تعديل الجينات بوساطة PCR-يمكن استخدامها لتوليد اندماج بروتين فلوري في أنواع المبيضات، مما يسهل التصور والكميات من خلايا الخميرة والبروتينات. هنا، نقدم استراتيجية لبناء البروتين الانصهار فلوري (Eno1-FP) في المبيضات المرطية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
المبيضات، المستعمرون السائد في مساحات والأمعاء والجهاز البولي التناسلي، هي سبب معظم الأمراض الفطرية الغازية في البشر. وبالتالي، هناك حاجة إلى أدوات الجزيئية والجينية لتسهيل دراسة الآليات المرضية الخاصة بهم. تعديل الجينات بوساطة PCR-هو نهج واضحة وسريعة لتوليد البروتينات الموسومة حاتمة لتسهيل الكشف عنها. على وجه الخصوص، البروتين الفلوري (FP) اندماج هي أدوات قوية التي تسمح التصور والكميات من كل من خلايا الخميرة والبروتينات بواسطة المجهر مضان وimmunoblotting، على التوالي. البلازميدات تحتوي FP تسلسل الترميز، جنبا إلى جنب مع الجينات علامة الغذائية التي تسهل التحول من المبيضات، تم إنشاؤها لغرض بناء FP والتعبير في المبيضات. هنا، نقدم استراتيجية لبناء الانصهار FP في المبيضات. البلازميدات التي تحتوي على المقاومة nourseothricinالامتحانات التنافسية الوطنية الجينات التحول علامة (NAT1) جنبا إلى جنب مع تسلسل إما أخضر، أصفر، أو الكرز ضباط الإتصال (GFP، YFP، mCherry) تستخدم جنبا إلى جنب مع الاشعال التي تشمل تسلسل الجينات المحددة في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لإنشاء كاسيت FP . هذا كاسيت جين معين لديه القدرة على الاندماج في نهاية 3'من مكان الجين المقابل عبر إعادة التركيب مثلي. يتم التحقق من نجاح الانصهار في إطار تسلسل FP في موضع الجينات في المصالح وراثيا، تليها تحليل التعبير انصهار بروتين بواسطة المجهر و / أو الطرق المناعية الكشف. وبالإضافة إلى ذلك، لحالة من البروتينات أعرب للغاية، اندماج ناجحة يمكن فرزهم لفي المقام الأول من خلال تقنيات التصوير مضان.
المقدمة
المبيضات والفطريات المتعايشة التي تستعمر مساحات المعوية والجهاز البولي التناسلي من كل البشر. في ظل ظروف من نقص المناعة، مثل التي تحدث مع الولادة المبكرة أو الآثار المثبطة للمناعة من العلاجات لمرض السرطان، فهناك أنواع المبيضات تصبح مسببات الأمراض الانتهازية. من المبيضات، المبيضات البيض هو المستعمر الفطرية الأكثر انتشارا ويتسبب في غالبية الإصابات الفطرية الغازية. الأنواع الأخرى المبيضات مثل C. الجرداء، C. المرطية، C. مداري، وجيم kruseii يسبب أيضا التهابات خطيرة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة، مع بعض واظهار المقاومة الجوهرية ليشيع استخدامها الم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. عزل قالب البلازميدات من كولاي
- تنمو كولاي التي تحتوي على البلازميد قالب بين عشية وضحاها في 10 مرق مل استذابة (LB) + 200 ملغم / لتر الأمبيسلين (AMP) عند 37 درجة مئوية مع الهز.
- حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 6000 x ج لمدة 2 دقيقة.
- صب السائل، عزل وتنقية الحمض النووي من كولاي الخلايا عن طريق طريقة موحدة كما هو موضح سابقا في Ausubel وآخرون. 8.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
على سبيل المثال، استخدمنا بروتوكول المذكورة أعلاه لبناء GFP وmCherry اندماج لEno1 في C. سلالة المرطية المختبر. وقد restreaked كل المحولة المفترض في البداية للنمو. في هذا المثال، منذ انصهار بروتين الناتج وأعربت غاية (إينولاز) وضباط الإتصال مشرقة، كنا قادرين على الشاشة transformants بواسطة المجهر مضان قبل إجراء التشخيص PCR (الشكل 3) 6.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بناء حاتمة الموسومة تسلسل في المبيضات باستخدام استراتيجية تعديل الجينات بوساطة PCR-المذكورة أعلاه يمكن تلخيصها على النحو عملية من ثلاث خطوات. أولا، يتم إجراء كاسيت من قبل PCR الذي يشفر كل من التسلسل المطلوب لتحقيق التكامل والمناطق مثلي إلى موضع الإدراج في الجينوم الخميرة. ثانيا، يتم إجراء خلايا الخميرة إلى أن تتحول المختصة كيميائيا مع خلات الليثيوم وشارك في تحضين مع الكاسيت. ثالثا، ومطلي الخلايا على وسائل الاعلام انتقائية لاسترداد transformants ويتم اختبار الناتجة مستعمرا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
نشكر N. عميد لتوفير الأصلي تسلسل mCherry FP، M. جيرامي نجاد لبناء البلازميدات، B. لارسون لتقديم المساعدة التقنية، وT. Heisel للحصول على المشورة المفيدة خلال تطوير هذا المشروع. وأيد JB من قبل جائزة الأوروبي مجلس البحوث المتقدمة 340087 (RAPLODAPT). وقدمت أنظمة المجهر والتصوير من جامعة مينيسوتا مؤسسة طب الأطفال ومركز جامعة التصوير ولاية مينيسوتا.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| مصباح زئبق 100 واط | شركة CHIU التقنية | M-100T | |
| 95٪ إيثانول | أي | NA | |
| الأدينين | أي | NA | |
| أمبيسلين | أي | ||
| حامل الحمض النووي | أمبيون | AM9680 | السلمون المقطوع المنوية الحمض النووي 10 مجم / مل |
| CCD كاميرا | القياسات الضوئية | CoolSNAP HQ | |
| مخروطي | كورنينج | 430828 | 50 مل |
| مدور | نيو برونزويك | 2013923 | TC-8 ، أو أي أنبوب مدور |
| منقوص النوكليوتيدات (dNTP) PCR الصف | أي | أنابيب NA | |
| Eppendorf | 022363719 | ، 022363212 | 0.5 مل ، 1.5 مل |
| Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | 7250089 | 125 مل |
| حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) | أي | ||
| (-80 & deg; ج) | Thermo Electron Corporation | ULT-1386-9-V | Revco Ultima II |
| GFP ، YFP و Texas Red Filter | Sets Chroma Technology Corporation | 49002 ، 86004v2 ، 49008 | |
| أنابيب زراعة الزجاج | فيشر ساينتفيك | 1496126 | 75 مم |
| HRP الماعز المضاد للجسم المضاد للفأر | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | SC-2005 | |
| HRP الماعز المضاد للأرانب | سانتا كروز حاضنة التكنولوجيا الحيوية | SC-2301 | |
| (30 درجة ؛ ج) | أي | ||
| أي | |||
| Lysogeny (LB) | أي | المغنيسيوم | |
| أي | |||
| جهاز طرد مركزي دقيق | Eppendorf | 5415 D | |
| مجهر | نيكون | E600 | نيكون Eclipse E600 |
| برنامج | تحليل الصور المجهرييونيفرسال إيميجينغ كوربوريشن | 6.3r7 | MetaMorph سلسلة البرامج 6.3r7 |
| الفأر المضاد للجسم المضاد ل GFP | روش | 11814460001 | |
| نورسيوتريسين | فيشر 50997939 | ||
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 9700 | GeneAmp PCR System |
| أنابيب PCR | BioExpress ، GeneMate | T-3035-1 | 0.2 مل |
| البولي إيثيلين جلايكول 3350 | أي | كلوريد البوتاسيوم | |
| أي | |||
| Rabbit الأجسام المضادة ل mCherry | BioVision | 5993-100 | |
| ثلاجة (4 درجة ؛ ج) | أي | الصوديوم NA | |
| أي | مجهر مجهر مجسمة | ||
| NA نيكون | SMZ1500 | ||
| جهاز طرد مركزي أعلى الطاولة | Labnet | Z 400 | Hermle Z 400 |
| Taq< / em> بوليميراز الحمض النووي | أي | NA | |
| تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان (تريس) أي | NA | ||
| خلاط دوامة | الصناعات العلمية | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| مستخلص الخميرة الببتون سكر العنب (YPD) وسائل الإعلام | أي | NA |
المراجع
- Bendel, C. M. Colonization and epithelial adhesion in the pathogenesis of neonatal candidiasis. Semin. Perinatol. 27 (5), 357-364 (2003).
- Gerami-Nejad, M., Berman, J., Gale, C. A. Cassettes for PCR-mediated construction of....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
