., Yoder, M. C., Tarantal, A. F., Leach, J. K. Influence of the oxygen microenvironment on the proangiogenic potential of human endothelial colony forming cells. Angiogenesis. 12, 303-311 (2009).
Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5 (4), 401-406 (2005).">Chung, B. G., et al. Human neural stem cell growth and differentiation in a gradient-generating microfluidic device. Lab Chip. 5 (4), 401-406 (2005).
Hypoxia - a key regulatory factor in tumor growth. Nat. Rev. Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).">Harris, A. L. Hypoxia - a key regulatory factor in tumor growth. Nat. Rev. Cancer. 2 (1), 38-47 (2002).
Formation of steady-state oxygen gradients in vitro: application to liver zonation. Biotechnol. Bioeng. 82 (3), 253-262 (2003).">Allen, J. W., Bhatia, S. N. Formation of steady-state oxygen gradients in vitro: application to liver zonation. Biotechnol. Bioeng. 82 (3), 253-262 (2003).
Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro. Mol. Cancer Res. 7 (4), 489-497 (2009).">McCord, A. M., Jamal, M., Shankavaram, U. T., Lang, F. F., Camphausen, K., Tofilon, P. J. Physiologic oxygen concentration enhances the stem-like properties of CD133+ human glioblastoma cells in vitro. Mol. Cancer Res. 7 (4), 489-497 (2009).
Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10 (18), 2394-2401 (2010).">Lo, J. F., Sinkala, E., Eddington, D. T. Oxygen gradients for open well cellular cultures via microfluidic substrates. Lab Chip. 10 (18), 2394-2401 (2010).
A polydimethylsiloxane-polycarbonate hybrid microfluidic device capable of generating perpendicular chemical and oxygen gradients for cell culture studies. Lab Chip. 14 (19), 3762-3772 (2014).">Chang, C. W., et al. A polydimethylsiloxane-polycarbonate hybrid microfluidic device capable of generating perpendicular chemical and oxygen gradients for cell culture studies. Lab Chip. 14 (19), 3762-3772 (2014).
Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11 (21), 3626-3633 (2011).">Chen, Y. A., et al. Generation of oxygen gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially confined chemical reactions. Lab Chip. 11 (21), 3626-3633 (2011).
A microfluidic cell culture array with various oxygen tensions. Lab Chip. 13 (16), 3239-3245 (2013).">Peng, C. C., Liao, W. H., Chen, Y. H., Wu, C. Y., Tung, Y. C. A microfluidic cell culture array with various oxygen tensions. Lab Chip. 13 (16), 3239-3245 (2013).
Soft Lithography. Ann. Rev. Mate. Sci. 28, 153-184 (1998).">Xia, Y., Whitesides, G. M. Soft Lithography. Ann. Rev. Mate. Sci. 28, 153-184 (1998).
Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502(2010).">Friend, J., Yeo, L. Fabrication of microfluidic devices using polydimethylsiloxane. Biomicrofluidics. 4 (2), 026502(2010).
Manual Tracking. , Institute Curie. Orsay, France. https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf (2005).">Cordelières, F. P. Manual Tracking. , Institute Curie. Orsay, France. https://imagej.nih.gov/ij/plugins/track/Manual%20Tracking%20plugin.pdf (2005).
Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0. , ibidi GmbH. Martinsried, Germany. http://ibidi.com/fileadmin/products/software/chemotaxis_tool/IN_XXXXX_CT_Tool_2_0.pdf (2013).">Asano, Y., Horn, E. Instructions Chemotaxis and Migration Tool 2.0. , ibidi GmbH. Martinsried, Germany. http://ibidi.com/fileadmin/products/software/chemotaxis_tool/IN_XXXXX_CT_Tool_2_0.pdf (2013).
Generation of nitric oxide gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially controlled chemical reactions. Biomicrofluidics. 7 (6), 064104(2013).">Chen, Y. H., Peng, C. C., Cheng, Y. J., Wu, J. G., Tung, Y. C. Generation of nitric oxide gradients in microfluidic devices for cell culture using spatially controlled chemical reactions. Biomicrofluidics. 7 (6), 064104(2013).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان البولي أجهزة ميكروفلويديك لخلية دراسات الهجرة تحت عمودي الكيميائية والتدرجات الأوكسجين

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles