عزل الخلايا السرطانية المتداولة في نموذج الفأر المثلي لسرطان القولون والمستقيم

سرطان القولون والمستقيم (كرك) هو واحد من أكثر الأسباب شيوعا لوفاة السرطان في البلدان الغربية. ^{1 في} حين أن الورم الرئيسي يمكن في كثير من الأحيان أن تقترن، وقوع الانبثاث البعيدة بشكل كبير يفاقم التكهن وغالبا ما يؤدي إلى الموت. ^{2 ، 3} الارتباط البيولوجي للانبثاث هو الخلايا السرطانية المتداولة (كتس)، التي فصل من الورم، والبقاء على قيد الحياة في الدورة الدموية، نعلق على ظهارة في الجهاز المستهدف، وغزو الجهاز وتنتشر في نهاية المطاف إلى آفات جديدة. ^{4 على} الرغم من أن كتس معروفة لتكون ذات أهمية النذير، ^{5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9} بيولوجيا فهمها جزئيا فقط نتيجة لندرة المدقع في كرك. ¹⁰

نماذج الماوس هي ر قويةأول لدراسة مختلف جوانب البيولوجيا السرطان. يتم إنتاج نماذج الورم الكلاسيكية تحت الجلد عن طريق الحقن تحت الجلد من الخلايا السرطانية في الفئران المتلقي، والتي يمكن أن تكون إما إمونوكومبيتنت (إذا تم استخدام الخلايا السرطانية الفئران جينجينيك) أو نقص المناعة. نماذج الورم تحت الجلد غير مكلفة وإنتاج البيانات بسرعة. ونمو نقطة نهاية الورم يمكن بسهولة وقياس غير جراحية. ومع ذلك، 88٪ من المركبات الجديدة التي أظهرت النشاط المضاد للورم في مثل هذه النماذج تفشل في التجارب السريرية. ¹¹ ويرجع ذلك جزئيا إلى الاختلافات بين الجنسين بين البشر والفئران. ومع ذلك، فإن جزءا كبيرا من هذا الفشل يرجع إلى انخفاض قيمة تنبؤية من نماذج الماوس تحت الجلد.

نماذج الماوس الفصلي، التي يتم فيها حقن الخلايا السرطانية في الجهاز الأصلي ومن ثم تنمو في المكروية الأصلية، وبالتالي تستخدم على نحو متزايد في أبحاث السرطان. ^{11 ، 12 ،} 13 ^{، 14} نماذج منظار لا محاكاة فقط نمو الأورام المحلية الظروف؛ نتيجة لموقع تشريح التشريحية من نمو الورم، نماذج الماوس مثلي تسمح أيضا محاكاة واقعية للانبثاث، وبالتالي تستخدم لدراسة كتك البيولوجيا ^{8 ، 15 ، 16} أو ردهم على العلاجات المختلفة في كرك. ^{13 ، 17}

وهناك عيب رئيسي من نماذج الماوس مثلي هو التعقيد الفني. اعتمادا على الجهاز الذي يتم حقن الخلايا، ومنحنى التعلم حتى المجرب هو قادرة على حث الأورام استنساخه طويلة نوعا ما. وهذا ينطبق بشكل خاص على نماذج سرطان القولون والمستقيم، كما تحتاج الخلايا السرطانية إلى أن يتم حقنه في جدار الأمعاء، والذي غالبا ما يؤدي إلى ثقب، تسرب الخلايا السرطانية أو إندولومينال فقدان الخلايا السرطانية. هذاويهدف رتيكل لوصف طريقة إعداد الخلايا من عينات الأنسجة الأولية، وخطوط الخلايا 2D وثقافة أورغانويد 3D وحقنها في الأعور من الفئران. تقنية الموصوفة هنا يؤدي إلى الأورام موحدة للغاية، اعتمادا على بيولوجيا الورم من خط الخلية المستخدمة للحقن، تشكيل استنساخ الانبثاث البعيد و كتس في الفئران المتلقي. ¹⁵

وقد استعرضت التجارب الحيوانية المقدمة هنا بشكل مستقل وأذن بها من قبل لجنة رعاية الحيوان واستخدام الحكومة المؤسسية وأجريت وفقا لاتحاد الاتحادات النباتية لعلوم الحيوان المختبرات (فيلاسا) المبادئ التوجيهية. وقد اتخذت جميع التدابير الممكنة لتقليل المعاناة بما في ذلك التخدير وتسكين أو، إذا لزم الأمر، القتل الرحيم المبكر.

1. إعداد الخلايا و أورغانوادس

ملاحظة: استخدام حجم 20 ميكرولتر مع 100،000 خلايا لكل حقنة. استخدام الطابق السفلي مصفوفة غشاء (بم) من أجل منع التسرب وضمان حقن موحدة. من أجل ضمان نتائج استنساخه، وإجراء فحوصات مصادقة خط الخلية (على سبيل المثال ، عن طريق ستر التنميط) على فترات منتظمة.

1. إعداد تعليق الخلايا الأولية من الأنسجة الطازجة
   ملاحظة: العمل دائما تحت ظروف معقمة. النقل الفوري للطازجةمطلوب الأنسجة المقطوعة من غرفة العمليات إلى المختبر على الجليد لضمان بقاء عالية من الخلايا.
   يجب أن يكون رفاه المريض والعلاج الأمثل دائما الأولوية الأولى. لذلك، يجب الحصول على عينات الأنسجة للبحوث بطريقة لا تتداخل مع العمل المرضية اللاحقة وتخطيط الورم المقطوع. في معظم الحالات، فمن المعقول بالتالي الحصول على عينات للبحوث التي حصل عليها أخصائي علم الأمراض المدربين من أجل ضمان عدم التدخل في التشخيص المرضي.
   1. مباشرة بعد إزالة العقيمة من عينة مقطوعة (مثالي ~ 1 سم ³ )، ووضع عينة الأنسجة في أنبوب 50 مل قبل مليئة 20-30 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (بس). تخزين الأنبوب على الجليد ونقلها إلى المختبر على الفور.
   2. وضع الأنسجة في طبق بتري وغسله مرتين مع الكثير من برنامج تلفزيوني لإزالة الدم المتبقية.
   3. قطع الأنسجة إلى قطع صغيرة (~ 2-4 مم) مع سكالبيل (على سبيل المثال ، مع # 20 أو # 36 شفرة).
   4. استخدام ديسوسياتور وفقا لتعليمات الشركة المصنعة من أجل مواصلة فصل الأنسجة الورم إلى تعليق خلية واحدة. بدلا من ذلك، استخدام بروتوكولات أخرى من الهضم الأنزيمي الورم.
   5. عد الخلايا الناتجة عن تعليق خلية واحدة (على سبيل المثال ، في عداد كولتر أو عدادة الكريات).
   6. أجهزة الطرد المركزي (5 دقائق في 1500 x ج) وغسل تعليق الخلية مرتين مع برنامج تلفزيوني.
   7. ريسوسبيند الخلايا في بم في تركيز 5 × 10 ⁶ خلايا / مل والاحتفاظ بها على الجليد.
2. إعداد خطوط الخلايا للحقن
   1. تنمو جميع خطوط الخلايا السرطانية القولون والمستقيم تحت ظروف زراعة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ كو ₂ ) وإعدادهم في يوم الجراحة.
   2. حصاد الخلايا وفقا لبروتوكولات ثقافة الخلية القياسية، عد الخلايا (على سبيل المثال ، في عداد كولتر أو عدادة الكريات) وحساب ريقكمية سلكي لجميع الحقن اعتمادا على أعداد الحيوانات ليتم حقنه.
   3. إعداد 3-5X من حجم الحاجة في الواقع لحساب الخسائر بيبتينغ والحجم الميت من حقنة الحقن.
   4. أجهزة الطرد المركزي (5 دقائق في 1500 غرام) وغسل تعليق خلية مرتين مع برنامج تلفزيوني.
   5. ريسوسبيند الخلايا في بم في تركيز 5 × 10 ⁶ خلايا / مل والاحتفاظ بها على الجليد.
3. إعداد العضوي
   ملاحظة: تزرع جميع الثقافات أورغانويد 3D تحت ظروف زراعة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ كو ₂ ). وقد نشرت بروتوكولات مفصلة لثقافة العضوية قبل. ^{18 ، 19 ، 20} على غرار خطوط الخلايا التقليدية، نوصي حجم 20 ميكرولتر بم مع 100،000 الخلايا في الحقن. يتم إعداد أورغانويدس في يوم الجراحة على النحو التالي:
   1. إعداد الوسط التالي (في ما يلي المشار إليهكما دمم / F12 +++): المتقدمة دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) / F12 + 1٪ هيبيس (1M) + 1٪ الجلوتامين (200 ملم) + 1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
   2. قبل ملء 15 مل أنابيب مع 1 مل دمم / F12 +++.
   3. نضح بعناية أورغانيدز من سطح لوحة الثقافة ونقل محتويات 3 إلى 5 آبار في أنبوب واحد 15 مل.
   4. كسر بعناية أورغانويدس تصل إلى قطع أصغر من قبل بيبتينغ لهم صعودا وهبوطا مع ماصة الزجاج الموسعة.
   5. إضافة 5 مل دمم / F12 +++ إلى الأنبوب، تليها الطرد المركزي في 1،000 x ج لمدة 5 دقائق.
   6. بعد الطرد المركزي، وإزالة طاف، ريسوسبيند بيليه في 600 ميكرولتر العازلة الإنزيم التفكك ونقل التعليق إلى بئر واحدة من لوحة 6 جيدا.
   7. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1-5 دقيقة ثم بعناية الماصة تعليق صعودا وهبوطا من أجل حل أورغانويدس.
      ملاحظة: التحقق من الهضم عن طريق المجهر. فإنه يكتمل عندما تم فصل كل مجموعات الخلاياد إلى خلايا واحدة.
   8. على الهضم الناجح، إضافة 1.4 مل من دمم / F12 +++ لوقف الهضم. ثم نقل جميع الآبار من أورغانويدز هضمها إلى أنبوب 50 مل.
   9. عد الخلايا وحساب المبلغ المطلوب لجميع الحقن.
   10. إعداد 3 - 5X من حجم الحاجة في الواقع لحساب الخسائر بيبتينغ والحجم الميت من حقنة الحقن
   11. أجهزة الطرد المركزي (5 دقائق في 1500 x ج) وغسل تعليق الخلية مرتين مع برنامج تلفزيوني.
   12. معلق الخلايا في بم إلى تركيز 5 × 10 ⁶ خلايا / مل والاحتفاظ بها على الجليد.

2. أورثوتوبيك ماوس نموذج

1. إعداد الحيوانات المتلقية لعملية جراحية
   ملاحظة: استخدام القديم أسابيع 6-8 NOD.Cg-Prkdc ^SCID Il2rg ^tm1Wjl / SzJ (NOD SCID غاما، مجموعة موردي المواد النووية) الفئران كمتلقين. ²¹ مجموعة موردي المواد النووية هي من بين الفئران الأكثر مناعة، تفتقر إلى خلايا ناضجة B، T و نك جنبا إلى جنب مع غيرها من المناعة ديتأثيرات سلبية. ²¹ أنها تنمو بشكل موثوق الأورام حتى لو تم حقن عدد قليل من الخلايا وتكون عرضة للغاية الانبثاث البعيد. الفئران نسغ هي مربي ممتازة ويمكن أن تبقى في وحدات محددة مسببات الأمراض التقليدية (سف).
   1. قبل شق الأول، وحقن 0.05 ملغ / كغ من البوبرينورفين تحت الجلد.
   2. استخدام سيفوفلوران في 3-3.5 فول٪ للتخدير العام. فقدان المنعكس اصبع القدم قرصة يشير إلى التخدير كافية.
   3. تغطية عيون الفئران تخدير مع مرهم العيون لتجنب جفاف القرنية.
   4. كبح الفئران في موقف ضعيف على طاولة صغيرة.
   5. حلاقة البطن مع ماكينة حلاقة كهربائية (كريم مزيل الشعر يمكن استخدامها بدلا من ذلك) وتطهير مع 3 مرات على الأقل كلورهكسيدين / اليود و 70٪ الكحول بدلا من ذلك.
   6. تغطية الحقل الجراحي مع الستائر المعقمة.
      ملاحظة: استخدام المضادات الحيوية المحيطة بالجراحة هو اختياري وتخضع للمبادئ التوجيهية المؤسسية.
2. البطن منتصف البطن والتعرض للالعور
   1. استخدام مقص (المباضع يمكن استخدامها بدلا من ذلك) لجعل شق خط الوسط الصغيرة (3 - 5 ملم) من الجلد على أسفل البطن. التقاط البطن الجهاز العضلي مع ملقط وتوصيل بعناية مع مقص، وبالتالي فتح تجويف البطن.
   2. تحديد و إكستوريديز خارج الأعور مع ملقط أروماتيك. وضع الحقيبة نهاية أعمى من الأعور على البطن لافتا كرانيالي.
   3. مرة واحدة إكستوريزد، والحفاظ على الأعور رطبة باستخدام مسحات المالحة الدافئة في جميع الأوقات.
3. الحقن مثلي، إغلاق البطن والانتعاش بعد العملية الجراحية
   1. لحقن إنتراسكال، استخدم حقنة القياسية 1 مل مع قنية 30 G. جبل هذه المحاقن على مضخة حقن ميكروينجكتيون، والتي بدورها شنت على ميكرومانيبولاتور.
   2. فهم بعناية غيض من الأعور مع ملقط أروماتيك وتلطيف بلطف من قبل التمسيد ذلك دونوارد مع مجموعة ثانية من ملقط مبلل مع المالحة الدافئة.
   3. وضع قنية مباشرة فوق الأعور.
   4. تنفيذ الخطوات التالية تحت التحكم البصري مع مجهر جراحي مجهر.
   5. فهم بعناية الأعور مع اثنين ملقط أروماتيك في كلا طرفي الجزء إكستيوريديزد من الأعور، تمتد قليلا ثم سحب ببطء على قنية التي يتم وضع موازية ومباشرة أعلاه. من الأهمية بمكان عدم تخمير جدار الأمعاء بأكمله (وبالتالي حقن الخلايا في التجويف)، وكذلك عدم تخمير المصلية بعد النقطة الأولية للاختراق، لأن هذا من شأنه أن يؤدي إلى التسرب ونشر البريتوني.
      1. نقل الأمعاء نحو قنية، وليس قنية نحو الأمعاء. عقد وتمتد الأمعاء بين ملقطين. يجب أن تكون اليدين الجراح يستريح على سطح من أجل الحد من الزلزال.
   6. حقن الخلايا بين المصلية (ينظر إليها على أنها رقيقة جدا، بطانة شفافة فوق ثe الأوعية الدموية داخل الجسم) و موسكولاريس. ولذلك يجب وضع قنية بصريا فوق الأوعية الدموية وتحت غشاء شفافة رقيقة.
   7. استخدام مفتاح القدم لبدء الحقن من أجل الحد من الزلزال في حين قنية داخل جدار الأمعاء.
   8. مرة واحدة قنية في موقف، بدء الحقن. استخدام مدة 20 ثانية، مما أدى إلى 1 ميكرولتر / ثانية الإعداد على وحدة التحكم من المضخة.
      ملاحظة: الحقن في أو بالقرب من الأوعية الدموية التالفة يؤدي إلى نشر داخل الأوعية الدموية مباشرة ورم خبيث بعيد، وينبغي بالتالي تجنبها.
   9. بعد الانتهاء من الحقن، وإزالة بعناية قنية عن طريق سحبه للخلف.
   10. وضع مسحة جافة تحت الأعور، ومن ثم شطف جيدا الأعور مع الماء المقطر من أجل خلايا تسربت ليز، وبالتالي منع نشر البريتوني الاصطناعي.
4. إغلاق البطن والانتعاش بعد العملية الجراحية
   1. بعد صإنسينغ، عودة بلطف الأعور إلى تجويف البطن.
   2. إغلاق جدار البطن مع 6-0 خيوط تشغيل امتصاص بسرعة.
   3. إغلاق الجلد مع مقاطع الجرح الجراحية.
   4. ضع الماوس على خريطة التدفئة تعيين إلى 38 درجة مئوية حتى تعافى تماما من التخدير.
   5. مراقبة عن كثب حالة ما بعد الجراحة من الفئران لمدة 48 ساعة التالية. في حالة الشدة، وعلاج مع 0.05 ملغ / كغ البوبرينورفين كل 12 ساعة.
   6. مراقبة الفئران مرة واحدة على الأقل يوميا لعلامات الشدة بسبب نمو الورم.

3. عزل الخلايا السرطانية المتداولة من عينات الدم الكاملة

ملاحظة: الحصول على الدم عن طريق ثقب القلب عبر الجلد على الفئران تخدير، تليها القتل الرحيم. من الناحية المثالية، يتم رسم 1000 ميكرولتر من الدم في حقنة معبأة مسبقا مع 100 ميكرولتر من مضاد للتخثر (إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض (إدتا) أو الهيبارين). استخدام مضاد للإنسان إبكام (التصاق الخلايا الظهاريةالجزيء) الأجسام المضادة لتحديد كتس. هذا يعمل بشكل جيد جدا إذا تم استخدام خطوط الخلايا الظهارية الإنسان في نموذج الماوس. بالنسبة للأجهزة الأخرى، قد تكون هناك حاجة لأجسام مضادة مختلفة.

1. إغناء كتك:
   1. قبل ملء 15 مل أنابيب مع 5 مل كثافة التدرج المتوسطة ونقل بعناية الدم في أنبوب 15 مل.
   2. أجهزة الطرد المركزي (30 دقيقة في 300 x ج دون الفرامل) وإزالة بعناية طاف العلوي.
   3. صب بقية إلى أنبوب 15 مل جديدة وأجهزة الطرد المركزي (15 دقيقة، 300 x ج مع الفرامل).
   4. استعادة البيني التي تحتوي على الخلايا وحيدات النوى (تجاهل بقية) وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني.
   5. ريسوسبيند بيليه في 200 ميكرولتر بس / 1٪ إدتا وإضافة 4 ميكرولتر من الأجسام المضادة إبكام. احتضان 20 دقيقة على الجليد في الظلام.
2. الفحص والاختيار
   1. إعداد المخزن المؤقت التالية (في ما يلي يشار إلى التقاط المخزن المؤقت): بس + 10٪ مصل العجل الجنين (فس) + 1٪ البنسلين / Sتريبتوميسين (1٪) + 0.8٪ إدتا.
   2. استخدام قلم باب لرسم دائرة ~ 1 سم في 6 سم طبق بتري العقيمة (يمنع السائل من تفريق في الطبق)، وماصة 700 ميكرولتر من العازلة اختيار في هذه الدائرة.
   3. إضافة 50 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 700 ميكرولتر العازلة اختيار داخل الدائرة. تحقق من كثافة الخلايا مع المجهر. تقسيم العينة إلى أطباق مختلفة إذا كان كثيفة جدا.
   4. انتظر الخلايا لتسوية (~ 5 دقائق).
   5. شاشة انخفاض تعليق خلية للخلايا الملطخة (= إبكام إيجابية).
   6. مرة واحدة يتم العثور على خلية، واختيار الخلية مع ميكرومانيبولاتور ووضعها في 50 ميكرولتر العازلة اعتمادا على تحليل المصب المقصود (على سبيل المثال ، العازلة استخراج الحمض النووي الريبي أو وسط زراعة).
   7. اعتمادا على التحليلات المصب المقصود، عزل الخلايا السلبية إبكام و / أو المتوسطة كضوابط سلبية.
   8. المضي قدما في التحليلات المصب (على سبيل المثال ، ثقافة الخلية، ير).

نجاح وتوليد توليد أورام القولون والمستقيم في هذا النموذج يعتمد بشكل حاسم على حقن دقيقة من الخلايا دون انسكاب أو تسرب. إذا تحقق ذلك، هذا النموذج هو موثوق للغاية ونادرا جدا النتائج في نشر البريتوني الاصطناعي. تعتمد حركية النمو للأورام وكذلك أنماط نشرها على بيولوجيا الخلايا العضوية المستخدمة والخلايا. 15 في حين أن خلايا HCT116 ميتاستاسيز موثوق بها إلى الكبد في هذا النموذج، SW620 شكل الخلايا الأورام مثلي، ولكن لا ميتاستاسيزي. 15

استخدام خلايا HCT116 في هذا النموذج نتائج موثوق في الفئران الملتحمة في غضون 35 يوما من حقن الخلايا السرطانية. الأورام الأولية قياس حوالي 10 ملم في الحجم ( الشكل 1A والشكل 2A )، الانبثاث الكبد ( الشكل 1B </str أونغ> والشكل 2B )، والانبثاث الرئة ( الشكل 1C والشكل 2C ) وتعميم الخلايا السرطانية ( الشكل 3 ) موجودة دائما تقريبا. في الفئران تحمل الأورام HCT116، بعد 35 يوما من حقن الخلايا الورم كتس موجودة في وتيرة عالية وكمية ويمكن عزلها بسهولة لتحليل المصب ( الشكل 3 ).

الشكل 1: الصور المجهرية بعد تشريح 35 يوما بعد الحقن مثلي من HCT116 خلايا كرك الإنسان في فصيلة نسغ. ( A ) الورم الرئيسي (خط متقطع) في الأعور. ( ب ) الكبد مع الانبثاث متعددة. ( C ) الانبثاث الرئة (السهام).1large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2: الصور النسيجية من الأجهزة التي تظهر في الشكل 1 . ( A ) الورم الرئيسي (H & E). ( ب ) الانبثاث الكبد (H & E). ( C ) ورم خبيث في الرئة (مكافحة إبكام المناعية). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3: تداول الخلايا السرطانية (خلايا HCT116 في مجموعة موردي المواد النووية، 35 يوما بعد حقن الخلايا السرطانية). حقل مشرق ( A </قوية>) والمناعي (المضادة لل هيبكام-Alexa488 ( B )) صور كتس في الخلايا المحيطي الدم وحيدات النوى (بمك) جزء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.