ومعظمها تم دراستها تجديد شبكية العين الزرد باستخدام شبكية العين الثابتة. ومع ذلك، والعمليات الحيوية مثل الهجرة النووية interkinetic تحدث خلال استجابة التجدد وتتطلب التصوير الخلية الحية للتحقيق في الآليات الكامنة. هنا، نحن تصف الظروف والثقافة وتصوير لمراقبة Interkinetic الهجرة النووية (الحركة الوطنية العراقية) في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر multiphoton.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ثقافة الكبار المعدلة وراثيا الزرد الشبكية إإكسبلنتس التصوير خلية حية من قبل Multiphoton المجهر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يبدأ برنامج تجديد الذاتية من قبل مولر الدبقية في الزرد الكبار (دانيو rerio) الشبكية التالية تلف الخلايا العصبية والموت. مولر الدبقية إعادة إدخال دورة الخلية وتنتج الخلايا الاولية العصبية التي تخضع لجولات لاحقة من انقسامات الخلية والتمايز إلى أنواع الخلايا العصبية المفقودة. كل من مولر الدبقية والخلايا الاصلية العصبية نوى تكرار الحمض النووي وتخضع الانقسام في مواقع متميزة من شبكية العين، أي أنها تهاجر بين القاعدية طبقة النووية الداخلية (INL)، وطبقة النووية الخارجي (ONL)، على التوالي، في عملية وصفت بأنها Interkinetic الهجرة النووية (الحركة الوطنية العراقية). وقد الغالب درست الحركة الوطنية العراقية في شبكية العين النامية. لدراسة ديناميات الحركة الوطنية العراقية في الكبار تجديد شبكية العين الزرد في التفاصيل، مطلوب التصوير الخلية الحية من مولر الدبقية الخلايا الاولية fluorescently المسمى / العصبية. هنا، ونحن توفير الظروف لعزل وشبكية العين الثقافة الظهريةمن تيراغرام [GFAP: nGFP] mi2004 الزرد التي تعرضت للضوء الشديد المستمر لمدة 35 ساعة. وتبين لنا أيضا أن هذه الثقافات الشبكية هي قابلة للتطبيق لإجراء تجارب التصوير الخلية الحية، والحصول بشكل مستمر الصور ض المكدس في جميع أنحاء سمك يزدرع الشبكية لمدة تصل إلى 8 ساعات باستخدام المجهر multiphoton لمراقبة سلوك الهجرة من GFAP: خلايا -positive nGFP . وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف تفاصيل لإجراء تحليل ما بعد التصوير لتحديد سرعة الحركة الوطنية العراقية قمي والقاعدية. لتلخيص، أنشأنا الظروف لدراسة ديناميات الحركة الوطنية العراقية في نموذج الكبار من تجديد الخلايا العصبية. هذا وسوف تقدم فهمنا لهذه العملية الخلوية حاسمة وتسمح لنا لتحديد الآليات التي تتحكم في الحركة الوطنية العراقية.
المقدمة
وخلافا للبشر، الزرد (دانيو rerio) تبدي استجابة التجدد قوية على موت الخلية في الخلايا العصبية للشبكية 1، 2، 3، 4. عامل نخر الورم α، وهو جزيء إشارة التي يتم تحريرها من الموت الخلايا العصبية للشبكية يدفع مولر الدبقية المقيمين في القاعدية طبقة النووية الداخلية (INL) من شبكية العين، لتتكاثر 5 وإنتاج الخلايا الاولية العصبية التي لا تزال تتكاثر قبل التفريق في الخلية العصبية الأنواع التي توفي 2، 3،
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: أثيرت الزرد والمحافظة عليها في مرفق نوتردام الزرد في مركز علوم الحياة في Freimann. تمت الموافقة على الطرق الموضحة في هذه المخطوطة من جامعة نوتردام رعاية الحيوان واستخدام اللجنة وتكون في الامتثال لبيان لاستخدام الحيوانات في البحوث الرؤية من قبل جمعية البحوث في الرؤية والعيون.
1. حلول
- إعداد 70٪ من الإيثانول لتعقيم هود زراعة الأنسجة وأية معدات / الكواشف التي يتم نقلها إلى غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة.
- إضافة 2 مل م....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
عزلة شبكية العين وفقا للإجراءات المبينة في التخطيطي في الشكل 1 يسمح للزراعة من شبكية العين الظهرية بالارض من أضرار خفيفة الكبار تيراغرام [GFAP: nGFP] mi2004 الزرد خلال فترة لا تقل عن 24 ساعة في 5٪ CO 2 / بيئة الهواء. هذه إإكسبلنتس الشبكية شنت مسطحة يمكن استخدامها لطائرات التنسيق صورة في مستويات الأنسجة العميقة. مثال على ذلك هو مولر الدبقية / العصبية نواة خلية سلفية المسمى مع GFP من مولر الدبقية محددة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
دراسات التحقيق في الآليات التي تحكم تجديد الكبار التالفة شبكية العين الزرد الطرق في الغالب تستخدم immunocytochemical 5، 25، 26، 27، 28، 29، 30. تهيئة الظروف الملائمة لثقافة إإكسبلنتس الشبكية وأداء التصوير الخلية الحية على الظواهر، مثل الحركة الوطنية ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
ونحن نقدر الدعم المقدم من قبل ويليام آرتشر ومرفق نوتردام المتكاملة التصوير. وتوجه بشكر خاص إلى الفنيين في Freimann علوم الحياة لمساعدة مستمرة ورعاية وتربية من الزرد. وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من المعهد الوطني للعيون من المعاهد الوطنية للصحة لDRH (R01-EY018417، R01-EY024519) ومركز بحوث اسماك الزرد، جامعة نوتردام، نوتردام، IN.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ملقط دومون # 5 | أدوات الدقة العالمية | 14098 | |
| ملقط دومون # 5 ، 45 درجة ؛ زاوية | أدوات الدقة العالمية | 14101 | |
| مقص ماكفرسون فاناس | الدقة العالمية | 501233 | |
| الفلورديش | أدوات الدقة العالمية | FD35-100 | |
| المجهر | المجسم نيكون | سيعمل نوع مماثل من المجهر المجسم | SMZ-1B |
| نوع خزانة السلامة البيولوجية من النوع A2 | Labconco | المكافئ سيعمل | |
| حاضنة زراعة الأنسجة | سيعمل النوع المكافئ | HEPA من الفئة 100 | سيعمل |
| الفلورسنت سيلفانيا OSFP5835HOECO | Bulbtronics | 31850 | |
| 0.2 & micro ؛ م مرشح حقنة Acrodisc بحجم | المسام VWR | 4192 | |
| 10 مل حقنة Luer-lok | VWR | BD309604 | |
| 60 مل حقنة Luer-lok | VWR | BD309653 | |
| NaHCO3< / sub> | FischerScientific | S233-500 | |
| CaCl2< / sub> | ThermoScientific | C79-500 | |
| MgCl2 | EMD Millipore | 5980 | |
| HBSS بدون Ca2 + < / sup> / Mg2 + < / sup> ، بدون فينول أحمر ، Gibco | ThermoScientific | 14175-095 | |
| MEM بدون فينول أحمر ، Gibco | ThermoScientific | 5100-038 | |
| مصل الحصان ، معطل بالحرارة | ThermoScientific | 26050-070 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | VWR | 16777-164 | |
| نقطة انصهار منخفضة فائقة النقاء أغاروز | ThermoScientific | 16520-100 | |
| إيثانول ، مطلق | ThermoScientific | BP2818-4 | |
| 2-phenoxyethanol | Sigma | 77699 | |
| خلية Corning Cell-Tak لاصقة الأنسجة ؛ | VWR | 354240 | |
| سائل معامل الانكسار | Cargille Lab | 1803Y | |
| Nikon A1 متعدد الفوتون المجهز بنظام مكافئ ليزر مايتاي بالأشعة تحت الحمراء | من نيكون | ||
| 40X Apo بهدف الغمر في الماء لمسافات طويلة (NA 1.15) | |||
| الغرفة البيئية المجهزة بإدراج لنظام مكافئ 35 مم من Petridish | Okolab | سيعمل | |
| برنامج | تحليل NISنيكون |
المراجع
- Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
- Kassen, S. C., et al. Time....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
