Method Article

تحليل نوعي وكمي المشبك محصنة في النظام البشري باستخدام التصوير التدفق الخلوي

DOI:

10.3791/55345

⸱

January 7th, 2019

 ,  , 
1Institute of Immunology, Section Molecular Immunology, University of Heidelberg

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهنا يصف لنا سير عمل كاملة للتحليل النوعي والكمي مأمن نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا البشرية الأولية وتقديم مستضد الخلايا. ويستند الأسلوب التصوير التدفق الخلوي، التي تسمح باكتساب وتقييم عدة آلاف خلية الصور خلال فترة قصيرة نسبيا من الزمن.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المشبك المناعي هو مجال الاتصال بين خلايا T وخلايا مستضد-عرض (Apc). استقطاب خلايا تي مستقبلات سطحية والبروتينات نحو المشبك المناعي لضمان ربط مستقرة وتبادل الإشارات. وقد استخدمت مجهرية [كنفوكل]، TIRF، أو دقة فائقة الكلاسيكية لدراسة المشبك محصنة. منذ هذه الأساليب تتطلب الحصول على دليل الصور والقياس الكمي تستغرق وقتاً طويلاً، تصوير الأحداث النادرة الصعبة. هنا، يمكننا وصف سير عمل التي تمكن من تحليل الخصائص المورفولوجية لعشرات آلاف خلايا. هي الناجم عن الاشتباكات العصبية المناعية بين خلايا تي البشرية الأولية في الأعمال التحضيرية لعموم-الكريات البيض وخلايا راجي محملة ب سيب معوي المكوّرات العنقودية الذهبية كناقلات الجنود المدرعة. يتم الحصول على الصور بالتصوير التدفق الخلوي، وتسمى أيضا الفحص المجهري في التدفق، الذي يجمع بين ميزات cytometer تدفق ومجهر الأسفار. تقدم استراتيجية النابضة كاملة لتحديد الخلية T/APC الأزواج وتحليل الاشتباكات العصبية المناعية. كما يقوم سير العمل هذا يسمح تحليل المناعة synapses في الأعمال التحضيرية لعموم أونبوريفيد-الكريات البيض ومن ثم يتطلب سوى كمية صغيرة من الدم (أي، 1 مل)، فإنه يمكن تطبيقها على عينات من المرضى. الأهم من ذلك، عدة عينات يمكن أعدت، وقياسها، وتحليلها بالتوازي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا T المنظمين الرئيسية في الجهاز المناعي التكيفي ويتم تنشيطها عن طريق الببتيدات مستضدي التي ترد في سياق مجمعات histocompatibility الرئيسية (MHC). يتطلب التنشيط تي خلية كاملة إشارتين، إشارة الكفاءة عن طريق مستقبلات تي خلية محددة مستضد (تكر)/CD3 المعقدة وإشارة كوستيمولاتوري عن طريق مستقبلات التبعي. كلا إشارات يتم إنشاؤها من خلال التفاعل المباشر للخلايا T مع عرض مستضد الخلايا (Apc). ناقلات الجنود المدرعة ناضجة توفر إشارة اختصاص لتنشيط تي خلية عن طريق المجمعات MHC-الببتيد، ويعربون عن يغاندس كوستيمولاتوري (مثل، CD80 أو CD86) لضمان تطور تي خلية التنشيط1. واحدة من الوظائف الهامة كوستيمولاتيون هو إعادة ترتيب أكتين سيتوسكيليتون

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد عموم-الكريات البيضاء

  1. رسم 1 مل دم المحيطي من المانحين صحية (أو المريض) في حقنه هيبارينيزيد. تأكد من الحصول على موافقة لجنة الأخلاقيات المسؤولة للتبرع بالدم.
  2. الدم مع 30 مل من ACK تحلل المخزن المؤقت (4ملم 150 NH Cl و كهكو 1 مم3مم 0.1 يدتا، pH 7.0) في أنبوب 50 مل مل 1 مزيج من الأجهزة الطرفية البشرية واحتضان لمدة 8 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. ملء الأنابيب مع برنامج تلفزيوني وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ز للحد الأدنى 6 Aspirate المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 30 مل من ACK تحلل المخزن المؤقت.
  4. كرر الخطوات من 1.2 و 1.3 حتى المادة طافية الواضح. أخيرا، تغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني، أجهزة الطرد ال....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هدفا رئيسيا للأسلوب الموصوفة هنا هو التقدير الكمي لإثراء البروتين (مثل، واكتين) في المشبك محصنة بين بديلة خلايا تي في عموم أونبوريفيد-الكريات البيضاء المأخوذة من عينات الدم البشري منخفضة الحجم (1 مل) وناقلات الجنود المدرعة (راجي الخلايا). لقطة للشاشة في الشكل 1 يعطي لمحة عامة عن استراتيجية النابضة حيوية لهذا الأسلوب. يظهر معرض الصور على اليسار ومجال التحليل على اليمين (الشكل 1). يظهر معرض الصور بوابة "في التركيز". الصور يصور هي أساسا المحببة واثن.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمكين سير العمل المقدمة هنا التحديد الكمي للمناعة نقاط الاشتباك العصبي بين الخلايا البشرية (السابقين فيفو) وناقلات الجنود المدرعة. جدير بالذكر أن تفكيك كرات الدم الحمراء عموم الكريات البيضاء استخدمت كمصادر تي خلية، مما يجعل خطوات تنقية تي خلية يمكن الاستغناء عنها. خط خلية سرطان الغدد الليمفاوية الخلية ب راجي بمثابة بديل ناقلات الجنود المدرعة. هذا يحمل مزايا كبيرة، نظراً لأنها تتيح المقارنات بين المتبرعين بالدم الجانب تي خلية من المشبك محصنة. علاوة على ذلك، وحدات تحكم المجال Dc ذاتي تتوفر يكاد مباشرة من الدم البشري. إنتاج.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العمل الذي كان يموله مجلس البحوث الألمانية (DFG) مع منح لا SFB-938-M و SA 393/3-4.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
>Multifuge 3 SRHeraeus
RPMI 1640LifeTechnologies# 11875085500 مل
FCSPan Biotech # 3302-P101102
البوليسترين أنبوب القاع المستديرFalcon# 3520545 مل
KulturflascheThermo Scientific# 178883
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineسيجماD8662
ألبومين مصل البقرروث# 8076.3
سابونينسيجماS7900
بارافورمالديهايدسيجما ألدريتش# 16005
FACS غسل سابونينPBS 1٪ BSA 0.15 سابونين
ReaktiosgefaBSarstedt72.699.0020.5 مل
حبةالسرعةAmnis#400041
Minishaker MS1IKA Works  MS1
MikrotiterplatteGreiner Bio One# 65010196U
Enterotoxin SEBSigma AldrichS4881
DAPISigma AldrichD95421: 3000
CD3-PeTxRInvitrogenMHCD03171:30
Phalloidin-AF647المجسات الجزيئيةA222871:150
IS100Amnisمقياس تدفق التصوير
IDEASAmnisSoftware
INSPIREAmnisSoftware

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Esensten, J. H., Helou, Y. A., Chopra, G., Weiss, A., Bluestone, J. A. CD28 Costimulation: From Mechanism to Therapy. Immunity. 44 (5), 973-988 (2016).
  2. Samstag, Y., Eibert, S. M., Klemke, M., Wabnitz, G. H. Actin cytoskeletal dynamics in T lymphocyte activation and migration. Journ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Immune SynapseImaging Flow CytometryT Cell APC ConjugatesCD3 Expression AnalysisF actin EnrichmentPan leukocyte PreparationSEB loaded Raji CellsGating StrategyProtein QuantificationHuman Blood Sample

Related Articles