مقالة منهجية
* These authors contributed equally
تم تصميم البروتوكولات الموضحة هنا للسماح للباحثين بدراسة الاتصال الخلوي دون تغيير سلامة البيئة التي توجد فيها الخلايا. على وجه التحديد ، تم تطويرها لتحليل النشاط الكهربائي للخلايا القابلة للإثارة ، مثل الخلايا العصبية الشوكية. في مثل هذا السيناريو ، من الضروري الحفاظ على سلامة الخلية الشوكية ، ولكن من المهم أيضا الحفاظ على التشريح والشكل الفسيولوجي للأنظمة المعنية. في الواقع ، يجب أن يستند فهم الطريقة التي يعمل بها الجهاز العصبي - والأنظمة المعقدة الأخرى - إلى نهج نظامي. لهذا السبب ، تم اختيار جنين الزرد الحي كنظام نموذجي ، وتم تقييم تغيرات جهد غشاء الخلايا العصبية الشوكية دون التدخل في الظروف الفسيولوجية للأجنة.
هنا ، يتم وصف نهج يجمع بين استخدام أجنة الزرد وجهاز استشعار حيوي قائم على FRET. تتميز أجنة أسماك الزرد بجهاز عصبي مبسط للغاية وهي مناسبة بشكل خاص لتطبيقات التصوير بفضل شفافيتها ، مما يسمح بتوظيف مؤشرات الجهد القائمة على التألق في غشاء البلازما أثناء نمو أسماك الزرد. يتيح التآزر بين هذين المكونين تحليل النشاط الكهربائي للخلايا في الكائنات الحية السليمة ، دون الإخلال بالحالة الفسيولوجية. أخيرا ، يمكن أن يتعايش هذا النهج غير الجراحي مع تحليلات أخرى (على سبيل المثال ، تسجيلات الحركة العفوية ، كما هو موضح هنا).
في الجسم الحي التحليل المكوني يسمح العلماء للتحقيق في السلوك الخلوي في الطريقة الأكثر موثوقية. هذا صحيح بشكل خاص عندما يتأثر النشاط تحت التدقيق بشكل كبير من التفاعلات خلية الخلية (على حد سواء الاتصال وغير تعتمد على الاتصال)، كما هو الحال في الجهاز العصبي، حيث التغييرات غشاء الجهد يدفع التواصل بين الخلايا المنكوبة. إن فهم المعلومات المشفرة بواسطة هذه الإشارات الكهربائية هو المفتاح لفهم الطريقة التي يعمل بها الجهاز العصبي في كل من الحالات الفسيولوجية والمرضية.
من أجل دراسة الخواص الكهربائية الخلية في معظم الحالات الفسيولوجية غير الغازية، وقد وضعت مؤخرا ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
1. pHuC_Mermaid جيل البلازميد
ملاحظة: حورية البحر هو جهاز الاستشعار البيولوجي التي وضعتها الاقتران المجال استشعار الجهد (فسد) من الأمعاء سيونا (الآن سيونا روبوستا ) 5 استشعار الجهد التي تحتوي على الفوسفاتيز (سي-فسب) مع فلوريوفوريس شريك فريت أومي كينوكو الأخضر (موكغ: المانحة) ونسخة أحادية من البرتقال الباعثة للضوء الفلورسنت بروتين كوسابيرا أورانج (مكوك: أسيبتور). لهذا الاستشعار البيولوجي، والتغيرات التوافقية من المجال فسد، التي يسببها الاستقطاب الغشاء، وزيادة القرب من البروتينات المانحة والفلورسنت متقبل، وبالتا....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
تم نقل ناقلات التعبير تحمل فريت القائم على حورية البحر تسلسل الاستشعار البيولوجي ترميز تحت سيطرة المروج عموم الخلايا العصبية فوك، الذي يدفع تخليق البروتين حصرا في الجهاز العصبي، إلى بيضة واحدة المخصبة عن طريق حقن ميكروينجكتيون في من أجل الحصول على الأجنة المعدلة وراثيا عابرة ( الشكل 1 ، اللوحة اليسرى). بعد اتقان تقنية حقن ميكروينجكتيون، كانت نسبة الأجنة حورية البحر إيجابية قريبة من 100٪. ومن بين هذه، فقط اعتبرت ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
بروتوكول عرضت هنا يسمح لنا لاستكشاف العلاقة بين الخصائص الكهربائية من الخلايا العصبية الحركية الجنين العمود الفقري الزرد والسلوك الالتفافية عفوية، وأقرب النشاط الحركي النمطية، والذي يظهر حوالي 17 هف من التطور الجنيني ويستمر حتى 24 هف 10 .
يوفر نهجنا الباحثين مع أداة لدراسة النظام العصبي للأجنة سليمة، والحفاظ تماما على تعقيد التفاعلات بين الخلايا في شبكة وظيفية النامية. وقد أجريت في الج.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
يود المؤلفون أن يشكروا Simona Rodighiero على دعمها الذي لا يقدر بثمن في تحليل تصوير FRET.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| نقطة انصهار منخفضة Agarose | سيجما ألدريتش | A9414 | |
| DMSO | سيجما ألدريتش | W387520 | |
| Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 | |
| Pfu Ultra HQ DNA polymerase | Agilent Technologies - قسم منتجات ستراتاجين | 600389 | |
| T3 Universal primer | نظام تنظيف Sigma-Aldrich | ||
| Wizard SV Gel و PCR | Promega | A9280 | |
| Universal SmaI التمهيدي | عن الثدييات Eurofins | ||
| StrataClone / pCMV-SC ناقلات حادة | Agilent Technologies - Stratagene Products Division | 240228 | |
| SmaI | نيو إنجلاند بيولابز | R0141S | |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 | |
| Sali | New England Biolabs | R0138S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| 35 مم ، طبق تصوير ذو قاع زجاجي ؛ | Ibidi | 81151 | |
| ملقط | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| مجهر مجسم | Leica Microsystems | M10 F | |
| كاميرا رقمية | Leica Microsystems | DFC 310 FX | |
| Leica Application Suite 4.7.1 software | Leica Microsystems | ||
| QuickTime Player, v10.4 | مجهر Apple | ||
| متحد البؤر (مقلوب) | Leica Microsystems | TCS SP5 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| ImageJ macro Biosensor_FRET | |||
| GraphPad Prism 6.0c | GraphPad ، Inc |
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه
طلب إذن