في حين يتم تجنيد البلاعم تسلل باستمرار إلى أنسجة الكبار من السلائف تعميم، والبذور المقيمين البذور الأنسجة أثناء التنمية، حيث يتم الحفاظ عليها دون مزيد من المدخلات من الأسلاف. تم تحديد الأسلاف للبلاعم المقيمين مؤخرا. هنا، نقدم أساليب لتخطيط مصير الجينات من الأسلاف بلعم المقيمين.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تحديد أسلاف ريدثروميلويد وذريتهم في الجنين الماوس عن طريق التدفق الخلوي
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
البلاعم هي البالعات المهنية من الذراع الفطرية للجهاز المناعي. في حالة مستقرة، وجدت الضامة سيسيل في الأنسجة الكبار حيث أنها بمثابة الحرس خط الجبهة من العدوى والتلف الأنسجة. في حين يتم تجديد الخلايا المناعية الأخرى باستمرار من الجذعية المكونة للدم والخلايا السلف (هسك) الموجودة في نخاع العظام، وقد ثبت أن النسب من الضامة، والمعروفة باسم الضامة المقيمين، أن تكون ذاتي الصيانة في الأنسجة دون مدخلات من هسكس نخاع العظم. ويتمثل هذا النسب من قبل الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ، وخلايا كوبفر في الكبد وخلايا لانجرهانز في البشرة وغيرها. الأمعاء والقولون الصفيحة بروبريا هي أنسجة الكبار فقط خالية من هس مستقلة البلاعم المقيمين. وقد كشفت التحقيقات التي أجريت مؤخرا أن الضامة المقيمين تنشأ من خارج الجنينية كيس المحار الدم من السلف (ق) متميزة عن الخلايا الجذعية المكونة للدم الجنين (هسك). بين الكيس المحي نهائي تكون الدم، هأسلاف ثرومرويلويد (إمب) تؤدي إلى كل من خلايا الدم الحمراء والخلايا النخاعية، ولا سيما الضامة المقيم. يتم توليد إمب فقط داخل كيس المحار بين E8.5 و E10.5 أيام من التطور، وأنها تهاجر إلى الكبد الجنين في وقت مبكر من توصيل الدورة الدموية، حيث أنها توسيع والتمييز حتى E16.5 على الأقل. وتشمل سلالاتهم كريات الدم الحمراء، الضامة، العدلات والخلايا البدينة ولكن فقط الضامة المستمدة من إمب تستمر حتى سن البلوغ في الأنسجة. طبيعة عابرة من ظهور إمب والتداخل الزمني مع الجيل هسك يجعل من الصعب تحليل هذه الأسلاف. أنشأنا بروتوكول خرائط مصير تاموكسيفين محرض على أساس التعبير عن مستقبلات سيتوكين بلعم Csf1r المروج لتوصيف إمب والخلايا المستمدة إمب في الجسم الحي عن طريق التدفق الخلوي.
المقدمة
هناك عدة موجات متتالية ولكنها متداخلة من الأسلاف المكونة للدم أثناء التنمية التي لا تزال نسلها النخاعي في مرحلة البلوغ. أولا، تظهر الأسلاف "البدائية" غير المحايدة في كيس صفار الماوس 1 ، 2 بين E7.5-E8.25 وتؤدي إلى الضامة الجنينية دون أي وسيط أحادي. ما إذا كانت البلاعم المستمدة من الأسلاف البدائية تستمر في الدماغ البالغ كما تبقى الخلايا الدبقية الصغيرة موضوعا للتحقيق النشط. ثانيا، تنشأ السلائف الحمراء والنخاعية (إمبس) في كيس المحي في E8.5، أدخل مجرى الدم واستعمار الجنين. إمبس تخرج من كيس الصفار هيموجينيك إندوثيليوم في الانتقال البطانية إلى أن تكون المكونة لل رونكس 1 - 4 ، 3 . في حين يمكن إمب التفريق في الضامة داخل كيس الصفار، فإنها أيضا استعمار الكبد الجنين من يوم الجنينية (E) 9 5 و ديفيرنالتورم في كرات الدم الحمراء، الضخامة، الضامة، وحيدات الخلايا المحببة والخلايا البدينة 6 . الضامة التي تستمد من إمبس تحمل القدرة التكاثري في الأنسجة التنموية والكبار. ما إذا كانت الضامة المستمدة من إمب تجاوز مرحلة الوحيدات من التمايز لا تزال مثيرة للجدل كما هو معروف القليل جدا عن مسار التمايز 7 ، 8 . وأخيرا، تظهر الخلايا الجذعية المكونة للدم (هسس) في E10.5 داخل الجنين السليم من منطقة الشريان الأورطي-ميسونيفروس والهجرة إلى الكبد الجنين. يتم الكشف عن هسس مع القدرة على إعادة الإنتاج على المدى الطويل فقط بعد E11 (في 42 زوج مرحلة سوميت) 9 . هناك، فإنها توسع والتمييز من E12.5 حتى يبدأ تكون الدم النهائي للتحول إلى نخاع العظام، والذي يصبح الموقع السائد لإنتاج خلايا الدم لمدة حياة ما بعد الولادة 10 .
ليرة سوريةوالتداخل الأسمى والزماني في الظهور، فضلا عن علامات المناعية المظهرية المشتركة قد عرقلت حتى الآن قدرتنا على التمييز بين المساهمات المحددة لهذه الموجات من الأسلاف المكونة للدم الجنينية. في حين يتم إنشاء كل من إمب و هسك بطريقة تعتمد على Runx1 والتعبير عن عامل النسخ ميب ومستقبل عامل النمو Csf1r (مستعمرة عامل مستقبلة 1 المستعمرة، المعروف أيضا باسم مستعمرة ماكروفيج مستعمرة عامل مستقبل) من بين أمور أخرى، يمكن تمييز إمبس من هسس من قبل افتقارهم إلى إمكانات اللمفاوية، سواء في المختبر وفي الجسم الحي ، وعدم وجود إمكانات إعادة تشكيل على المدى الطويل وعدم وجود تعبير السطح من علامة النسب سكا-1 11 . وهناك حاجة إلى نماذج رسم مصير الجينات لتوصيف الجنين البلاعم لأنها تسمح استهداف الأسلاف الجنينية في طريقة محددة الخلية والوقت المحدد. هنا نقدم بروتوكول رسم مصير المستخدمة في مختبرنا للتمييز بين النسب اثنينق من الضامة وجدت في معظم أنسجة الكبار: هسك المستمدة تسلل الضامة و هسك مستقلة البلاعم المقيمين.
وقد عثرت البلاعم المقيمين الأنسجة إلى خلايا السلائف ميب مستقلة تعبر عن مستقبلات السيتوكين Csf1r 12 وتوجد في الجنين في E8.5-E10.5 باستخدام ثلاث استراتيجيات تكامل مصير تكميلية 6 . من أجل دراسة المحار كيس الدم من دون وضع علامات هس الجنين، ونحن نستخدم سلالة المعدلة وراثيا، Csf1r ميريكريمر ، معربا عن البروتين الانصهار محرض تاموكسيفين من "تحسين" ري ريكومبيناس واثنين من مستقبلات هرمون الاستروجين الماوس (مر-إكر-مر) تحت سيطرة المروج Csf1r. وبالتالي، فإن ريكومبيناس كري تكون نشطة في الخلايا csf1r-إكسبريسينغ خلال فترة زمنية محدودة. عندما تستخدم مع سلالة مراسل تحتوي على بروتين الفلورسنت المصب من لوكس-ستوب-لوكس كاسيت (Rosa26 لسل-إيف )، وسوف يؤدي إلى بيرمانفي وضع العلامات الوراثية للخلايا الموجودة في وقت الاستقراء ولكن أيضا من سلالة. الإدارة في E8.5 من شكل نشط من تاموكسيفين، 4-هدروكسيتاموكسيفين (أوه-تام)، والعلامات إمبس والبلاعم، دون وضع علامة على الكيس المحي غير مؤكدة "بدائية" الأسلاف أو هسس الجنين. وبالتالي، فقد ميزنا النمط المناعي من إمبس وذريتهم خلال التطور الجنيني، وكذلك تقييم مساهمة الضامة المستمدة الكيس المحي إلى برك بلعم الكبار. هناك حاجة إلى مزيد من العمل لتوصيف ما إذا كانت البدائية المستمدة السلف الأولية أيضا المسمى باستخدام هذا النهج، وما إذا كانت يمكن أن تسهم في برك بلعم الكبار.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تم تنفيذ الإجراءات الحيوانية وفقا للجنة رعاية الحيوان المؤسسية المعتمدة واستخدامها من معهد باستور (سيتيا).
1. في أوتيرو نبض وصفها في Csf1r ميريكريمر روزا لسل-يف الأجنة
- إعداد محلول المخزون من 4-هدروكسيتاموكسيفين (أوه-تام، 50 ملغ / مل).
- تحت فومهود، فتح قارورة 25 ملغ من أوه تام وإضافة 250 ميكرولتر الإيثانول (100٪).
- نقل الحل أوه-تام إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 2 مل مع طرف اقتطاع ودوامة في أقصى سرعة لمدة 10 دقيقة.
- يصوتن 30 دقيقة في حمام سونيكاتور.
- إضافة 250 ميكرولتر من بيج-35 زيت الخروع تحت فومهود للحصول على محلول المخزون 50 ملغ / مل.
ملاحظة: بيج-35 زيت الخروع هو مذيب مع خصائص أمفيفيليك التي تربط الجزيئات مسعور و سولوبيليزس لهم في المذيبات المائية. - دوامة لمدة 5 دقائق تقريبافي أقصى سرعة ويصوتن 30 دقيقة في حمام سونيكاتور.
- قسامة 90 ميكرولتر (4.5 ملغ) في أنبوب ميكروسنتريفوج (1 قسامة في الحقن).
- تخزين في 4 درجات مئوية لمدة 1 أسبوع أو في -20 درجة مئوية على المدى الطويل كما هو موضح سابقا 13 .
- إعداد محلول المخزون من البروجسترون (10 ملغ / مل)
- إضافة 250 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى 25 ملغ من هرمون البروجسترون لإعداد تعليق 10 ملغ / 100 ميكرولتر تحت فومهود. دوامة بلطف.
- إضافة 2250 ميكرولتر النفط عباد الشمس تعقيمها لجعل 10 ملغ / مل حل هرمون البروجسترون تحت غطاء محرك السيارة.
- دوامة لمدة 5 دقائق تقريبا في أقصى سرعة، قسامة وتخزينها في 4 درجات مئوية. لاحظ أن الحل واضح عند تخزينها.
- إدارة تاموكسيفين
ملاحظة: تم تقدير التطور الجنيني النظر في يوم تشكيل المكونات المهبلية كما يوم الجنينية (E) 0.5. ويتسبب إعادة التركيب عن طريق الحقن واحدة في E8.5في الحوامل Csf1r ميريكريمر الإناث 12 . الملحق أوه-تام مع 37.5 ميكروغرام لكل غرام من البروجسترون للحد من معدلات الإجهاض بعد إدارة تاموكسيفين. الحقن في 1:00 (عن المكونات المهبلية لوحظ في الصباح).- في صباح الحقن، يصوتن قسامة من الحل أوه-تام لمدة 10 دقيقة (أو حتى معلق تماما).
- إضافة 360 ميكرولتر كلوريد الصوديوم 0.9٪ تحت فومهود للحصول على 10 ملغ / مل حل أوه تام ودوامة تماما. يصوتن حتى الحل هو واضح ومعلق تماما (على الأقل 30 دقيقة).
- هرمون البروجسترون قبل الدافئة لدرجة حرارة الغرفة.
- مزيج 450 ميكرولتر من أوه تام و 225 ميكرولتر من هرمون البروجسترون في أنبوب ميكروسنتريفوج. دوامة.
- يصوتن على الأقل 10 دقيقة وتحميل على حقنة 1 مل مع إبرة 25G.
- في منشأة الحيوان، تزن الإناث الحوامل ( Csf1r ميريكريمر الإناث هي في فبب الخلفية الوراثية و نموذجية تزن بينإن 25 و 33 g).
- إجراء الحقن داخل البريتوني عن طريق حقن ببطء حجم المحسوبة في الماوس. بعد سحب الإبرة، اضغط بلطف على الجرح ثقب وتدليك البطن لتوزيع أوه-تام.
ملاحظة: الجرعة حقن أوه-تام هو 75 ملغ / كغ وجرعة البروجسترون هو 37.5 ملغ / كغ. الجدول 1 يوفر حجم لحقن في الإناث الحوامل.
| وزن الماوس (g) | إجمالي حجم لحقن من مزيج (ميكرولتر) |
| 25 | 281 |
| 26 | 292 |
| 27 | 303 |
| 28 | 315 |
| 29 | 326 |
| 30 | 338 |
| 31 | 348 |
| 32 | 360 |
| 33 | 371 |
| 34 | 382 |
| 35 | 394 |
الجدول 1: حجم حقن 4-أوه-تاموكسيفين (أوه-تام). حجم المطلوبة لحقن واحد في E8.5 من 75 ميكروغرام لكل ز (وزن الجسم) من أوه-تام تستكمل مع 37.5 ميكروغرام لكل غرام من هرمون البروجسترون.
2. تشريح صفار الكيس (يس) والكبد الجنين (فل)
ملاحظة: تقنيات العقيمة صارمة ليست ضرورية عند التلاعب الأجنة إلا إذا كانوا ذاهبين لاستخدامها على المدى الطويل الثقافة. ومع ذلك، يجب أن تكون منطقة العمل نظيفة ومغطاة في احباط تحت ورقة ماصة.
- إعداد الجليد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (بس) ومزيج الهضم (بس تحتوي على 1 ملغ / مل كولاجيناز D، 100 U / مل ديوكسيريبونوكلياز الأول (الدناز الأول) و 3٪ مصل بقري الجنين).
- التضحية الإناث الحوامل بواسطة سيرخلع فيكال في يوم الحمل المطلوب (على سبيل المثال المرحلة الجنينية E10.5).
- قرصة الجلد فقط على الأعضاء التناسلية وجعل شق صغير في خط الوسط مع مقص. سحب الجلد نحو الرأس لفضح تماما جدار الجسم دون الفراء. قطع عضلات البطن لفضح الأعضاء الداخلية ودفع الأمعاء لفضح قرنين الرحم.
- مع ملقط حادة متوسطة الحجم، والاستيلاء على وسادة الدهون تعلق على المبيض وسحب بلطف الرحم. قطع على مستوى عنق الرحم من قرون الرحم ورفع قرون من تجويف البريتوني. إزالة الدهون وسادة لتحرير تماما قرون الرحم وقطع قرون من المبيض على كل جانب.
- وضع قرون في برنامج تلفزيوني الجليد الباردة في طبق بتري 10 ملم. قبضة بسرعة طبقات عضلة الرحم في طرف واحد (نهاية عنق الرحم) والانزلاق مقص غرامة بين طبقة العضلات والأنسجة الساقطية للافراج عن الأجنة مع الأنسجة الساقطية المحيطة بها.
ملاحظة: العضلات تميل إلى التعاقد بسرعة أفتr استخراج، لذلك يجب أن تكون هذه الخطوة في أسرع وقت ممكن. - استخدام زوج واحد من ملقط غرامة لقطع غشاء ريشرت والمشيمة.
- إزالة بلطف كيس الصفار ووضعه في 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة مع 0.5 مل من مزيج الهضم.
ملاحظة: في هذه الخطوة، يمكن جمع الدم الجنينية.- مباشرة بعد قطع الأوعية السري والحيوية، ونقل الجنين إلى 12-جيدا لوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على 10 ملي إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض الجليد (إدتا). قطع رأس الجنين باستخدام مقص غرامة حادة، في محاولة للحد من أكبر قدر ممكن من تآكل الأنسجة. احتضان على الجليد لمدة 10-15 دقيقة وجمع إدتا التي تحتوي على الدم.
- إزالة أمنيون المحيطة الجنين.
- للمراحل
- قطع رأس الجنين لناملقط أو مقص غرامة. نقل الرأس إلى لوحة 24 جيدا مع 0.5 مل مزيج الهضم.
ملاحظة: يتم تشريح العصبية العصبية والدماغ في مراحل لاحقة لتحليل التدفق الخلوي. إزالة بعناية الضفيرة الوعائية المحيطة بها. - قطع الجنين فوق هيندليمب وإزالة فوريليمبس.
- لعزل الكبد، وفتح الصدر باستخدام زوج من ملقط غرامة. قرصة الأمامي للقلب وسحب بلطف أثناء استخدام الملقط الثاني لتحرير الأعضاء من الجسم.
- فصل بعناية الكبد الجنين من القلب والأمعاء. نقل الكبد الجنين إلى لوحة 24 جيدا مع 0.5 مل مزيج الهضم. مراقبة بعناية نقل تحت المجهر تشريح.
- جمع منطقة الذيل (أو أي جزء آخر الجنين) عن التنميط الجيني التي كتبها البوليميراز اختبار رد فعل سلسلة (ير).
ملاحظة: الأنسجة والأعضاء الأخرى يمكن حصادها من الأجنة E10.5 لتحليل مماثل باستخدام التدفق الخلوي. الدم، رأس، تزلجن، منطقة الشريان الأورطي- ميسونيفروس (أغم)، القلب و نيوروكتوديرم يمكن جمعها في E10.5. في مراحل لاحقة، الرئة والكلى والطحال والبنكرياس ويمكن أيضا أن يتم جمعها. وقد وصف سابقا وصفا مفصلا لتشريح الجمعية العامة العادية في مراحل تنموية مختلفة 14 .
3. معالجة الأنسجة الجنينية للتدفق الخلوي
- احتضان الأعضاء (وضعت في مزيج الهضم) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
- نقل الأنسجة والحل الأنزيمي على مصفاة 100 ميكرون وضعت في 6-جيدا لوحة زراعة الأنسجة مليئة 6 مل من العازلة فاكس (0.5٪ البقري مصل الزلال (بسا) و 2 ملي إدتا في برنامج تلفزيوني 1X). ينفصل ميكانيكيا عن طريق الهريس بلطف مع المكبس المطاط الأسود من حقنة 2 مل للحصول على تعليق خلية واحدة.
ملاحظة: من الآن فصاعدا، يجب أن يتم تنفيذ جميع الخطوات في 4 درجات مئوية. - جمع تعليق خلية مع ماصة باستور ونقل إلى أنبوب 15 مل.
- الصبانn لمدة 7 دقائق عند 320 x ج عند 4 درجات مئوية. تجاهل طاف عن طريق الشفط.
- ريسوسبيند الكرية في 60 ميكرولتر عرقلة فك العازلة (CD16 / CD32 حجب الأجسام المضادة المخفف 1/50 في فاكس العازلة).
- نقل 50 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة لكل بئر في أسفل جولة 96 لوحة متعددة جيدا. احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل على الجليد.
ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم تنفيذ تلطيخ في 5 مل أنابيب فاكس البوليسترين عند التعامل مع عدد قليل من العينات. - نقل 10 ميكرولتر المتبقية في أنبوب فاكس البوليسترين 5 مل للحصول على بركة من العينات من كل الأنسجة. هذا التجمع سوف تكون بمثابة الضوابط ( أي عينات غير ملوثين والفلور ناقص واحد (فمو) الضوابط لكل فلوكروم). نقل 50 ميكرولتر من تجمع لكل الفلورسنت ناقص واحد (فمو) السيطرة (واحد في فلوكروم) إلى 96 لوحة متعددة جيدا.
ملاحظة: كل عنصر تحكم فمو يحتوي على جميع الأجسام المضادة التي تقترن فلوروكروم من لوحة الأجسام المضادة، باستثناء واحدالتي يجري قياسها. وتستخدم فمو لتحديد حدود البوابة والتحكم في التداخل الطيفي في الألواح المتعددة الألوان. لمعالجة الاختلافات في الخلفية و أوتوفلورزنس بين الأنسجة المختلفة بشكل صحيح، فمن المهم لإعداد هذه الضوابط من تجمع عينات من كل الأنسجة. فإن السيطرة المناسبة للتعبير يف يكون عينات من الأجنة كري- السلبية، والتي أكدها التنميط الجيني ير.
- نقل 50 ميكرولتر من تعليق خلية واحدة لكل بئر في أسفل جولة 96 لوحة متعددة جيدا. احتضان لمدة 15 دقيقة على الأقل على الجليد.
4. السطحية أنتيجن تلطيخ
- إعداد مزيج الأجسام المضادة في فاكس العازلة (الجدول 2). إعداد 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة لكل عينة.
- استخدام الأجسام المضادة التالية متجانسة: مكافحة CD45.2 (استنساخ 104)؛ مكافحة CD11b (استنساخ M1 / 70)؛ مكافحة F4 / 80 (استنساخ BM8). مكافحة AA4.1 (استنساخ AA4.1)؛ أنتي-كيت (كلون 2B8)؛ ومكافحة تير 119 (استنساخ Ter119).
- إعداد ستة يمزج الأجسام المضادة للضوابط فمو في فاكس العازلة. إعداد 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة لكل عينة السيطرة.
لاتي: التخفيف من الأجسام المضادة في مزيج الأجسام المضادة هو مرتين أكثر تركيزا من التركيز النهائي المشار إليها في جدول المواد. يتم إعداد 6 ضوابط فمو لوحة مع ستة الأجسام المضادة اقتران فلوكروم. الجدول 2 يوفر تكوين مزيج الأجسام المضادة والضوابط فمو لأنبوب واحد.
| حجم (ميكرولتر) من الأجسام المضادة (الحجم النهائي 50 ميكرولتر) | ||||||||
| الجسم المضاد | استنساخ | الأجسام المضادة ميكس | فمو CD45.2 | فمو CD11b | فمو F4 / 80 | فمو AA4.1 | فمو كيت | فمو Ter119 |
| مكافحة CD45.2 | 104 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| مكافحة CD11b | M1 / 70 | 0.5 | 0.5 | 0 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 |
| مكافحة F4 / 80 | BM8 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 | 1 |
| مكافحة AA4.1 | AA4.1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 0 | 1 | 1 |
| مكافحة كيت | 2B8 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0 | 0.5 |
| مكافحة Ter119 | Ter119 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0.5 | 0 |
| فاكس العازلة | 45.5 | 46.5 | 46 | 46.5 | 46.5 | 46 | 46 | |
.within-بادج = "1"> الجدول 2: حجم الأجسام المضادة المستخدمة للتلطيخ والفلورسنت ناقص واحد (فمو) الضوابط. حجم (μL) من الأجسام المضادة المطلوبة لحجم النهائي من 50 ميكرولتر.
- إضافة 50 ميكرولتر من مزيج الأجسام المضادة للعينات في لوحة 96 مولتيويل (الحجم النهائي خلال تلطيخ هو 100 ميكرولتر). ماصة بلطف صعودا وهبوطا مرتين واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- تدور لوحة 96 مولتيويل لمدة 7 دقائق في 320 x ج في 4 درجات مئوية وتجاهل طاف. ريسوسبيند في 200 ميكرولتر من العازلة فاكس.
- تكرار غسل الإجراء (الخطوة 4.3) مرتين مع 150 ميكرولتر فاكس العازلة.
- تصفية العينات والضوابط (فموس وعينات بركة غير ملوثين) إلى 5 مل أنابيب البوليسترين من خلال مصفاة 70 ميكرون. تخزين على الجليد حتى الاستحواذ.
5. تحديد إمبس والبلاعم المستمدة يس عن طريق التدفق الخلوي
ملاحظة: تم تحسين هذا البروتوكول باستخدام 4 الليزر تدفق عداد الكريات مكافئويبد مع 405 نانومتر البنفسجي الليزر، 488 نانومتر الليزر الأزرق، 562 نانومتر الليزر الأصفر و 638 نانومتر الليزر الأحمر.
- إعداد حبات التعويض لكل الأجسام المضادة المقترنة بعد تعليمات الشركة الصانعة. استخدام عينات غير ملوثين وحبات التعويض لتحسين كثافة الليزر.
- لتحديد حدود البوابة، استخدم فمو (فلورزنس ناقص واحد) الضوابط لكل الأجسام المضادة.
- من أجل استبعاد الخلايا الميتة، إضافة 1 ميكرولتر من دابي (1 ملغ / مل) إلى أنبوب (تحتوي على 200 ميكرولتر من تعليق خلية ملون) 1 دقيقة قبل الاستحواذ. استخدام إشارة دابي قوية والمعلمة المتناثرة إلى الأمام (فسك) لأداء استبعاد الخلايا الميتة والحطام.
ملاحظة: استخدام البرمجيات من التدفق الخلوي لرسم البوابات أثناء الاستحواذ. ويمكن إجراء مصفوفة التعويض والتحليل بعد اكتساب العينة باستخدام برامج أخرى متاحة تجاريا. - استخدام مبعثر إلى الأمام والجانب (فسك مقابل سك) لأداء الخلية الحية والتمييز مضاعفة من إجمالي الأحداث.
- إنشاء مؤامرات نقطة مضان في محور سجل مقياس ورسم البوابات ابنة ل، أولا، واستبعاد كريات الدم الحمراء (Ter119 + )، وبعد ذلك، لتحديد الخلايا الاصلية (كيت + ) والخلايا المكونة للدم (CD45 + كيت نيغ ) (انظر الشكل 1 ).
- إنشاء الرسوم البيانية مضان لقياس كفاءة وضع العلامات من يف بين مختلف السكان المحددة في يس ( الشكل 2 )، الكبد الجنين ( الشكل 3 ) والدماغ ( الشكل 4 ).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم تحقيق رسم الخرائط الجينية الوراثية من قبل الإدارة في E8.5 من أوه-تام في Csf1r- مير-إكر-مر الإناث تزاوج مع الذكور الذين يحملون مراسل Rosa26-لسل-إيف. في وجود أوه-تام، استئصال كاسيت وقف يؤدي إلى التعبير الدائم عن يف في الخلايا معربا عن Csf1r . جمعنا اثنين من الأنسجة المكونة للدم: الكيس المحي وكبد الجنين والأنسجة غير المكونة للدم، العصبية العصبية، من الأجنة في E10.5. تم الحصول على تعليق خلية واحدة عن طريق التفكك الأنزيمية والميكانيكية وتم ت...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
موجات مختلفة من الخلايا السلائف المكونة للدم تتداخل جزئيا ضمن إطار زمني قصير، الأمر الذي يجعل تحليل مساهمة كل موجة من تكون الدم التنموية لخلايا المناعة من الناحية الفنية صعبة للغاية.
توفر نظم كري التي تحتوي على تاموكسيفين فرصة لوضع علامات على خلايا محددة بطريقة محرضة زمنيا وإجراء تحليل النسب في الأجنة أو البالغين، دون الحاجة إلى خارج الجسم الحي أو في زراعة المختبر أو زرعه. في سلالات كري...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
ويشكر المؤلفان البروفسور فريدريك جيسمان والبروفيسور كريستيان شولتز على المناقشات الثاقبة؛ الدكتور هانا غارنر للقراءة النقدية للمخطوطة، الدكتور كزافييه مونتاغوتيلي والدكتور جان جوبير وموظفي منشأة الحيوان معهد باستور لدعم مع تربية الفأر. وباسكال داردين، وفيتوت بوريكيت، باحث أمجين، لمساعدتهما التقنية. يتم تمويل البحوث في المختبر إغب من قبل معهد باستور، و نرس، سيركل فسر (فرم ومجموعة من البداية من معهد باستور و كونسورتيوم المعهد.يتم دعم لي من قبل الزمالة الدكتوراه من اتحاد ريفيف.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| العلوم | الملقط المستقيم | 11251-20 | |
| MC19 / B مقص الربيع Pascheff-Wolff ؛ | أدوات العلوم الدقيقة | 15371-92 | |
| مقص مستقيم 8.5 سم | أدوات العلوم الدقيقة | 14090-09 | |
| مجموعة مضادة للماوس-PE (استنساخ 2B8) | BD Pharmingen | 553355 | 1/200 تخفيف في FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD45.2 APC-Cy7 (استنساخ 104) | تخفيف Sony | 1149120 | 1/100 في FACs Buffer |
| Anti-Mouse AA4.1-APC (CD93 ، استنساخ AA4.1) | eBioscience | 17-5892 | 1/100 التخفيف في FACs المخزن المؤقت |
| المضاد للماوس Ter119 PerCP-Cy5.5 (استنساخ Ter119) | Biolegend | 560512 | 1/200 في FACs Buffer |
| Anti-Mouse F4 / 80-BV421 (استنساخ BM8) BD | Pharmingen | 123137 | 1/100 التخفيف في FACs Buffer |
| Anti-Mouse CD11b PE-Cy7 (استنساخ M1 / 70) BD | Pharmingen | 552850 | 1/200 التخفيف في FACs Buffer |
| مكافحة الفأر CD16 / CD32 (الماوس BD Fc Block ، استنساخ 2.4G2) BD | Biosciences | 553142 | |
| PBS 1x | Fischer Scientific | 12559069 | |
| مصل الأبقار الجنيني | فيشر العلمي | 11570506 | |
| كولاجيناز D & nbsp ؛ | Roche | 11088882001 | |
| Deoxyribonuclease I | Sigma | D4527-20KU | |
| لوحة زراعة الأنسجة ذات 6 آبار | Dutscher Dominique | 353046 | |
| لوحة زراعة الأنسجة المكونة من 12 بئرا | Dutscher Dominique | 353224 | |
| لوحة زراعة الأنسجة ذات 24 بئرا | Fischer Scientific | 11874235 | |
| 96 بئرا ثقافة الأنسجة السفلية على شكل حرف U لوحة | دوتشر دومينيك | 353227 | |
| حقنة Plastipak 2 mL | دوتشر دومينيك | 300185 | |
| شبكة نايلون 100 & مايكرو ؛ مصافي الخلايا m | Dutscher Dominique | 352360 | |
| شبكة نايلون 70 & ميكرو; مصافي الخلايا m | Dutscher Dominique | 352350 | |
| 15 مل أنابيب Falcon | Dutscher Dominique | 352096 | |
| Stericup GP Millipore ، 0.2 & mu ؛ m | Dutscher Dominique | 51246 | |
| مصل الأبقار ألبومين | سيجما | A7906-500G | |
| (Z) -4-HYDROXYTAMOXIFEN 25mg | Sigma | H7904-25MG | يجب توخي الحذر بشكل خاص عند التحضير والعمل مع تاموكسيفين ومشتقاته. استخدم دائما معدات الحماية الشخصية |
| المناسبة البروجسترون | سيجما | P3972 | استخدم دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة |
| زيت الخروع PEG-35 (Kolifor / Cremophor EL) | Sigma | C5135 | |
| زيت عباد الشمس | Sigma | S5007-250ML | |
| الإيثانول ؛ | Sigma | 24103-1L-R-D | استخدم دائما معدات الحماية الشخصية المناسبة واستخدمها تحت الدخان |
| EDTA | Sigma | E9884-500G | |
| DAPI ، 1 مل (1 مجم / مل في الماء) | Fischer Scientific | 10116287 | |
| CytoFLEX S B2-R3-V4-Y4 مقياس التدفق الخلوي | Beckman Coulter | B75408 | |
| CytoFLEX Daily QC Fluorospheres | Beckman Coulter | B53230 | |
| VersaComp مجموعة حبة التقاط الأجسام المضادة (2 × 5 مل) | Beckman Coulter | B22804 | |
| FVB-Tg (Csf1r-cre / Esr1 *) 1Jwp / J | مختبر جاكسون | 19098 | |
| B6.129X1-GT (ROSA) 26Sortm1 (EYFP) Cos / J | مختبر جاكسون | 6148 |
المراجع
- Bertrand, J. Y., et al. Three pathways to mature macrophages in the early mouse yolk sac. Blood. 106 (9), 3004-3011 (2005).
- Palis, J., Robertson, S., Kennedy, M., Wall, C., Keller, G. Development of erythroid and myeloid progenitors in the yolk sac and embryo proper of the mouse. Development. 126 (22), 5073-5084 (1999).
- Chen, M. J., et al. Erythroid/myeloid progenitors and hematopoietic stem cells originate from distinct populations of endothelial cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 541-552 (2011).
- Frame, J. M., Fegan, K. H., Conway, S. J., McGrath, K. E., Palis, J. Definitive Hematopoiesis in the Yolk Sac Emerges from Wnt-Responsive Hemogenic Endothelium Independently of Circulation and Arterial Identity. Stem Cells. , (2015).
- Kieusseian, A., Brunetdela de la Grange, P., Burlen-Defranoux, O., Godin, I., Cumano, A. Immature hematopoietic stem cells undergo maturation in the fetal liver. Development. 139 (19), 3521-3530 (2012).
- Gomez Perdiguero,, E,, et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- Hoeffel, G., et al. C-Myb(+) erythro-myeloid progenitor-derived fetal monocytes give rise to adult tissue-resident macrophages. Immunity. 42 (4), 665-678 (2015).
- Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F., Gomez Perdiguero, E. Development and function of tissue resident macrophages in mice. Semin Immunol. 27 (6), 369-378 (2015).
- Houssaint, E. Differentiation of the mouse hepatic primordium. II. Extrinsic origin of the haemopoietic cell line. Cell Differ. 10 (5), 243-252 (1981).
- Cumano, A., Godin, I. Ontogeny of the hematopoietic system. Annu Rev Immunol. 25, 745-785 (2007).
- McGrath, K. E., et al. Distinct Sources of Hematopoietic Progenitors Emerge before HSCs and Provide Functional Blood Cells in the Mammalian Embryo. Cell Rep. 11 (12), 1892-1904 (2015).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
- Chevalier, C., Nicolas, J. F., Petit, A. C. Preparation and delivery of 4-hydroxy-tamoxifen for clonal and polyclonal labeling of cells of the surface ectoderm, skin, and hair follicle. Methods Mol Biol. 1195, 239-245 (2014).
- Bertrand, J. Y., Giroux, S., Cumano, A., Godin, I. Hematopoietic stem cell development during mouse embryogenesis. Methods Mol Med. 105, 273-288 (2005).
- Bertrand, J. Y., et al. Characterization of purified intraembryonic hematopoietic stem cells as a tool to define their site of origin. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (1), 134-139 (2005).
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), 841-845 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
- Qian, B. Z., et al. CCL2 recruits inflammatory monocytes to facilitate breast-tumour metastasis. Nature. 475 (7355), 222-225 (2011).
- Yona, S., et al. Fate mapping reveals origins and dynamics of monocytes and tissue macrophages under homeostasis. Immunity. 38 (1), 79-91 (2013).
- Sheng, J., Ruedl, C., Karjalainen, K. Most Tissue-Resident Macrophages Except Microglia Are Derived from Fetal Hematopoietic Stem Cells. Immunity. 43 (2), 382-393 (2015).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
