مقالة منهجية

عزل المغناطيسي السريع والمكرر CD11b من الابتدائية الخلايا الدبقية الصغيرة مع الطهارة تعزيز وطلاقة

9.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55364

⸱

أبريل 13, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedical Sciences & Iowa Center for Advanced Neurotoxicology, Iowa State University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم بروتوكول لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة من الجراء الماوس بعد الولادة (يوم 1) لسنة المختبر التجريب. هذه الطريقة المرتجلة من العزلة يولد على حد سواء عالية الغلة والنقاء، وهي ميزة كبيرة على الطرق البديلة التي تسمح التجريب نطاق واسع لأغراض توضيح البيولوجيا دبقية.

الملخص

الخلايا الدبقية الصغيرة هي المستجيبين الأولية للإهانات الجهاز العصبي المركزي. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير غير معروف حول دورهم في تنظيم neuroinflammation. الخلايا الدبقية الصغيرة هي خلايا أرومية متوسطة التي تعمل على نحو مماثل لالضامة في المسح الإجهاد التهابات. كما تم تمديد الكلاسيكية (M1 من نوع) والبديل (M2 من نوع) التنشيط الضامة إلى الخلايا الدبقية الصغيرة في محاولة لفهم أفضل للتفاعل الكامنة وراء هذه الظواهر لها في ظروف neuroinflammatory مثل الشلل الرعاش والزهايمر، وأمراض هنتنغتون. في التجارب في المختبر الاستفادة الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية العروض نتائج سريعة وموثوق بها التي يمكن أن تمتد إلى البيئة في الجسم الحي. ورغم أن هذا هو ميزة واضحة على الجسم الحي في التجريب، وعزل الخلايا الدبقية الصغيرة مع تحقيق عوائد كافية من النقاء الأمثل قد يشكل تحديا. الطرق الشائعة المستخدمة حاليا إما يعانون من الانتعاش، وانخفاض النقاء، أو كليهما. هنا، نحن ماركاonstrate صقل للCD11b طريقة الفصل المغناطيسي خالية من العمود الذي يحقق الانتعاش خلية عالية وتعزيز نقاء في نصف مقدار الوقت. ونحن نقترح هذا الأسلوب الأمثل نموذجا مفيدا للغاية من العزلة دبقية الأولية لأغراض دراسة neuroinflammation والتنكس العصبي.

المقدمة

الخلايا الدبقية الصغيرة هي الضامة المقيمين MYB مستقلة من أصل أرومية متوسطة، والتي تفرق من ج طقم + / CD45- erythromyeloid الأسلاف في الجزر الدم من الكيس المحي 1 و 2. مرة واحدة الخلايا الدبقية الصغيرة الجنينية قد استعمرت الجهاز العصبي المركزي (CNS)، والانتقال من أميبية إلى شكل متشعب 3. وتصنف هذه الخلايا الدبقية الصغيرة الكبار كما surveillant منذ تشعباتها ديناميكية التحقيق لحمة الدماغ صحية للإهانات المحتملة 4. على الرغم من أن الخلايا الدبقية الصغيرة تساهم فقط إلى ما يقرب من 10٪ من سكان الخلية CNS، وقدرتهم على البلاط بين بعضها البعض وتضمن المسح القصوى من لحمة 4 و 5. أنماط الخطر المصاحب الجزيئية (DAMPs)، مثل α-synuclein 6 و 7 و 8 اميلويد β، أو عathogen المصاحب أنماط الجزيئية (PAMPs) مثل lipopolysaccharide في (LPS) 9، وتفعيل كلاسيكي الخلايا الدبقية الصغيرة لتعزيز استجابة التهابية تتميز العودة إلى الدولة أميبية نشطة وإنتاج أكسيد النيتريك، عامل نخر الورم α (TNFα)، انترلوكين 1β (IL-1β)، IL-6، IL-12، وchemokine CC عزر يجند 2 9 و 10 و 11. في ظروف neuroinflammatory مثل مرض باركنسون، والتي تراكمت لديها الإمراض α-synuclein، يتم إنشاء دورة الاعصاب من موت الخلايا العصبية الدوبامين، التي تطلق أكثر مجمعة α-synuclein، زيادة تعزيز تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة الكلاسيكية من 7. على غرار الضامة الطرفية، قد يكون الخلايا الدبقية الصغيرة أيضا القدرة على تفعيل بدلا من ذلك في وجود السيتوكينات المضادة للالتهابات IL-4 و IL-10، مما يتيح لهم قويةالاتحاد العالمي للتعليم لتعزيز إصلاح العصبي وتخفيف التهاب 2، 11. وبصرف النظر عن الأدوار المناعية في الجهاز العصبي المركزي، وقد وصفت الخلايا الدبقية الصغيرة كمنظمات حيوية من الدوائر العصبية التي كتبها تشذيب نقاط الاشتباك العصبي خلال التنمية. على سبيل المثال، الفئران Cx3cr1- KO لها الخلايا الدبقية الصغيرة أقل كثافة وخفض التقليم متشابك، الأمر الذي يؤدي إلى فرط العمود الفقري شجيري، نقاط الاشتباك العصبي غير ناضجة، وأنماط الكهربية من متخلف CNS 12. فهم هذه التعقيدات الفسيولوجية والأدوار الوظيفية متنوعة من الخلايا الدبقية الصغيرة في التوازن للجهاز العصبي المركزي أمر بالغ الأهمية للبحث عن علاجات تستهدف الاضطرابات العصبية.

في مجال علم المناعة العصبية، في التجارب المختبرية ومرغوب فيه للغاية بسبب إمكانية أكبر للدراسات الميكانيكية، وانخفاض تكاليف الصيانة، ولكونها أقل زمنيا وكثيفة العمالة. Furthermoإعادة، والقدرة على عزل السكان الخلية أمر بالغ الأهمية لتحديد وظائف هذه الخلايا المستهدفة تحت الشروط المنصوص عليها. توجد طرق عديدة العزلة دبقية صغيرة، لكنها محدودة بسبب قدرتها على الحصول على أعداد كبيرة نسبيا ونقاء للتجريب واسعة 13 و 14 و 15. على سبيل المثال، مجموعة من 11B التمايز (CD11b) هي علامة السطح مشتركة من وحيدات، الضامة، والخلايا الدبقية الصغيرة 16. من خلال استغلال CD11b، وصفت طريقة الفصل المغناطيسي أولا باعتباره النهج القائم على العمود الذي أسفرت ~ 99.5٪ النقاء و~ 1.6 × 10 6 الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ حديثي الولادة 17. وضعت مختبرنا مؤخرا CD11b طريقة الفصل المغناطيسي خالية من الأعمدة 15، والتي أجرينا في أنبوب البوليسترين عن طريق وضع علامات CD11b مع الأجسام المضادة وحيدة النسيلة مترافق إلى فيكوإيريترين (PE). A SECONDA bispecificراي أجسام مضادة لPE والمجمعات ديكستران مع PE. مرة واحدة ملزمة، يتم إدخال الجزيئات المغناطيسية المغلفة ديكستران، الذي ربط نهاية ديكستران من مجمع الأضداد. وأخيرا، يتم وضع أنبوب البوليسترين في جذب للعزلة دبقية صغيرة. تضاعف هذا النهج العائد إلى ~ 3.2 × 10 6 الخلايا الدبقية الصغيرة في الدماغ حديثي الولادة ولكن على حساب الحد النقاء إلى ~ 97٪.

هنا، علينا أن نظهر خالية من الأعمدة CD11b بروتوكول الفصل المغناطيسي السريع والمكرر (الشكل 1). لا تزال هذه الطريقة تحسن ممكنا كما لدينا وسيلة خالية من الأعمدة الأصلي لأن سعر الطقم الفصل المغناطيسي CD11b هو نفسه. يتم تقليل وقت الانتهاء منه في النصف، والتي يمكن أن تكون حاسمة لتعظيم بقاء الخلية والعائد. تجدر الإشارة إلى أن نقاء تحقق من هذا الأسلوب الأمثل هو ~> 99٪، تحسنا ملحوظا على مدى نقاء يتحقق من طريقة خالية من الأعمدة الأصلية التي وضعتها مختبرنا 15. الأهم من ذلك، CD11b-PEلا يستخدم، مما يلغي الحاجة لاحتضان بعيدا عن الضوء والسماح باستخدام القناة الحمراء للفحص المجهري مضان. وأخيرا، كما هو الحال في طريقة CD11b الأصلي، ويتم الحصول على جزء نجمي الخلايا من ارتفاع العائد والنقاء مع هذا الأسلوب محسن. الخلايا النجمية هي الخلايا الدبقية الأكثر عددا في الجهاز العصبي المركزي، مما يؤدي إلى فكرة أن مهامهم التماثل الساكن لا غنى عنها في ما يتعلق الفيزيولوجيا المرضية 18. هذه الخلايا الدبقية يلعب دورا في الوظائف الفسيولوجية المختلفة مثل تشكيل حاجز الدم في الدماغ، وتقديم الدعم المغذيات، والحفاظ على ناقل عصبي التوازن، وتشكيل الندوب الدبقية ردا على إصابة، العصبية والتعلم والذاكرة، وneuroinflammation، لاثبات قدراتهم التحقيق في الدبقية علم الأحياء 19. وقد تم التأكد من التشكل وظائف الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر، غرب النشاف، الكمي في الوقت الحقيقي تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR-QRT)، Gفحص النتريت ريس، وLuminex متعدد خلوى الفحص. صقل المنصوص عليها في هذا البروتوكول يقدم زيادة الثقة المتعلقة نقاء دبقية أو نجمي الخلايا، وتطبيق أوسع المجهر مضان مع توافر القناة الحمراء، ويوفر الوقت، والتي تعتبر مهمة لفي المختبر التجريب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على استخدام الحيوانات وإجراءات البروتوكول وتشرف عليها لجنة الحيوان الرعاية المؤسسية والاستخدام (IACUC) في جامعة ولاية ايوا (أميس، IA، الولايات المتحدة الأمريكية)

1. زراعة الثقافات الدبقية المختلطة

  1. قطع رأس 1- الجراء عمر يوم 2 بسرعة مع مقص التشغيل 5.5 بوصة، ووضع رؤساء الفور في أنبوب 50 مل على الجليد. لاحظ أن هذا قطع الرأس هو طريقة القتل الرحيم.
  2. في الصفحي تدفق الهواء غطاء محرك السيارة، وجعل شق صغير في الجمجمة والسحايا باستخدام 4.5 بوصة على التوالي مقص تشريح الصغيرة. تبدأ خفض من نهاية الذيلية إلى نهاية منقاري (الأنف). الحصول على تحت الجلد باستخدام افتتاح شكلتها قطع الرأس.
    1. بعد شق، قشرة واحدة من نصفي الكرة إلى الجانب. ثم استخدام زوج من ملاقط منحنية أو مدمن مخدرات لإزالة المخ بأكمله.
  3. تزج الدماغ (ق) في أنبوب 50 مل جديد يحتوي 0.25٪ التربسين- ethylenediaminetetraacetأكل حامض (EDTA) لمدة 15 دقيقة في 37 ° C حمام الماء. استخدام 2 مل من التربسين-EDTA في الدماغ.
  4. غسل الدماغ (s) مع وسائل الاعلام الطازج نمو (10٪ FBS، DMEM / F12، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، 1٪ L-الجلوتامين، 1٪ البيروفات الصوديوم، و 1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية) وذلك بإضافة وإزالة وسائل الإعلام. كرر هذه 4X.
  5. لكل الدماغ، لوحة اثنين T-75 قوارير تحتوي على وسائط النمو. لذلك، إضافة 2 مل من وسائط النمو في الدماغ إلى الأنبوب. وبالتالي، سيكون ما يعادل 1 مل من الدماغ المتجانس مع 8-9 مل من وسائط النمو في T-75 قارورة.
  6. التجانس بواسطة الطحن الدماغ (s) مع ماصات من أحجام مختلفة الفتحة، بالترتيب من الأكبر إلى الأصغر. عندما كان مرئيا أن أنسجة المخ لا يصغر، والانتقال إلى ماصة المقبلة. في نهاية سحن، يجب أن يكون تعليق واضح، مع عدم وجود قطع مرئية.
    1. استخدام مل ماصة 25، 5 مل ماصة، ثم 10 مل ماصة بالتتابع.
  7. تمرير كل homogتعليق الدماغ enous من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر لجعله ثقافة خلية واحدة.
  8. لكل الدماغ المتجانس، لوحة اثنين T-75 قوارير تحتوي على وسائط النمو، كما هو موضح في الخطوة 1.5 (1 مل من الدماغ المتجانس مع 8-9 مل من وسائط النمو في T-75 قارورة).
  9. تغيير وسائط النمو بعد 6 د وتنمو حتى العزلة في اليوم ال 16.

2. عزل خلايا دبقية

  1. بعد 16 يوما، وإزالة وسائط النمو من القارورة ووضعه في أنبوب جديد 50 مل. إضافة 3 مل 0.25٪ التربسين-EDTA لكل T-75 قارورة. يهز قوارير لمدة 5 دقائق على RT على شاكر المداري.
    1. أجهزة الطرد المركزي في وسائط النمو إزالتها عند 0.4 x ج لمدة 5 دقائق واستخدامها لوقف تفاعل التربسين إدتا في خطوة لاحقة.
  2. بعد ان اطمأن لمدة 5 دقائق، إضافة ما لا يقل عن 4 مل من وسائط النمو (الطازجة أو الوسائط المستخدمة من 2.1.1) لوقف تفاعل التربسين إدتا.
  3. يسحن لضمان أن جميع جتم فصل ملتعلمي اللغة اإلنكليزية.
  4. بعد سحن، وتمرير الخلايا من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر لجعله ثقافة خلية واحدة، إجراء تعداد خلايا، ومن ثم تدور باستمرار الخلايا عند 0.4 x ج لمدة 5 دقائق.
  5. مقابل كل 100 × 10 6 خلايا (تقريبا 15 × T-75 قوارير)، استخدم 1 مل من الموصى بها وسائل الإعلام (2٪ FBS، DPBS (الكالسيوم والمغنيسيوم خالية من كلوريد)، 1 ملم EDTA) لإعادة تعليق بيليه الخلية.
    ملاحظة: مصممة جميع الخطوات التالية لفصل مل 1.
  6. خذ أنبوب البوليسترين 5 مل، إضافة 1 مل من الموصى بها وسائل الإعلام، وبمناسبة الغضروف المفصلي. إضافة الموصى به وسائل الإعلام ما يصل الى 2.5 مل وبمناسبة هذا أيضا. تجاهل الموصى بها وسائل الإعلام ونقل الخلايا مع وقف التنفيذ إعادة إلى أنبوب البوليسترين 5 مل.
  7. إضافة 50 ميكرولتر من مصل الفئران لكل 1 مل من الخلايا مع وقف التنفيذ. احتضان لمدة 5 دقائق في RT.
  8. إعداد اختيار كوكتيل عن طريق خلط 25 ميكرولتر من مكون A و 25 ميكرولتر من عنصر B. هذه المكونات هي الملكية.
  9. إضافة 501؛ L من كوكتيل التحديد إلى الخلايا. احتضان لمدة 5 دقائق في RT.
    ملاحظة: للحصول على الثقافات أنقى، كرر الخطوة 2.9 (أوصت لكن ليس إلزاميا).
  10. المجهرية دوامة لمدة 45 ثانية. إضافة 80 ميكرولتر من المجهرية لكل 1 مل من العينة. احتضان لمدة 3 دقائق على RT.
  11. تبرزي حجم 2.5 مل في أنبوب البوليسترين بإضافة الموصى بها وسائل الإعلام.
  12. وضع أنبوب في المغناطيس لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ضبط الحضانة لزيادة نقاء. صب ببطء للخروج الموصى به وسائل الإعلام في أنبوب 15 مل مع المغناطيس لا تزال في أنبوب البوليسترين.
  13. كرر الخطوة 2.12 ثلاث مرات أكثر. ويمكن تنفيذ حضانات المغناطيسية إضافية لزيادة نقاء.
  14. إضافة 3 مل من وسائط النمو وحساب عدد الخلايا باستخدام عداد الخلية.
  15. لوحة الخلايا تبعا لذلك في بولي-D-ليسين (PDL) لوحات المغلفة للعلاج. علاج الخلايا بعد 48 ساعة البذر لوحات مغلفة inPDL. وهذا يسمح للخلايا للتعافي من الإجهاد الانفصال.
    ملاحظة: تشيCK نقاء الثقافة باستخدام مناعية كما هو موضح سابقا (15).
  16. لوحة الكسر السلبي (التي تم جمعها في أنبوب 15 مل)، والتي في معظمها يحتوي على الخلايا النجمية، في T-75 قوارير في وسط النمو.
  17. بعد لا يقل عن 6 ساعة من الحضانة في الحاضنة 37 درجة مئوية، وتغيير المتوسطة وتركها تنمو O / N. تقسيم الخلايا النجمية في اليوم التالي للعلاج.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة من خلال عدة CD11b اختيار إيجابي II ديك نقاء عالية

تم عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الماوس الأولية باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه ومطلي coverslips على المغلفة بولي-D-يسين للتحقق من نقاء العزلة. كانت مطلية عشرة آلاف خلية لكل جيدا وتحليل immunocytochemical تم تنفيذها باستخدام المتأين ملزم الكالسيوم محول جزيء 1 (Iba1) كعل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أقدم أساليب العزلة دبقية لها المستردة المحدودة التي ليست مناسبة للبروتين مختلف يحلل طخة غربية وRNA يحلل من قبل QRT-PCR. تمسك التفاضلية وأساليب trypsinization خفيفة نهجان المشتركة مع عوائد منخفضة دبقية 13 و 14 و 15. لديه نهج CD11b القائم على عمود أيضا الانتعاش منخفضة، ولكن يحقق نقاء أكبر من الالتزام التفاضلية وtrypsinization معتدل 13 و 1...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH) المنح: NS088206 وES026892. وW. يوجين ولليندا لويد هبوا الرئيس على AGK وعمداء الأستاذية إلى AK واعترف أيضا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم فصل EasySep CD11b IIتقنيات الخلايا الجذعية18970
تقنيات الخلايا الجذعية المغناطيسية EasySep18000
DMEM / F12 (1: 1) (1x)Life Technologies11330057
PyruvateLife Technologies11360070
MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية (100x)Life Technologies11140050
L-Glutamine (100x)Life Technologies25030081
EDTAFisher ScientificAM9260G
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Sigma13H469
0.25٪ Trypsin-EDTAGibco من Life Technologies25200
Dulbecco's PBS (DPBS)Gibco من LifeTechnologies 14190250
Sodium

المراجع

  1. Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), 86-90 (2012).
  2. Prinz, M., Priller, J. Microglia and brain macrophages in the molecular age: from origin to neuropsychiatric disease. Nat Rev Neurosci. 15 (5), 300-312 (2014).
  3. Alliot, F., Godin, I., Pessac, B. Microglia derive from progenitors, originating from the yolk sac, and which proliferate in the brain. Brain Res Dev Brain Res. 117 (2), 145-152 (1999).
  4. Ransohoff, R. M., Cardona, A. E. The myeloid cells of the central nervous system parenchyma. Nature. 468 (7321), 253-262 (2010).
  5. Kettenmann, H., Kirchhoff, F., Verkhratsky, A. Microglia: new roles for the synaptic stripper. Neuron. 77 (1), 10-18 (2013).
  6. Su, X., et al. Synuclein activates microglia in a model of Parkinson's disease. Neurobiol Aging. 29 (11), 1690-1701 (2008).
  7. Dzamko, N., Geczy, C. L., Halliday, G. M. Inflammation is genetically implicated in Parkinson's disease. Neuroscience. 302, 89-102 (2015).
  8. Xing, B., Bachstetter, A. D., Van Eldik, L. J. Microglial p38alpha MAPK is critical for LPS-induced neuron degeneration, through a mechanism involving TNFalpha. Mol Neurodegener. 6, 84(2011).
  9. Panicker, N., et al. Fyn Kinase Regulates Microglial Neuroinflammatory Responses in Cell Culture and Animal Models of Parkinson's Disease. J Neurosci. 35 (27), 10058-10077 (2015).
  10. Moehle, M. S., West, A. B. M1 and M2 immune activation in Parkinson's Disease: Foe and ally? Neuroscience. 302, 59-73 (2015).
  11. Saijo, K., Glass, C. K. Microglial cell origin and phenotypes in health and disease. Nat Rev Immunol. 11 (11), 775-787 (2011).
  12. Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), 1456-1458 (2011).
  13. Floden, A. M., Combs, C. K. Microglia repetitively isolated from in vitro mixed glial cultures retain their initial phenotype. J Neurosci Methods. 164 (2), 218-224 (2007).
  14. Saura, J., Tusell, J. M., Serratosa, J. High-yield isolation of murine microglia by mild trypsinization. Glia. 44 (3), 183-189 (2003).
  15. Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. J Neurosci Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
  16. Prinz, M., Priller, J., Sisodia, S. S., Ransohoff, R. M. Heterogeneity of CNS myeloid cells and their roles in neurodegeneration. Nat Neurosci. 14 (10), 1227-1235 (2011).
  17. Marek, R., Caruso, M., Rostami, A., Grinspan, J. B., Das Sarma,, J, Magnetic cell sorting: a fast and effective method of concurrent isolation of high purity viable astrocytes and microglia from neonatal mouse brain tissue. J Neurosci Methods. 175 (1), 108-118 (2008).
  18. Hasko, G., Pacher, P., Vizi, E. S., Illes, P. Adenosine receptor signaling in the brain immune system. Trends Pharmacol Sci. 26 (10), 511-516 (2005).
  19. Radulovic, M., Yoon, H., Wu, J., Mustafa, K., Scarisbrick, I. A. Targeting the thrombin receptor modulates inflammation and astrogliosis to improve recovery after spinal cord injury. Neurobiol Dis. 93, 226-242 (2016).
  20. Ay, M., et al. Molecular cloning, epigenetic regulation, and functional characterization of Prkd1 gene promoter in dopaminergic cell culture models of Parkinson's disease. J Neurochem. 135 (2), 402-415 (2015).
  21. Gordon, R., et al. Protein kinase Cdelta upregulation in microglia drives neuroinflammatory responses and dopaminergic neurodegeneration in experimental models of Parkinson's disease. Neurobiol Dis. 93, 96-114 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة