يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

ثقافة الكبار المعدلة وراثيا الزرد الشبكية إإكسبلنتس التصوير خلية حية من قبل Multiphoton المجهر

8.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55335

⸱

فبراير 24, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Notre Dame, 2Department of Neurosurgery, Mayo Clinic

في هذه المقالة

ملخص

ومعظمها تم دراستها تجديد شبكية العين الزرد باستخدام شبكية العين الثابتة. ومع ذلك، والعمليات الحيوية مثل الهجرة النووية interkinetic تحدث خلال استجابة التجدد وتتطلب التصوير الخلية الحية للتحقيق في الآليات الكامنة. هنا، نحن تصف الظروف والثقافة وتصوير لمراقبة Interkinetic الهجرة النووية (الحركة الوطنية العراقية) في الوقت الحقيقي باستخدام المجهر multiphoton.

الملخص

يبدأ برنامج تجديد الذاتية من قبل مولر الدبقية في الزرد الكبار (دانيو rerio) الشبكية التالية تلف الخلايا العصبية والموت. مولر الدبقية إعادة إدخال دورة الخلية وتنتج الخلايا الاولية العصبية التي تخضع لجولات لاحقة من انقسامات الخلية والتمايز إلى أنواع الخلايا العصبية المفقودة. كل من مولر الدبقية والخلايا الاصلية العصبية نوى تكرار الحمض النووي وتخضع الانقسام في مواقع متميزة من شبكية العين، أي أنها تهاجر بين القاعدية طبقة النووية الداخلية (INL)، وطبقة النووية الخارجي (ONL)، على التوالي، في عملية وصفت بأنها Interkinetic الهجرة النووية (الحركة الوطنية العراقية). وقد الغالب درست الحركة الوطنية العراقية في شبكية العين النامية. لدراسة ديناميات الحركة الوطنية العراقية في الكبار تجديد شبكية العين الزرد في التفاصيل، مطلوب التصوير الخلية الحية من مولر الدبقية الخلايا الاولية fluorescently المسمى / العصبية. هنا، ونحن توفير الظروف لعزل وشبكية العين الثقافة الظهريةمن تيراغرام [GFAP: nGFP] mi2004 الزرد التي تعرضت للضوء الشديد المستمر لمدة 35 ساعة. وتبين لنا أيضا أن هذه الثقافات الشبكية هي قابلة للتطبيق لإجراء تجارب التصوير الخلية الحية، والحصول بشكل مستمر الصور ض المكدس في جميع أنحاء سمك يزدرع الشبكية لمدة تصل إلى 8 ساعات باستخدام المجهر multiphoton لمراقبة سلوك الهجرة من GFAP: خلايا -positive nGFP . وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف تفاصيل لإجراء تحليل ما بعد التصوير لتحديد سرعة الحركة الوطنية العراقية قمي والقاعدية. لتلخيص، أنشأنا الظروف لدراسة ديناميات الحركة الوطنية العراقية في نموذج الكبار من تجديد الخلايا العصبية. هذا وسوف تقدم فهمنا لهذه العملية الخلوية حاسمة وتسمح لنا لتحديد الآليات التي تتحكم في الحركة الوطنية العراقية.

المقدمة

وخلافا للبشر، الزرد (دانيو rerio) تبدي استجابة التجدد قوية على موت الخلية في الخلايا العصبية للشبكية 1، 2، 3، 4. عامل نخر الورم α، وهو جزيء إشارة التي يتم تحريرها من الموت الخلايا العصبية للشبكية يدفع مولر الدبقية المقيمين في القاعدية طبقة النووية الداخلية (INL) من شبكية العين، لتتكاثر 5 وإنتاج الخلايا الاولية العصبية التي لا تزال تتكاثر قبل التفريق في الخلية العصبية الأنواع التي توفي 2، 3، 4. خلال المرحلة التكاثري للاستجابة التجدد، نوى مولر الدبقية والمستمدة الخلايا الاولية العصبية التي تخضع لنمط الهجرة المتكرر في مرحلة مع دورة الخلية (Interkinetic الهجرة النووية، الحركة الوطنية العراقية) 6 > 7. نوى المتمركزة في INL القاعدية تكرار الحمض النووي قبل أن يهاجر إلى طبقة النووية الخارجي (ONL) حيث أنها تقسم قبل العودة نوى الناشئة باسالي إلى INL. وقد وصفت هذه العملية لأول مرة خلال تطوير الظهارية العصبية باستخدام أساليب النسيجية، فيما أكد النهج التصوير الخلية الحية في وقت لاحق تفسير سوير 8، 9، 10، 11، 12. وقد استخدمت كلا النهجين التصوير النسيجية والعيش خلية لتحديد الآليات الكامنة وراء الحركة الوطنية العراقية وظيفتها في تطوير neuroepithelia بما في شبكية العين 9، 11، 12، 13. ومع ذلك، فإن الآليات التي تحكم الحركة الوطنية العراقية في الكبار تجديد شبكية العين لم تدرس في الكثير من التفاصيلسوف XREF "> 6 و 7. التصوير حية على خلية يكون نهجا لا تقدر بثمن للمضي قدما معرفتنا مسارات الإشارات التي تتحكم في الحركة الوطنية العراقية في الكبار تجديد شبكية العين.

حتى وقت قريب، والتصوير الخلية الحية من الحركة الوطنية العراقية في شبكية العين كان محدودا إما الأجنة الزرد حية أو إلى كتكوت الجنينية أو الماوس بعد الولادة إإكسبلنتس الشبكية 9، 10، 11، 12، 14، 15، 16. في حين استخدمت إإكسبلنتس الشبكية من الحيوانات البالغة من مجموعة متنوعة من الأنواع بما في ذلك الجرذان والفئران والزرد لخلية مختلفة النهج البيولوجية 17، 18، 19، 20، تجارب التصوير الخلية الحية باستخدام إإكسبلنتس الشبكية هكتارلقد تم يقتصر على اطلاع فترات من الزمن والتي لم يتم تنفيذها بشكل مستمر على مدى عدة ساعات 21 و 22. هنا، نحن تصف بروتوكول مفصلة لثقافة الكبار شبكية العين الزرد التي تضررت الضوء على أداء الخلية الحية التصوير تجارب مراقبة الحركة الوطنية العراقية باستخدام متعددة الفوتون المجهري 6. النهج التصوير الخلية الحية هي مفيدة على الطرق المناعية عند التحقيق في آليات السيطرة على الحركة الوطنية العراقية، وديناميات الحركة الوطنية العراقية، على سبيل المثال، قد تتأثر سرعات بدلا من موقع الانقسام، والتي من المحتمل أن لا يتم الكشف عن استخدام مناعية.

في المستقبل، وهذه الطريقة أيضا لديه القدرة على أن يتم تعديل لدراسة العمليات الحيوية الأخرى أثناء تجديد شبكية العين، مثل البلعمة الموت خلايا مستقبلة للضوء عن طريق مولر الدبقية أو سلوك الخلايا الدبقية الصغيرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: أثيرت الزرد والمحافظة عليها في مرفق نوتردام الزرد في مركز علوم الحياة في Freimann. تمت الموافقة على الطرق الموضحة في هذه المخطوطة من جامعة نوتردام رعاية الحيوان واستخدام اللجنة وتكون في الامتثال لبيان لاستخدام الحيوانات في البحوث الرؤية من قبل جمعية البحوث في الرؤية والعيون.

1. حلول

  1. إعداد 70٪ من الإيثانول لتعقيم هود زراعة الأنسجة وأية معدات / الكواشف التي يتم نقلها إلى غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة.
  2. إضافة 2 مل من 2 فينوكسييثانول إلى 1 لتر من الماء النظام (1: 500 2-فينوكسييثانول).
  3. إعداد 0.1 مم NaHCO 3، ودرجة الحموضة 8.0. استخدام 10 مل حقنة و 0.2 ميكرون تصفية-حجم المسام حقنة لتعقيم الحل في نسيج الثقافة هود تعقيمها.
    ملاحظة: NaHCO 3 يستخدم لنشر كفاءة الخلية والأنسجة لاصقة على سطح ساترة من fluorodishes (انظرالخطوة 3.2).
  4. تحضير 1.0 M CaCl 2 و 1.0 M MgCl 2. تعقيم مع حقنة 10 مل و 0.2 ميكرومتر حجم المسام تصفية حقنة في نسيج الثقافة هود تعقيمها.
  5. لإعداد Hank's متوازن محلول الملح (HBSS)، إضافة العقيمة CaCl 2 ومعقمة MgCl 2 ل1X HBSS دون الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+، دون أحمر الفينول بتركيز نهائي من 1 ملم لكل منهما. العمل في بيئة معقمة.
  6. لإعداد مستنبت، مزيج 50٪ 1X الحد الأدنى الضروري المتوسطة (MEM) دون الفينول الأحمر، و 25٪ HBSS تحتوي على CaCl 2 و MgCl 2 (انظر القسم 1.4)، و 25٪ الحصان المصل (HS)، و 10 وحدة / مل البنسلين، و 10 ميكروغرام / مل الستربتومايسين. العمل في بيئة معقمة.
    ملاحظة: تجنب المتوسط ​​تحتوي على الفينول الأحمر كما autofluoresces، مما يؤثر إشارة إلى نسب الضوضاء. 23
  7. إعداد 10 مل من 1٪ انصهار منخفضة الاغاروز نقطة في 1X MEM دون الفينول الأحمر. تذوب الاغاروز / 1X MEM باستخدام أفران الميكرافي. إعداد كميات صغيرة من الاغاروز (على سبيل المثال، 10 مل)، وإعادة تسخين المتكررة سوف يتغير تركيز أيون بسبب تبخر السوائل.
  8. قبل زراعة، وتعقيم 1.5 مل أنابيب microcentrifuge قبل التعقيم.

2. الضرر ضوء النموذج

  1. داكنة التكيف
    1. ضع 2-3 تيراغرام [GFAP: nGFP] mi2004 الزرد (أو غيرها من الزرد المعدلة وراثيا من الفائدة) في 6-14 شهرا من العمر في بيئة خالية من ضوء لمدة 14 د. لمزيد من التفاصيل انظر المرجع 2، 6، 24، 25.
  2. وضع خزان يحتوي على 2-3-تكييفها الظلام الزرد المعدلة وراثيا في المياه النظام بين اثنين من مصابيح الفلورسنت التي تنبعث منها ضوء 2800 لوكس 2 و 6 و 24 و 25.
  3. كشف الزرد للضوء الشديد المستمر لمدة 35 ساعة. خلال التعرض للضوء، وضمان أن يتم الحفاظ على درجة حرارة الماء بين 31-33 درجة مئوية.

3. إعداد لالتثقيف (على يوم من عزل الشبكية)

  1. باستخدام الايثانول 70٪، وتعقيم هود زراعة الأنسجة ومكونات / الأدوات التي يتم تحويلها إلى غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة (على سبيل المثال، قوارير تحتوي على MEM وHBSS، الماصات، نصائح ماصة معقمة، الخ.).
  2. إعداد fluorodishes
    1. معطف fluorodish واحد لكل شبكية العين مع الخلايا والأنسجة لاصق (انظر الجدول المواد).
    2. تمييع لاصقة الخلايا والأنسجة في 0.1 مم NaHCO 3 إلى تركيز النهائي من 70 ميكروغرام / مل، إضافة 50 ميكرولتر من كل fluorodish ونشر الحل عبر وسط fluorodish مع 200 ميكرولتر ماصة (تقريبا 1 - 1.2 سم قطر ).
    3. احتضان fluorodishes المغلفة لل1-3 ساعة عند RT؛ (بدلا من ذلك، واحتضان O / N عند 4 درجة مئوية).
    4. إزالة الحل وشطف 3X مع 500 ميكرولتر من 1X MEM عن كل غسل. لتجنب fluorodishes المغلفة من الجفاف، والحفاظ عليها في MEM حتى هي التي شنت إإكسبلنتس الشبكية.
  3. إعداد مستنبت كما هو موضح في الخطوة 1.6. مستنبت يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 1 في الاسبوع في 4 درجات مئوية.

4. عزل والتثقيف من إإكسبلنتس الشبكية

ملاحظة: بروتوكول المبينة أدناه هي لعزل الشبكية الظهرية، وهي المنطقة الشبكية التي lesioned في الغالب من قبل وصف نموذج-اضرار طفيفة. لذلك، الناجم عن الضرر انتشار والحدث المرتبطة الهجرة النووية interkinetic تحدث في شبكية العين الظهرية. ومع ذلك، فإن إجراء العزل يمكن تعديلها لتسفر عن المناطق الشبكية وفقا لمتطلبات محددة من السؤال الباحث / البحوث.

  1. الموت ببطء واحدة تلف خفيف المعدلة وراثيا الزرد لالوقت تا في 1: 500 2-فينوكسييثانول.
  2. إزالة MEM من fluorodish واحد مع ماصة 1000 ميكرولتر ذلك أنه ليس هناك سوى طبقة رقيقة من بقايا السوائل.
  3. نقل الزرد على منشفة ورقية جافة، وإزالة العين مع زوج المنحني من ملقط دومون (ملقط # 5، 45 درجة زاوية) ونقله على fluorodish.
  4. باستخدام مجهر تشريحي، توجيه العين مع التلميذ على زلة غطاء fluorodish بحيث الجزء الخلفي من العين مع العصب البصري مرئيا (الشكل 1D).
  5. مع زوج من مقص ماكفرسون-Vannas إزالة العصب البصري، وقطع بالقرب من الجزء الخلفي من العين. وبالإضافة إلى ذلك، إزالة النسيج الضام بطانة خارج العين.
  6. عقد العين بين الأنف والجانب الزمني مع زوج من ملقط # 5 في حين جعل شق في القصبة البصرية التي خارقة مع واحد شفرة المقص من خلال المصفوية الصفيحة وقطع على طول كل من الأنف وجانبي الزمنية للعين (انظر الشكل 1E ، لي مجزأةشمال شرق).
  7. باستخدام اثنين من أزواج من ملقط # 5، واحد لعقد الجانب الظهري من شبكية العين والزوج الآخر لفصل بطني من شبكية العين الظهرية، وسحب الأنسجة.
    ملاحظة: ينصح لتوجيه شبكية العين الظهرية بحيث العدسة وطبقة الخلايا العقدية تواجه ساترة بينما يواجه الصلبة صعودا.
  8. إزالة الصلبة من شبكية العين الظهرية مع زوج واحد من ملقط # 5، في حين الضغط على العدسة التي يتصل بها شبكية العين مع الزوج الثاني من ملقط # 5 (الشكل 1H، I).
  9. لإزالة العدسة، واستخدام مقص ماكفرسون-Vannas وقطع راء العدسة دون الإضرار شبكية العين (الشكل 1I، J). في بعض الأحيان، تفصل عدسة في الخطوة 4.7. في هذه الحالة، وإزالة الصلبة بعناية مع ملقط من خلال عقد شبكية العين في خفض الحافة مع الزوج الثاني من ملقط # 5.
  10. إزالة الجسم الزجاجي أثناء إزالة العدسة دون الإضرار شبكية العين. لشد شبكية العين مع طبقة الخلايا العقدية التي تواجه انزلاق الغطاء من fluorodish (الشكل 1L، M).
  11. تحيط شبكية العين مع 10 ميكرولتر من 1٪ انخفاض نقطة انصهاره الاغاروز والسماح للالاغاروز يصلب.
  12. ووتش إن الاغاروز السائل لا رفع شبكية العين حتى على ارتفاع طفيف قد تؤثر على القدرة على التركيز عميقا في الأنسجة. إذا لوحظ رفع، واستخدام ماصة لإزالة الاغاروز. السماح مجموعة الاغاروز المتبقية قبل محاولة إضافة المزيد.
  13. كرر الخطوة 4.12 عدة مرات قبل أن يضيف 1٪ انخفاض نقطة انصهاره الاغاروز لتغطية fluorodish كامل. مرة واحدة وقد عززت الاغاروز، إضافة 1.5 مل الثقافة المتوسطة.
  14. الحفاظ على ثقافة يزدرع الشبكية في CO 2 بيئة / الهواء 5٪ التي وضعت في 32 درجة مئوية لمدة حوالي 12 ساعة للسماح للشبكية العين للتعافي من الإجهاد التي تكبدتها إجراء العزل. ضبط درجة الحرارة إلى 32 درجة مئوية للحفاظ على شبكية العين في نفس درجة حرارة الزرد تعامل خفيفة (راجع الخطوة 2.3).

5. Multiphoton المجهر

الصورة = "jove_content"> ملاحظة: تم ضبط التجارب التي أجريت في هذا المخطوط لالمجهر multiphoton مجهزة بأشعة الليزر تحت الحمراء (انظر الجدول المواد)، مسافة طويلة الهدف الغمر بالماء 40X آبو (NA 1.15)، ماسح ضوئي الجلفانومتر و غرفة البيئية التي تحتوي على إدراج لمدة أربعة 35 ملم أطباق بتري. تم الحصول على الصور مع كاشف غير descanned (R-NDD).

  1. قبل التصوير، تتوازن الغرفة البيئية لتحقيق 5٪ CO 2 الغلاف الجوي / الهواء. تأكد من أن يتم إدراج أطباق بتري فارغة في حامل لتجنب تسرب الغاز في الغرفة.
  2. تشغيل نظام المجهر.
  3. مرة واحدة يتم معايرتها الغرفة البيئية، إضافة الانكسار السائل مؤشر على 40X آبو مسافات طويلة الهدف الغمر بالماء (NA 1.15).
    ملاحظة: السائل معامل الانكسار مع الخصائص البصرية مماثلة لمياه يستخدم لتجنب تبخر الماء أثناء التصوير على المدى الطويل.
  4. انفلونزا مكانorodishes مع إإكسبلنتس الشبكية في الغرفة. باستخدام ضوء brightfield، ضع العينة في مسار الضوء وتقديم midregion من شبكية العين الظهرية في الطائرة من التركيز.
  5. استخدام GFP الضوء epifluorescent التركيز على GFAP: nGFP -positive مولر الدبقية النوى (الشكل 2A، C).
    ملاحظة: إذا لم يتم تحميل إإكسبلنتس شقة أو تراكمت الاغاروز تحت يزدرع، سيكون من الصعب التركيز على GFAP: nGFP نوى -positive أو أنها سوف يتألق بشكل خافت.
    1. تحقق ما إذا كان الانتقال إلى منطقة أخرى داخل نفس يزدرع الشبكية سوف تغلب على مسألة التركيز. نقل ذلك إلى يزدرع الشبكية مختلفة.
  6. في البرنامج الحصول على الصور، افتح "A1 النائب واجهة المستخدم الرسومية"، و "TiPad"، و "A1 المدمجة واجهة المستخدم الرسومية" و "حيازة ND 'ويندوز. للتصوير multiphoton، تأكد من أن خيار "الأشعة تحت الحمراء NDD" يتم اختياره في 'A1 المدمجة واجهة المستخدم الرسومية.
  7. في 'settinز "الحقل، حدد IR-DM للشارع مرآة 1 مزدوج اللون واختيار تمرير مرشح الفرقة 525/50 للحصول على GFP مضان.
  8. التبديل على يزر الأشعة تحت الحمراء في الإطار المسمى "A1MP واجهة المستخدم الرسومية. وسوف يستغرق بضع دقائق ليزر ليكون جاهزا. تعيين الطول الموجي 910 نانومتر لإثارة GFP مضان، ومحاذاة الليزر عن طريق النقر على زر 'محاذاة السيارات "في نافذة" A1 النائب واجهة المستخدم الرسومية.
  9. تأكد من أن الغرفة والمعدات الأضواء مغلقا أو تغطيتها قبل فتح مصراع في 'A1 النائب واجهة المستخدم الرسومية "لتجنب التعرض المفرط للأنبوب مضخم. للحد من مستويات الضجيج، وإيواء المجهر في بيئة مظلمة.
  10. الحصول على صور من مجال الرؤية من 300 × 300 بكسل، في التكبير من اثنين، ووقت بكسل مسكن 4.8 ميكرو ثانية / بكسل. وضع تقريبا تصل قوة الليزر عن طريق تغيير "منطقة الاستحواذ" في سياق "A1MP واجهة المستخدم الرسومية" والزيادة في نافذة "A1 المدمجة واجهة المستخدم الرسومية.
  11. إعداد ض المكدس
    1. التركيز على طبقة الخلايا العقدية لضبط البؤري العليا للض المكدس في 'z'-النافذة الفرعية داخل "نافذة اكتساب ND. بعض GFAP: nGFP خلايا -positive تقع عادة في طبقة الخلايا العقدية، مما يساعد على تحديد الحد القاعدية من شبكية العين (الشكل 2A، D).
    2. نقل البؤري من خلال مستوى ONL (الشكل 2A، B)، والتي تتميز بوجود GFAP المسمى خافت: nGFP خلايا -positive التي هي المستديرة وتضخم بالنسبة لنظرائهم في INL (الشكل 2A، C) .
    3. تعيين هذه الطائرة كما أسفل ض المكدس. تأكد من أن ONL بأكمله سيتم تصوير (الشكل 2A، B).
    4. عندما تعاني من نوبات البؤري التي تتطلب إعادة ضبط خلال فترة التصوير، انقر نقرا مزدوجا فوق على موقف وسط في النافذة الفرعية 'ض' لتعيين أنها موقف "الوطن". التغيير إلى "وضع متماثل تعريف"وانقر على 'قريب'.
    5. تعيين حجم ض خطوة بين 0،7-1 ميكرون.
  12. تصحيح Z-كثافة:
    1. تطبيق التصحيحات ض كثافة للتعويض عن فقدان كثافة بكسل بسبب تشتت الضوء عند التصوير في الطبقات العميقة من الأنسجة.
    2. لإعداد التصحيح، فتح النافذة "تصحيح ض كثافة. لتعيين "مجموعة ض المكدس"، واختر "من ND.
    3. انقر على طائرة الوصل السفلي في الإطار "تصحيح ض شدة" (في هذه الحالة، يتوافق مع طبقة الخلايا العقدية) وتعيين كثافة الليزر ( 'منطقة الاستحواذ "في سياق" A1MP واجهة المستخدم الرسومية') وزيادة (A1 واجهة المستخدم الرسومية المدمجة ).
    4. انقر فوق السهم بجانب 'ض القيم "في نافذة" تصحيح ض كثافة "لتأكيد الإعدادات التي تظهر لاحقا تحت عنوان" إعدادات الجهاز "في نافذة" تصحيح ض كثافة "لطائرة التنسيق الذي تم اختياره.
    5. كرر العملية لوالمتوسطةأعلى طائرات الثانية، وزيادة قوة الليزر والكسب. ويمكن أن يضاف طائرات التنسيق إضافية إذا لزم الأمر. انظر الجدول رقم 1 لضبط الليزر وتحقيق مكاسب محددة لإجراء التجارب في أرقام 2-4.
    6. تعيين "منطقة الاستحواذ" في نافذة "A1 النائب واجهة المستخدم الرسومية. تجنب اختيار منطقة اكتساب أكبر من 15، وكسب أعلى من 126 في بداية التصوير للتحايل على photobleaching من وزيادة مستويات الضوضاء.
      ملاحظة: باسم الليزر وأنابيب مضخم تختلف بين أنظمة الفحص المجهري، اختبار الليزر وإعدادات مكسب للحصول على ظروف التصوير الأمثل للمجهر اقامة مع تجنب photobleaching من.
    7. اختيار "تصحيح كثافة النسبي" في نافذة "تصحيح ض كثافة.
  13. في النافذة الفرعية "متسلسلة زمنية" في نافذة "ND الاستحواذ، وضع لمدة 8 ساعات والفاصل إلى 'أي تأخير". بعد ذلك، تأكد من النقر فوق "تشغيل ض تصحيح" في تيانه ض المكدس "نافذة فرعية في زر النافذة" ND الاستحواذ "لاكتساب متسلسلة زمنية 3-D.
  14. الحفاظ على إإكسبلنتس الشبكية عند درجة حرارة من 27-29 درجة مئوية طوال مدة الحصول على الصور.
  15. طوال فترة الحصول على الصور، إذا لزم الأمر، إعادة ضبط مستوى الطاقة وزيادة من أجل الحفاظ على جودة الصورة لتحليل ما بعد التصوير. لإجراء تعديلات تنفيذ الخطوات 5.11.2 - 5.11.4.
  16. إذا كانت التحولات البؤري، وقفة أو وقف تشغيل وتنفيذ الخطوة 5.11 ثانية.
    ملاحظة: إذا تم اختيار "النسبي ض تصحيح" في خطوة 5.12.7 وأجريت خطوة 5.11.4 يجب أن لا يكون من الضروري لتعديل مستويات السلطة والمكاسب، إلا إذا حدث photobleaching من واسع النطاق.

6. تحليل سرعة

  1. استخراج الوقت، ووضع "المنطقة من الفوائد" على الصورة. استخدام 'الوقت قياس "أداة وتصدير قيم الوقت إلى جدول بيانات.
  2. اقتصاص المنطقة التي تحتوي على ديviding GFAP: nGFP نواة -positive.
  3. اختيار المنطقة المزروعة بحيث يحتوي على نواة واحدة على الأقل أن لا يخضع الحركة الوطنية العراقية من أجل وضع نقطة مرجعية لقياس بعد المسافات التي نواة الفاصل هاجرت فيما يتعلق INL القاعدية. ملاحظة: لاختيار نواة الذي يبقى في INL القاعدية، فإنه يساعد على إعداد إعادة الإعمار 3-D من متسلسلة زمنية.
  4. بدلا من ذلك، إذا كان GFAP: لوحظ nGFP خلية -positive في ONL طوال فترة الاستحواذ، استخدم خط عمودي من طول ثابت تمتد من نواة ONL إلى INL القاعدية من أجل تحديد نقطة مرجعية.
  5. باستخدام وظيفة "إظهار شرائح"، وتوليد توقعات المتعامدة. وفي وقت لاحق، وتغيير الوضع من "شريحة" إلى "أقصى الإسقاط كثافة.
  6. إيقاف "س ص" ضوء أقصى الإسقاط المتعامد. اعتمادا على التوجه الذي المهاجرة / تقسيم نواة هي أفضل وضوحا، وهويسوتو إيقاف إما "xz'- أو" الرؤية yz'.
  7. انقر على الصورة المتبقية مع زر الفأرة الأيمن واستخراج 'XZ' أو 'سلسلة yz' صورة مع' وظيفة خلق وثيقة جديدة من وجهة النظر هذه. إذا لزم الأمر، وتناوب الصورة.
  8. باستخدام وظيفة "قياس دليل، رسم خط أفقي عبر الصورة في المستوى السفلي للنواة أن يبقى في INL القاعدية ولا يخضع الحركة الوطنية العراقية (= نقطة مرجعية، الشكل 4A - E، خط أفقي أحمر).
  9. قياس المسافة بين خط المرجعية ونقطة القاعدية من نواة المهاجرة لمتسلسلة زمنية باستخدام أداة "قياس خط" في برامج التحليل (انظر الشكل 4A - E).
  10. مرة واحدة يكسر الغلاف النووي أسفل، وقياس موقف القاعدية من سوما إذا كان التعرف بعد نشر GFP في الخلية بأكملها.
  11. باستخدام برنامج جداول البيانات، مؤامرة من مسافة نوهاجر cleus ضد مرور الوقت (الشكل 4F).
    1. لتحديد سرعة قمي الهجرة (الخامس)، سافر الرسم البياني المسافات لفترة ما قبل انهيار الغلاف النووي يحدث (الشكل 4G).
    2. حدد سلسلة البيانات ضمن المخطط، انقر بزر الماوس الأيمن في الماوس ولإدراج منحنى الانحدار الخطي بما في ذلك وظيفة المقابلة "ص = م × + ج. المنحدر 'م' في وظيفة يمثل سرعة، والخامس على (الشكل 4G).
    3. كرر الخطوات 6.11.1 و 6.11.2 للمرحلة الأولى من الهجرة القاعدية السريع لتحديد سرعة الهجرة القاعدية، والخامس ب (الشكل 4H).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عزلة شبكية العين وفقا للإجراءات المبينة في التخطيطي في الشكل 1 يسمح للزراعة من شبكية العين الظهرية بالارض من أضرار خفيفة الكبار تيراغرام [GFAP: nGFP] mi2004 الزرد خلال فترة لا تقل عن 24 ساعة في 5٪ CO 2 / بيئة الهواء. هذه إإكسبلنتس الشبكية شنت مسطحة يمكن استخدامها لطائرات التنسيق صورة في مستويات الأنسجة العميقة. مثال على ذلك هو مولر الدبقية / العصبية نواة خلية سلفية المسمى مع GFP من مولر الدبقية محددة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

دراسات التحقيق في الآليات التي تحكم تجديد الكبار التالفة شبكية العين الزرد الطرق في الغالب تستخدم immunocytochemical 5، 25، 26، 27، 28، 29، 30. تهيئة الظروف الملائمة لثقافة إإكسبلنتس الشبكية وأداء التصوير الخلية الحية على الظواهر، مثل الحركة الوطنية ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

ونحن نقدر الدعم المقدم من قبل ويليام آرتشر ومرفق نوتردام المتكاملة التصوير. وتوجه بشكر خاص إلى الفنيين في Freimann علوم الحياة لمساعدة مستمرة ورعاية وتربية من الزرد. وأيد هذه الدراسة من المنح المقدمة من المعهد الوطني للعيون من المعاهد الوطنية للصحة لDRH (R01-EY018417، R01-EY024519) ومركز بحوث اسماك الزرد، جامعة نوتردام، نوتردام، IN.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
ملقط دومون # 5أدوات الدقة العالمية14098
ملقط دومون # 5 ، 45 درجة ؛ زاويةأدوات الدقة العالمية14101
مقص ماكفرسون فاناسالدقة العالمية501233
الفلورديشأدوات الدقة العالميةFD35-100
المجهرالمجسم نيكون سيعمل نوع مماثل من المجهر المجسمSMZ-1B
نوع خزانة السلامة البيولوجية من النوع A2Labconcoالمكافئ سيعمل
حاضنة زراعة الأنسجةسيعمل النوع المكافئHEPA من الفئة 100سيعمل
الفلورسنت سيلفانيا OSFP5835HOECOBulbtronics31850
0.2 & micro ؛ م مرشح حقنة Acrodisc بحجمالمسام VWR4192
10 مل حقنة Luer-lokVWRBD309604
60 مل حقنة Luer-lokVWRBD309653
NaHCO3< / sub>FischerScientificS233-500
CaCl2< / sub>ThermoScientificC79-500
MgCl2EMD Millipore5980
HBSS بدون Ca2 + < / sup> / Mg2 + < / sup> ، بدون فينول أحمر ، GibcoThermoScientific14175-095
MEM بدون فينول أحمر ، GibcoThermoScientific5100-038
مصل الحصان ، معطل بالحرارةThermoScientific26050-070
البنسلين / الستربتومايسينVWR16777-164
نقطة انصهار منخفضة فائقة النقاء أغاروزThermoScientific16520-100
إيثانول ، مطلقThermoScientificBP2818-4
2-phenoxyethanolSigma77699
خلية Corning Cell-Tak لاصقة الأنسجة   ؛VWR354240
سائل معامل الانكسار Cargille Lab1803Y
Nikon A1 متعدد الفوتون المجهز بنظام مكافئ ليزر مايتاي بالأشعة تحت الحمراءمن نيكون
40X Apo بهدف الغمر في الماء لمسافات طويلة (NA 1.15)
الغرفة البيئية المجهزة بإدراج لنظام مكافئ 35 مم من PetridishOkolabسيعمل
برنامجتحليل NISنيكون
أدوات على مصابيح سيعمل مجهر

المراجع

  1. Fausett, B. V., Goldman, D. A role for alpha1 tubulin-expressing Muller glia in regeneration of the injured zebrafish retina. J.Neurosci. 26 (23), 6303-6313 (2006).
  2. Kassen, S. C., et al. Time course analysis of gene expression during light-induced photoreceptor cell death and regeneration in albino zebrafish. Dev.Neurobiol. 67 (8), 1009-1031 (2007).
  3. Vihtelic, T. S., Hyde, D. R. Light-induced rod and cone cell death and regeneration in the adult albino zebrafish (Danio rerio) retina. J.Neurobiol. 44 (3), 289-307 (2000).
  4. Bernardos, R. L., Barthel, L. K., Meyers, J. R., Raymond, P. A. Late-stage neuronal progenitors in the retina are radial Muller glia that function as retinal stem cells. J.Neurosci. 27 (26), 7028-7040 (2007).
  5. Nelson, C. M., Ackerman, K. M., O'Hayer, P., Bailey, T. J., Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Tumor necrosis factor-alpha is produced by dying retinal neurons and is required for Muller glia proliferation during zebrafish retinal regeneration. J.Neurosci. 33 (15), 6524-6539 (2013).
  6. Lahne, M., Li, J., Marton, R. M., Hyde, D. R. Actin-Cytoskeleton- and Rock-Mediated INM Are Required for Photoreceptor Regeneration in the Adult Zebrafish Retina. J.Neurosci. 35 (47), 15612-15634 (2015).
  7. Nagashima, M., Barthel, L. K., Raymond, P. A. A self-renewing division of zebrafish Muller glial cells generates neuronal progenitors that require N-cadherin to regenerate retinal neurons. Development. 140 (22), 4510-4521 (2013).
  8. Sauer, M. E., Walker, B. E. Radioautographic study of interkinetic nuclear migration in the neural tube. Proc.Soc.Exp.Biol.Med. 101 (3), 557-560 (1959).
  9. Pearson, R. A., Luneborg, N. L., Becker, D. L., Mobbs, P. Gap junctions modulate interkinetic nuclear movement in retinal progenitor cells. J.Neurosci. 25 (46), 10803-10814 (2005).
  10. Baye, L. M., Link, B. A. Interkinetic nuclear migration and the selection of neurogenic cell divisions during vertebrate retinogenesis. J.Neurosci. 27 (38), 10143-10152 (2007).
  11. Del Bene, F., Wehman, A. M., Link, B. A., Baier, H. Regulation of neurogenesis by interkinetic nuclear migration through an apical-basal notch gradient. Cell. 134 (6), 1055-1065 (2008).
  12. Norden, C., Young, S., Link, B. A., Harris, W. A. Actomyosin is the main driver of interkinetic nuclear migration in the retina. Cell. 138 (6), 1195-1208 (2009).
  13. Becker, D. L., et al. Multiphoton imaging of chick retinal development in relation to gap junctional communication. J.Physiol. 585 (Pt 3), 711-719 (2007).
  14. Surzenko, N., Crowl, T., Bachleda, A., Langer, L., Pevny, L. SOX2 maintains the quiescent progenitor cell state of postnatal retinal Muller glia. Development. 140 (7), 1445-1456 (2013).
  15. Nickerson, P. E., et al. Live imaging and analysis of postnatal mouse retinal development. BMC Dev.Biol. 13, 24(2013).
  16. Suzuki, S. C., Bleckert, A., Williams, P. R., Takechi, M., Kawamura, S., Wong, R. O. Cone photoreceptor types in zebrafish are generated by symmetric terminal divisions of dedicated precursors. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A. 110 (37), 15109-15114 (2013).
  17. Johnson, T. V., Martin, K. R. Development and characterization of an adult retinal explant organotypic tissue culture system as an in vitro intraocular stem cell transplantation model. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (8), 3503-3512 (2008).
  18. Bull, N. D., Johnson, T. V., Welsapar, G., DeKorver, N. W., Tomarev, S. I., Martin, K. R. Use of an adult rat retinal explant model for screening of potential retinal ganglion cell neuroprotective therapies. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 52 (6), 3309-3320 (2011).
  19. Kustermann, S., Schmid, S., Biehlmaier, O., Kohler, K. Survival, excitability, and transfection of retinal neurons in an organotypic culture of mature zebrafish retina. Cell Tissue Res. 332 (2), 195-209 (2008).
  20. Williams, P. R., Morgan, J. L., Kerschensteiner, D., Wong, R. O. In vitro imaging of retinal whole mounts. Cold Spring Harb Protoc. 2013, (2013).
  21. Johnson, T. V., Oglesby, E. N., Steinhart, M. R., Cone-Kimball, E., Jefferys, J., Quigley, H. A. Time-Lapse Retinal Ganglion Cell Dendritic Field Degeneration Imaged in Organotypic Retinal Explant Culture. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 57 (1), 253-264 (2016).
  22. Roehlecke, C., Schumann, U., Ader, M., Knels, L., Funk, R. H. Influence of blue light on photoreceptors in a live retinal explant system. Mol.Vis. 17, 876-884 (2011).
  23. Coutu, D. L., Schroeder, T. Probing cellular processes by long-term live imaging--historic problems and current solutions. J.Cell.Sci. 126 (Pt 17), 3805-3815 (2013).
  24. Thomas, J. L., Thummel, R. A novel light damage paradigm for use in retinal regeneration studies in adult zebrafish. J.Vis.Exp. 80, e51017(2013).
  25. Conner, C., Ackerman, K. M., Lahne, M., Hobgood, J. S., Hyde, D. R. Repressing notch signaling and expressing TNFalpha are sufficient to mimic retinal regeneration by inducing Muller glial proliferation to generate committed progenitor cells. J.Neurosci. 34 (43), 14403-14419 (2014).
  26. Nelson, C. M., Gorsuch, R. A., Bailey, T. J., Ackerman, K. M., Kassen, S. C., Hyde, D. R. Stat3 defines three populations of Muller glia and is required for initiating maximal muller glia proliferation in the regenerating zebrafish retina. J.Comp.Neurol. 520 (18), 4294-4311 (2012).
  27. Gorsuch, R. A., Hyde, D. R. Regulation of Muller glial dependent neuronal regeneration in the damaged adult zebrafish retina. Exp.Eye Res. 123, 131-140 (2014).
  28. Zhao, X. F., Wan, J., Powell, C., Ramachandran, R., Myers, M. G., Goldman, D. Leptin and IL-6 family cytokines synergize to stimulate Muller glia reprogramming and retina regeneration. Cell.Rep. 9 (1), 272-284 (2014).
  29. Wan, J., Ramachandran, R., Goldman, D. HB-EGF is necessary and sufficient for Muller glia dedifferentiation and retina regeneration. Dev.Cell. 22 (2), 334-347 (2012).
  30. Lenkowski, J. R., et al. Retinal regeneration in adult zebrafish requires regulation of TGFbeta signaling. Glia. 61 (10), 1687-1697 (2013).
  31. Weber, I. P., Ramos, A. P., Strzyz, P. J., Leung, L. C., Young, S., Norden, C. Mitotic position and morphology of committed precursor cells in the zebrafish retina adapt to architectural changes upon tissue maturation. Cell.Rep. 7 (2), 386-397 (2014).
  32. Magidson, V., Khodjakov, A. Circumventing photodamage in live-cell microscopy. Methods Cell Biol. 114, 545-560 (2013).
  33. Bailey, T. J., Fossum, S. L., Fimbel, S. M., Montgomery, J. E., Hyde, D. R. The inhibitor of phagocytosis, O-phospho-L-serine, suppresses Muller glia proliferation and cone cell regeneration in the light-damaged zebrafish retina. Exp.Eye Res. 91 (5), 601-612 (2010).
  34. Lee, J. E., Liang, K. J., Fariss, R. N., Wong, W. T. Ex vivo dynamic imaging of retinal microglia using time-lapse confocal microscopy. Invest.Ophthalmol.Vis.Sci. 49 (9), 4169-4176 (2008).
  35. Zhao, L., et al. Microglial phagocytosis of living photoreceptors contributes to inherited retinal degeneration. EMBO Mol.Med. 7 (9), 1179-1197 (2015).
  36. Peri, F., Nusslein-Volhard, C. Live imaging of neuronal degradation by microglia reveals a role for v0-ATPase a1 in phagosomal fusion in vivo. Cell. 133 (5), 916-927 (2008).
  37. Morsch, M., et al. In vivo characterization of microglial engulfment of dying neurons in the zebrafish spinal cord. Front.Cell.Neurosci. 9, 321(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الهجرة النووية البينيةاستزراع الشريحة الشبكيةشبكية سمكة الزيبراوسم GFAP:nGFPاكتساب مجموعة الصور المتراصة Z-stackالتثبيت على أطباق FluoroDishالطمر في الأجاروزقياس السرعة
ثقافة الكبار المعدلة وراثيا الزرد الشبكية إإكسبلنتس التصوير خلية حية من قبل Multiphoton المجهر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.