مقالة منهجية

عزل الخلايا السرطانية المتداولة في نموذج الفأر المثلي لسرطان القولون والمستقيم

DOI:

10.3791/55357

⸱

يوليو 18, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Gastrointestinal, Thoracic and Vascular Surgery, Medizinische Fakultät Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 2German Cancer Consortium (DKTK), 3German Cancer Research Center (DKFZ)

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف إنشاء الأورام القولون والمستقيم مثلي عن طريق حقن الخلايا السرطانية أو أورغانويدس في الأعور من الفئران والعزلة اللاحقة من الخلايا السرطانية المتداولة (كتس) من هذا النموذج.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من مزايا سهولة تطبيق وفعالية من حيث التكلفة، ونماذج الماوس تحت الجلد لديها قيود شديدة ولا محاكاة بدقة علم الأورام الورم ونشر الخلايا السرطانية. تم إدخال نماذج الفئران المثلي للتغلب على هذه القيود؛ ومع ذلك، فإن مثل هذه النماذج تتطلب من الناحية الفنية، وخاصة في أجهزة أجوف مثل الأمعاء الكبيرة. من أجل إنتاج الأورام موحدة التي تنمو بشكل موثوق و ميتاستاسيزي، تقنيات موحدة لإعداد الخلايا السرطانية والحقن هي الحاسمة.

قمنا بتطوير نموذج الماوس مثلي من سرطان القولون والمستقيم (كرك) الذي يتطور الأورام موحدة للغاية، ويمكن استخدامها لدراسات البيولوجيا الورم وكذلك التجارب العلاجية. يتم حقن الخلايا السرطانية من أورام أولية، وخلايا الخلايا ثنائية الأبعاد (2D) أو أورغانويد ثلاثي الأبعاد (3D) في الأعور، وبناء على إمكانات النقيلي للخلايا الورم حقن، تشكل الأورام النقيلي للغاية. بالإضافة الى،يمكن العثور على كتس بانتظام. نحن هنا وصف تقنية إعداد الخلايا السرطانية من كل من خطوط الخلايا 2D و أورغانويدز 3D وكذلك الأنسجة الورم الأولية، وتقنيات الجراحية والحقن وكذلك عزل كتس من الفئران الحاملة للورم، وتقديم نصائح لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سرطان القولون والمستقيم (كرك) هو واحد من أكثر الأسباب شيوعا لوفاة السرطان في البلدان الغربية. 1 في حين أن الورم الرئيسي يمكن في كثير من الأحيان أن تقترن، وقوع الانبثاث البعيدة بشكل كبير يفاقم التكهن وغالبا ما يؤدي إلى الموت. 2 ، 3 الارتباط البيولوجي للانبثاث هو الخلايا السرطانية المتداولة (كتس)، التي فصل من الورم، والبقاء على قيد الحياة في الدورة الدموية، نعلق على ظهارة في الجهاز المستهدف، وغزو الجهاز وتنتشر في نهاية المطاف إلى آفات جديدة. 4 على الرغم من أن كتس معروفة لتكون ذات أهمية النذير، 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 بيولوجيا فهمها جزئيا فقط نتيجة لندرة المدقع في كرك. 10

نماذج الماوس هي ر قويةأول لدراسة مختلف جوانب البيولوجيا السرطان. يتم إنتاج نماذج الورم الكلاسيكية تحت الجلد عن طريق الحقن تحت الجلد من الخلايا السرطانية في الفئران المتلقي، والتي يمكن أن تكون إما إمونوكومبيتنت (إذا تم استخدام الخلايا السرطانية الفئران جينجينيك) أو نقص المناعة. نماذج الورم تحت الجلد غير مكلفة وإنتاج البيانات بسرعة. ونمو نقطة نهاية الورم يمكن بسهولة وقياس غير جراحية. ومع ذلك، 88٪ من المركبات الجديدة التي أظهرت النشاط المضاد للورم في مثل هذه النماذج تفشل في التجارب السريرية. 11 ويرجع ذلك جزئيا إلى الاختلافات بين الجنسين بين البشر والفئران. ومع ذلك، فإن جزءا كبيرا من هذا الفشل يرجع إلى انخفاض قيمة تنبؤية من نماذج الماوس تحت الجلد.

نماذج الماوس الفصلي، التي يتم فيها حقن الخلايا السرطانية في الجهاز الأصلي ومن ثم تنمو في المكروية الأصلية، وبالتالي تستخدم على نحو متزايد في أبحاث السرطان. 11 ، 12 ، 13 ، 14 نماذج منظار لا محاكاة فقط نمو الأورام المحلية الظروف؛ نتيجة لموقع تشريح التشريحية من نمو الورم، نماذج الماوس مثلي تسمح أيضا محاكاة واقعية للانبثاث، وبالتالي تستخدم لدراسة كتك البيولوجيا 8 ، 15 ، 16 أو ردهم على العلاجات المختلفة في كرك. 13 ، 17

وهناك عيب رئيسي من نماذج الماوس مثلي هو التعقيد الفني. اعتمادا على الجهاز الذي يتم حقن الخلايا، ومنحنى التعلم حتى المجرب هو قادرة على حث الأورام استنساخه طويلة نوعا ما. وهذا ينطبق بشكل خاص على نماذج سرطان القولون والمستقيم، كما تحتاج الخلايا السرطانية إلى أن يتم حقنه في جدار الأمعاء، والذي غالبا ما يؤدي إلى ثقب، تسرب الخلايا السرطانية أو إندولومينال فقدان الخلايا السرطانية. هذاويهدف رتيكل لوصف طريقة إعداد الخلايا من عينات الأنسجة الأولية، وخطوط الخلايا 2D وثقافة أورغانويد 3D وحقنها في الأعور من الفئران. تقنية الموصوفة هنا يؤدي إلى الأورام موحدة للغاية، اعتمادا على بيولوجيا الورم من خط الخلية المستخدمة للحقن، تشكيل استنساخ الانبثاث البعيد و كتس في الفئران المتلقي. 15

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد استعرضت التجارب الحيوانية المقدمة هنا بشكل مستقل وأذن بها من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام الحكومة المؤسسية وأجريت وفقا لاتحاد الاتحادات النباتية لعلوم الحيوان المختبرات (فيلاسا) المبادئ التوجيهية. وقد اتخذت جميع التدابير الممكنة لتقليل المعاناة بما في ذلك التخدير وتسكين أو، إذا لزم الأمر، القتل الرحيم المبكر.

1. إعداد الخلايا و أورغانوادس

ملاحظة: استخدام حجم 20 ميكرولتر مع 100،000 خلايا لكل حقنة. استخدام الطابق السفلي مصفوفة غشاء (بم) من أجل منع التسرب وضمان حقن موحدة. من أجل ضمان نتائج استنساخه، وإجراء فحوصات مصادقة خط الخلية (على سبيل المثال ، عن طريق ستر التنميط) على فترات منتظمة.

  1. إعداد تعليق الخلايا الأولية من الأنسجة الطازجة
    ملاحظة: العمل دائما تحت ظروف معقمة. النقل الفوري للطازجةمطلوب الأنسجة المقطوعة من غرفة العمليات إلى المختبر على الجليد لضمان بقاء عالية من الخلايا.
    يجب أن يكون رفاه المريض والعلاج الأمثل دائما الأولوية الأولى. لذلك، يجب الحصول على عينات الأنسجة للبحوث بطريقة لا تتداخل مع العمل المرضية اللاحقة وتخطيط الورم المقطوع. في معظم الحالات، فمن المعقول بالتالي الحصول على عينات للبحوث التي حصل عليها أخصائي علم الأمراض المدربين من أجل ضمان عدم التدخل في التشخيص المرضي.
    1. مباشرة بعد إزالة العقيمة من عينة مقطوعة (مثالي ~ 1 سم 3 )، ووضع عينة الأنسجة في أنبوب 50 مل قبل مليئة 20-30 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (بس). تخزين الأنبوب على الجليد ونقلها إلى المختبر على الفور.
    2. وضع الأنسجة في طبق بتري وغسله مرتين مع الكثير من برنامج تلفزيوني لإزالة الدم المتبقية.
    3. قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة (~ 2-4 مم) مع سكالبيل (على سبيل المثال ، مع # 20 أو # 36 شفرة).
    4. استخدام ديسوسياتور وفقا لتعليمات الشركة المصنعة من أجل مواصلة فصل الأنسجة الورم إلى تعليق خلية واحدة. بدلا من ذلك، استخدام بروتوكولات أخرى من الهضم الأنزيمي الورم.
    5. عد الخلايا الناتجة عن تعليق خلية واحدة (على سبيل المثال ، في عداد كولتر أو عدادة الكريات).
    6. أجهزة الطرد المركزي (5 دقائق في 1500 x ج) وغسل تعليق الخلية مرتين مع برنامج تلفزيوني.
    7. ريسوسبيند الخلايا في بم في تركيز 5 × 10 6 خلايا / مل والاحتفاظ بها على الجليد.
  2. إعداد خطوط الخلايا للحقن
    1. تنمو جميع خطوط الخلايا السرطانية القولون والمستقيم تحت ظروف زراعة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 ) وإعدادهم في يوم الجراحة.
    2. حصاد الخلايا وفقا لبروتوكولات ثقافة الخلية القياسية، عد الخلايا (على سبيل المثال ، في عداد كولتر أو عدادة الكريات) وحساب ريقكمية سلكي لجميع الحقن اعتمادا على أعداد الحيوانات ليتم حقنه.
    3. إعداد 3-5X من حجم الحاجة في الواقع لحساب الخسائر بيبتينغ والحجم الميت من حقنة الحقن.
    4. أجهزة الطرد المركزي (5 دقائق في 1500 غرام) وغسل تعليق خلية مرتين مع برنامج تلفزيوني.
    5. ريسوسبيند الخلايا في بم في تركيز 5 × 10 6 خلايا / مل والاحتفاظ بها على الجليد.
  3. إعداد العضوي
    ملاحظة: تزرع جميع الثقافات أورغانويد 3D تحت ظروف زراعة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ كو 2 ). وقد نشرت بروتوكولات مفصلة لثقافة العضوية قبل. 18 ، 19 ، 20 على غرار خطوط الخلايا التقليدية، نوصي حجم 20 ميكرولتر بم مع 100،000 الخلايا في الحقن. يتم إعداد أورغانويدس في يوم الجراحة على النحو التالي:
    1. إعداد الوسط التالي (في ما يلي المشار إليهكما دمم / F12 +++): المتقدمة دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) / F12 + 1٪ هيبيس (1M) + 1٪ الجلوتامين (200 ملم) + 1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
    2. قبل ملء 15 مل أنابيب مع 1 مل دمم / F12 +++.
    3. نضح بعناية أورغانيدز من سطح لوحة الثقافة ونقل محتويات 3 إلى 5 آبار في أنبوب واحد 15 مل.
    4. كسر بعناية أورغانويدس تصل إلى قطع أصغر من قبل بيبتينغ لهم صعودا وهبوطا مع ماصة الزجاج الموسعة.
    5. إضافة 5 مل دمم / F12 +++ إلى الأنبوب، تليها الطرد المركزي في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق.
    6. بعد الطرد المركزي، وإزالة طاف، ريسوسبيند بيليه في 600 ميكرولتر العازلة الإنزيم التفكك ونقل التعليق إلى بئر واحدة من لوحة 6 جيدا.
    7. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-5 دقيقة ثم بعناية الماصة تعليق صعودا وهبوطا من أجل حل أورغانويدس.
      ملاحظة: التحقق من الهضم عن طريق المجهر. فإنه يكتمل عندما تم فصل كل مجموعات الخلاياد إلى خلايا واحدة.
    8. على الهضم الناجح، إضافة 1.4 مل من دمم / F12 +++ لوقف الهضم. ثم نقل جميع الآبار من أورغانويدز هضمها إلى أنبوب 50 مل.
    9. عد الخلايا وحساب المبلغ المطلوب لجميع الحقن.
    10. إعداد 3 - 5X من حجم الحاجة في الواقع لحساب الخسائر بيبتينغ والحجم الميت من حقنة الحقن
    11. أجهزة الطرد المركزي (5 دقائق في 1500 x ج) وغسل تعليق الخلية مرتين مع برنامج تلفزيوني.
    12. معلق الخلايا في بم إلى تركيز 5 × 10 6 خلايا / مل والاحتفاظ بها على الجليد.

2. أورثوتوبيك ماوس نموذج

  1. إعداد الحيوانات المتلقية لعملية جراحية
    ملاحظة: استخدام القديم أسابيع 6-8 NOD.Cg-Prkdc SCID Il2rg tm1Wjl / SzJ (NOD SCID غاما، مجموعة موردي المواد النووية) الفئران كمتلقين. 21 مجموعة موردي المواد النووية هي من بين الفئران الأكثر مناعة، تفتقر إلى خلايا ناضجة B، T و نك جنبا إلى جنب مع غيرها من المناعة ديتأثيرات سلبية. 21 أنها تنمو بشكل موثوق الأورام حتى لو تم حقن عدد قليل من الخلايا وتكون عرضة للغاية الانبثاث البعيد. الفئران نسغ هي مربي ممتازة ويمكن أن تبقى في وحدات محددة مسببات الأمراض التقليدية (سف).
    1. قبل شق الأول، وحقن 0.05 ملغ / كغ من البوبرينورفين تحت الجلد.
    2. استخدام سيفوفلوران في 3-3.5 فول٪ للتخدير العام. فقدان المنعكس اصبع القدم قرصة يشير إلى التخدير كافية.
    3. تغطية عيون الفئران تخدير مع مرهم العيون لتجنب جفاف القرنية.
    4. كبح الفئران في موقف ضعيف على طاولة صغيرة.
    5. حلاقة البطن مع ماكينة حلاقة كهربائية (كريم مزيل الشعر يمكن استخدامها بدلا من ذلك) وتطهير مع 3 مرات على الأقل كلورهكسيدين / اليود و 70٪ الكحول بدلا من ذلك.
    6. تغطية الحقل الجراحي مع الستائر المعقمة.
      ملاحظة: استخدام المضادات الحيوية المحيطة بالجراحة هو اختياري وتخضع للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
  2. البطن منتصف البطن والتعرض للالعور
    1. استخدام مقص (المباضع يمكن استخدامها بدلا من ذلك) لجعل شق خط الوسط الصغيرة (3 - 5 ملم) من الجلد على أسفل البطن. التقاط البطن الجهاز العضلي مع ملقط وتوصيل بعناية مع مقص، وبالتالي فتح تجويف البطن.
    2. تحديد و إكستوريديز خارج الأعور مع ملقط أروماتيك. وضع الحقيبة نهاية أعمى من الأعور على البطن لافتا كرانيالي.
    3. مرة واحدة إكستوريزد، والحفاظ على الأعور رطبة باستخدام مسحات المالحة الدافئة في جميع الأوقات.
  3. الحقن مثلي، إغلاق البطن والانتعاش بعد العملية الجراحية
    1. لحقن إنتراسكال، استخدم حقنة القياسية 1 مل مع قنية 30 G. جبل هذه المحاقن على مضخة حقن ميكروينجكتيون، والتي بدورها شنت على ميكرومانيبولاتور.
    2. فهم بعناية غيض من الأعور مع ملقط أروماتيك وتلطيف بلطف من قبل التمسيد ذلك دونوارد مع مجموعة ثانية من ملقط مبلل مع المالحة الدافئة.
    3. وضع قنية مباشرة فوق الأعور.
    4. تنفيذ الخطوات التالية تحت التحكم البصري مع مجهر جراحي مجهر.
    5. فهم بعناية الأعور مع اثنين ملقط أروماتيك في كلا طرفي الجزء إكستيوريديزد من الأعور، تمتد قليلا ثم سحب ببطء على قنية التي يتم وضع موازية ومباشرة أعلاه. من الأهمية بمكان عدم تخمير جدار الأمعاء بأكمله (وبالتالي حقن الخلايا في التجويف)، وكذلك عدم تخمير المصلية بعد النقطة الأولية للاختراق، لأن هذا من شأنه أن يؤدي إلى التسرب ونشر البريتوني.
      1. نقل الأمعاء نحو قنية، وليس قنية نحو الأمعاء. عقد وتمتد الأمعاء بين ملقطين. يجب أن تكون اليدين الجراح يستريح على سطح من أجل الحد من الزلزال.
    6. حقن الخلايا بين المصلية (ينظر إليها على أنها رقيقة جدا، بطانة شفافة فوق ثe الأوعية الدموية داخل الجسم) و موسكولاريس. ولذلك يجب وضع قنية بصريا فوق الأوعية الدموية وتحت غشاء شفافة رقيقة.
    7. استخدام مفتاح القدم لبدء الحقن من أجل الحد من الزلزال في حين قنية داخل جدار الأمعاء.
    8. مرة واحدة قنية في موقف، بدء الحقن. استخدام مدة 20 ثانية، مما أدى إلى 1 ميكرولتر / ثانية الإعداد على وحدة التحكم من المضخة.
      ملاحظة: الحقن في أو بالقرب من الأوعية الدموية التالفة يؤدي إلى نشر داخل الأوعية الدموية مباشرة ورم خبيث بعيد، وينبغي بالتالي تجنبها.
    9. بعد الانتهاء من الحقن، وإزالة بعناية قنية عن طريق سحبه للخلف.
    10. وضع مسحة جافة تحت الأعور، ومن ثم شطف جيدا الأعور مع الماء المقطر من أجل خلايا تسربت ليز، وبالتالي منع نشر البريتوني الاصطناعي.
  4. إغلاق البطن والانتعاش بعد العملية الجراحية
    1. بعد صإنسينغ، عودة بلطف الأعور إلى تجويف البطن.
    2. إغلاق جدار البطن مع 6-0 خيوط تشغيل امتصاص بسرعة.
    3. إغلاق الجلد مع مقاطع الجرح الجراحية.
    4. ضع الماوس على خريطة التدفئة تعيين إلى 38 درجة مئوية حتى تعافى تماما من التخدير.
    5. مراقبة عن كثب حالة ما بعد الجراحة من الفئران لمدة 48 ساعة التالية. في حالة الشدة، وعلاج مع 0.05 ملغ / كغ البوبرينورفين كل 12 ساعة.
    6. مراقبة الفئران مرة واحدة على الأقل يوميا لعلامات الشدة بسبب نمو الورم.

3. عزل الخلايا السرطانية المتداولة من عينات الدم الكاملة

ملاحظة: الحصول على الدم عن طريق ثقب القلب عبر الجلد على الفئران تخدير، تليها القتل الرحيم. من الناحية المثالية، يتم رسم 1000 ميكرولتر من الدم في حقنة معبأة مسبقا مع 100 ميكرولتر من مضاد للتخثر (إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض (إدتا) أو الهيبارين). استخدام مضاد للإنسان إبكام (التصاق الخلايا الظهاريةالجزيء) الأجسام المضادة لتحديد كتس. هذا يعمل بشكل جيد جدا إذا تم استخدام خطوط الخلايا الظهارية الإنسان في نموذج الماوس. بالنسبة للأجهزة الأخرى، قد تكون هناك حاجة لأجسام مضادة مختلفة.

  1. إغناء كتك:
    1. قبل ملء 15 مل أنابيب مع 5 مل كثافة التدرج المتوسطة ونقل بعناية الدم في أنبوب 15 مل.
    2. أجهزة الطرد المركزي (30 دقيقة في 300 x ج دون الفرامل) وإزالة بعناية طاف العلوي.
    3. صب بقية إلى أنبوب 15 مل جديدة وأجهزة الطرد المركزي (15 دقيقة، 300 x ج مع الفرامل).
    4. استعادة البيني التي تحتوي على الخلايا وحيدات النوى (تجاهل بقية) وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
    5. ريسوسبيند بيليه في 200 ميكرولتر بس / 1٪ إدتا وإضافة 4 ميكرولتر من الأجسام المضادة إبكام. احتضان 20 دقيقة على الجليد في الظلام.
  2. الفحص والاختيار
    1. إعداد المخزن المؤقت التالية (في ما يلي يشار إلى التقاط المخزن المؤقت): بس + 10٪ مصل العجل الجنين (فس) + 1٪ البنسلين / Sتريبتوميسين (1٪) + 0.8٪ إدتا.
    2. استخدام قلم باب لرسم دائرة ~ 1 سم في 6 سم طبق بتري العقيمة (يمنع السائل من تفريق في الطبق)، وماصة 700 ميكرولتر من العازلة اختيار في هذه الدائرة.
    3. إضافة 50 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 700 ميكرولتر العازلة اختيار داخل الدائرة. تحقق من كثافة الخلايا مع المجهر. تقسيم العينة إلى أطباق مختلفة إذا كان كثيفة جدا.
    4. انتظر الخلايا لتسوية (~ 5 دقائق).
    5. شاشة انخفاض تعليق خلية للخلايا الملطخة (= إبكام إيجابية).
    6. مرة واحدة يتم العثور على خلية، واختيار الخلية مع ميكرومانيبولاتور ووضعها في 50 ميكرولتر العازلة اعتمادا على تحليل المصب المقصود (على سبيل المثال ، العازلة استخراج الحمض النووي الريبي أو وسط زراعة).
    7. اعتمادا على التحليلات المصب المقصود، عزل الخلايا السلبية إبكام و / أو المتوسطة كضوابط سلبية.
    8. المضي قدما في التحليلات المصب (على سبيل المثال ، ثقافة الخلية، ير).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نجاح وتوليد توليد أورام القولون والمستقيم في هذا النموذج يعتمد بشكل حاسم على حقن دقيقة من الخلايا دون انسكاب أو تسرب. إذا تحقق ذلك، هذا النموذج هو موثوق للغاية ونادرا جدا النتائج في نشر البريتوني الاصطناعي. تعتمد حركية النمو للأورام وكذلك أنماط نشرها على بيولوجيا الخلايا العضوية المستخدمة والخلايا. 15 في حين أن خلايا HCT116 ميتاستاسيز موثوق بها إلى الكبد في هذا النموذج، SW620 شكل الخلايا الأورام مثلي، ولكن لا ميتاستاسيزي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على الرغم من نشاطها ثبت قبل السريرية في نماذج الماوس تحت الجلد، فإن الغالبية العظمى من المركبات الرواية تفشل في التجارب السريرية وأبدا تصل إلى العيادة. 11 وقد أدى هذا القصور الواضح من نماذج الماوس تحت الجلد لمحاكاة بدقة أنماط البيولوجيا والنمو من الأورام إلى تطوير نماذج الماوس مثلي على أساس حقن خلايا الورم مباشرة إلى الجهاز الأصلي.

نماذج الفئران مثلي قادرة على محاكاة البيولوجيا ونشر الأورا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد دعم هذا العمل مؤسسة الأبحاث الألمانية (وي 3548 / 4-1) و رولاند-إرنست-ستيفتنغ فور جيسونديتسويسن (1/14).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > زراعة الخلايا الوسائط والمكونات< قوي>
المتقدم DMEM F12Invitrogen12634010DMEM / F12 +++
HEPES متوسط (1 م)Life Technologies GmbH15630056DMEM / F12 +++ متوسط
Glutamax-I (200 ملليمتر)Life Technologies GmbH35050038DMEM / F12 +++ متوسط
البنسلين / Streptomycin (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122DMEM / F12 +++ medium
DMEMLife Technologies GmbH61965026الوسيط الأساسي لخطوط الخلايا ثنائية الأبعاد (DMEM / 10٪ FCS) مصل
عجل الجنين (FCS)BIOCHROM AGS 0115الوسيط الأساسي لخطوط الخلايا ثنائية الأبعاد (DMEM / 10٪ FCS)
المخزن المؤقت للتفكك الأنزيمي TrypLE ExpressLife Technologies GmbH12604021
مصفوفة غشاء القاعدية Matrigel (BMM ، خالية من الفينول الأحمر)CORNING B.V. علوم الحياة356231
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineLife Technologies GmbH14190169
Trypsin-EDTA (0.25٪ ، فينول أحمر)Life Technologies GmbH25200072
ألواح 6 / 48 بئر بغطاءCORNING3516/3548
قارورة زراعة الخلايا 75 سم² ؛ ، 250 ملVWR International GmbH734-2066
150 سم & sup2 ؛ ، 600 ملCorning B.V. أنابيب علومالحياة 355001
Eppendorf 1,5 مل / 2 ملSarstedt AG & Co.72.706.400 / 72.695.400
15 مل ، 50 مل أنابيب الطرد المركزيGreiner-Bio-One GmbH188271 / 227270
TC10 شرائح العد (لآلة العد TC20)Bio-Rad Laboratories GmbH1450016
ماصات باستور (زجاج ، 150 مم)Fisher Scientific GmbH11546963 / FB50251سحب رقيقة باستخدام موقد بنسن
لطيف MACS DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235لإعداد أنسجة الورم الأولية
MACSmix Tube RotatorMiltenyi Biotec130-090-753لإعداد أنسجة الورم الأولية
لطيف أنابيب MACS CMiltenyi Biotec130-093-237لإعداد أنسجة الورم الأولية
طقم تفكك الورم البشريMiltenyi Biotec130-095-929لإعداد
أنسجة الورم الأوليةفالكون 70 & مايكرو; م مصفاة الخلاياCorning B.V. علوم الحياة352350لإعداد أنسجة الورم الأولية
NameCompanyCatalog NumberComments
Surgical Equipment
SevofluraneAbbVie Germany GmbH & amp; Co. KG-
Medical oxygenAir Liquide Medical GmbH-Buprenorphine
Temgesic-Bepanthen
- مرهم بصريBayer Vital GmbH10047757
محلول ملحي عادي 0.9٪ (E154)Serumwerk Bernburg AG10013
Aqua ad injectabiliaBraun235144
حقنة 1 مل (بدون حجم ميت) - Injekt-F SOLOBraun / neoLab194291661
إبرة حقن 30GBECTON DICKINSON304000
مسحات السليلوزLohmann & Rauscher Deutschland13356
Micro-Adson CorppsFST - أدوات العلوم الدقيقة11018-12
مقص قزحية العين - ToughCutFST - أدوات العلوم الدقيقة14058-11
حامل إبرة Olsen-HegarFST - أدوات العلوم الدقيقة12002-12
مجموعة AutoClipFST - أدوات العلوم الدقيقة12020-00
PDS Z1012H 6/0 C1 (جراحي خياطة)جونسون & أمبير آلة التخدير البحثية لجونسون ميديكال GmbHZ1012H
مع تدفق O2 ومبخر سيفوفلورانباركلاند ScientificV3000PS / PK
مضخة UltraMicro مع معدات Micro4 ControllerWorld Precision InstrumentsUMP3-4لحقن تقويم العظام الذي يتم التحكم فيه بدرجة عالية
الدقةلوحدة التحكم SYS-Micro415867معدات لحقن تقويم العظام الذي يتم التحكم فيه بدرجة عالية
مناور دقيق يدوي ثلاثي المحاورمعدات الدقة العالميةM325لحقن تقويم العظام الذي يتم التحكم فيه بدرجة عالية
حامل مغناطيسي للمناورM10لحقن تقويم العظام الذي يتم التحكم فيه
بدرجة عالية لوحة قاعدة فولاذية للحامل المغناطيسي M10World Precision Instruments5479معدات لحقن تقويم العظام الذي يتم التحكم فيه
بدرجة عالية الصفيحة الساخنة 062Labotect13854
Isis - ماكينة حلاقة الشعرAESCULAP -
باركلاند ScientificVS-2Z
Name< / strong > Company < strong> رقم الكتالوج < / قوي>Comments
CTC isolation
EDTARoth8040.1
كثافة التدرج المتوسط – FicollStemCell - Lymphoprep7801
Alexa Fluor 488 Anti-Human CD326 (EpCAM) استنساخ الأجسام المضادة 9C4BioLegend324210
Alexa Fluor 488 المضاد للفأر CD326 (EpCAM) استنساخ الأجسام المضادة G8.8BioLegend118210
Petri Dish ، ø ؛ 60 × 15 مم ، 21 سم & sup2 ؛ VentGreiner bio-one628102
مجهر ثقافة الخلايا الفلوريةLeica
Transferman 4r MicromanipulatorEppendorf
CellTram AirEppendorfمتصلة بجهاز المناولة الدقيقة
Dmz Universal Microelectrode PullerDagan Corporationالمطلوبة لتصنيع الشعيرات الدموية الدقيقة لشفط الخلية
المفردة Prism Glass CapillariesDagan Corporation
قلم PAPAbcamab2601
Dulbecco's Phosphate BufferedSaline Life Technologies GmbH14190169اختيار العازلة
مصل عجل الجنين (FCS)BIOCHROM AGS 0115قطف العازلة
البنسلين / الستربتومايسين (PenStrep)Life Technologies GmbH15140122اختيار المخزن المؤقت
EDTARoth8040.1اختيار مخزن مؤقت
<قوي>الاسم < / strong> Company< / strong> Catalog NumberComments
Immunohistochemistry
Purified Anti-Man-Man CD326 (EpCAM) استنساخ الأجسام المضادة 9C4BioLegend324201EpCAM الكيمياء المناعية (راجع ، الشكل 2 ج)
HRP أرنب مضاد للفأر IgGAbcamab97046EpCAM الكيمياء المناعية (راجع ، الشكل 2C)
قارورة زراعة الخلايا لأدوات العالمية الدقيق العالمي معدات مجهر جراحي مجهر براون مضخة الشفط

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA Cancer J Clin. 66 (1), 7-30 (2016).
  2. Weitz, J., Koch, M., Debus, J., Höhler, T., Galle, P. R., Büchler, M. W. Colorectal cancer. Lancet. 365 (9454), 153-165 (2005).
  3. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells of colorectal cancer. Cancer Cell Microenviron. 1 (5), (2014).
  4. Steinert, G., Schölch, S., Koch, M., Weitz, J. Biology and significance of circulating and disseminated tumour cells in colorectal cancer. Langenbecks Arch Surg. 397 (4), 535-542 (2012).
  5. Bork, U., et al. Prognostic relevance of minimal residual disease in colorectal cancer. World J Gastroenterol. 20 (30), 10296-10304 (2014).
  6. Bork, U., et al. Circulating tumour cells and outcome in non-metastatic colorectal cancer: a prospective study. Br J Cancer. 112 (8), 1306-1313 (2015).
  7. Rahbari, N. N., et al. Compartmental differences of circulating tumor cells in colorectal cancer. Ann Surg Oncol. 19 (7), 2195-2202 (2012).
  8. Rahbari, N. N., et al. Metastatic Spread Emerging From Liver Metastases of Colorectal Cancer: Does the Seed Leave the Soil Again? Ann Surg. 263 (2), 345-352 (2016).
  9. Rahbari, N. N., et al. Meta-analysis shows that detection of circulating tumor cells indicates poor prognosis in patients with colorectal cancer. Gastroenterology. 138 (5), 1714-1726 (2010).
  10. Steinert, G., et al. Immune Escape and Survival Mechanisms in Circulating Tumor Cells of Colorectal Cancer. Cancer Res. 74 (6), 1694-1704 (2014).
  11. Sharpless, N. E., Depinho, R. A. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nat Rev Drug Discov. 5 (9), 741-754 (2006).
  12. Roper, J., Hung, K. E. Priceless GEMMs: genetically engineered mouse models for colorectal cancer drug development. Trends Pharmacol Sci. 33 (8), 449-455 (2012).
  13. Schölch, S., et al. Radiotherapy combined with TLR7/8 activation induces strong immune responses against gastrointestinal tumors. Oncotarget. 6 (7), 4663-4676 (2015).
  14. Schölch, S., Rauber, C., Weitz, J., Koch, M., Huber, P. E. TLR activation and ionizing radiation induce strong immune responses against multiple tumor entities. Oncoimmunology. 4 (11), e1042201(2015).
  15. Schölch, S., et al. Circulating tumor cells exhibit stem cell characteristics in an orthotopic mouse model of colorectal cancer. Oncotarget. 7 (19), 27232-27242 (2016).
  16. Nanduri, L. K., García, S., Weitz, J., Schölch, S. Mouse Models of Colorectal Cancer-Derived Circulating Tumor Cells. Med Chem (Los Angeles). 6 (7), 497-499 (2016).
  17. van Noort, V., et al. Novel Drug Candidates for the Treatment of Metastatic Colorectal Cancer through Global Inverse Gene-Expression Profiling. Cancer Res. 74 (20), 5690-5699 (2014).
  18. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  19. Boj, S. F., et al. Organoid models of human and mouse ductal pancreatic cancer. Cell. 160 (1-2), 324-338 (2015).
  20. Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
  21. Ito, M., et al. NOD/SCID/gamma(c)(null) mouse: an excellent recipient mouse model for engraftment of human cells. Blood. 100 (9), 3175-3182 (2002).
  22. Simon, M. M., et al. A comparative phenotypic and genomic analysis of C57BL/6J and C57BL/6N mouse strains. Genome Biol. 14 (7), R82(2013).
  23. Kalish, S., et al. C57BL/6N Mice Are More Resistant to Ehrlich Ascites Tumors Than C57BL/6J Mice: The Role of Macrophage Nitric Oxide. Med Sci Monit Basic Res. 21, 235-240 (2015).
  24. Tseng, W., Leong, X., Engleman, E. Orthotopic mouse model of colorectal cancer. J Vis Exp. (10), e484(2007).
  25. Roper, J., et al. Combination PI3K/MEK inhibition promotes tumor apoptosis and regression in PIK3CA wild-type, KRAS mutant colorectal cancer. Cancer Lett. 347 (2), 204-211 (2014).
  26. Coffee, E. M., et al. Concomitant BRAF and PI3K/mTOR blockade is required for effective treatment of BRAF(V600E) colorectal cancer. Clin Cancer Res. 19 (10), 2688-2698 (2013).
  27. Belmont, P. J., et al. Resistance to dual blockade of the kinases PI3K and mTOR in KRAS-mutant colorectal cancer models results in combined sensitivity to inhibition of the receptor tyrosine kinase EGFR. Sci Signal. 7 (351), ra107(2014).
  28. Hung, K. E., et al. Development of a mouse model for sporadic and metastatic colon tumors and its use in assessing drug treatment. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (4), 1565-1570 (2010).
  29. Wang, F., Johnson, R. L., Snyder, P. W., DeSmet, M. L., Fleet, J. C. An Inducible, Large-Intestine-Specific Transgenic Mouse Model for Colitis and Colitis-Induced Colon Cancer Research. Dig Dis Sci. 61 (4), 1069-1079 (2016).
  30. Xue, Y., Johnson, R., Desmet, M., Snyder, P. W., Fleet, J. C. Generation of a transgenic mouse for colorectal cancer research with intestinal cre expression limited to the large intestine. Mol Cancer Res. 8 (8), 1095-1104 (2010).
  31. Tetteh, P. W., et al. Generation of an inducible colon-specific Cre enzyme mouse line for colon cancer research. Proc Natl Acad Sci USA. 113 (42), 11859-11864 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة