يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

جيل المستمدة IPSC-Organoids الدماغ البشري لنموذج اضطرابات النمو العصبي في وقت مبكر

20.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55372

⸱

أبريل 14, 2017

 , 
1Center for Molecular Medicine Cologne, University of Cologne, 2Institute for Biochemistry I, Medical School of University of Cologne

في هذه المقالة

ملخص

تم إعاقة نمذجة نمو الدماغ البشري بسبب التعقيد غير المسبوق للأنسجة الظهارية العصبية. هنا ، يتم وصف طريقة للتوليد القوي من عضيات الدماغ لتحديد الأحداث المبكرة لنمو الدماغ البشري ونمذجة صغر الرأس في المختبر.

الملخص

يعد التوافر المحدود للنماذج المختبرية المناسبة التي يمكن أن تمثل بشكل موثوق تطور الدماغ البشري المعقد عنق الزجاجة الكبير الذي يحد من ترجمة أبحاث الدماغ الأساسية إلى تطبيق سريري. في حين أن الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPSCs) قد حلت محل الخلايا الجذعية الجنينية البشرية المشكوك فيها أخلاقيا, تظل دراسات التمايز العصبي المستندة إلى iPSC وصفية على المستوى الخلوي ولكنها تفشل في توفير التفاصيل التي يمكن اشتقاقها بشكل كاف من معقدة, أنسجة المخ البشري ثلاثية الأبعاد. < p class = 'jove_content'>يتم الآن ملء هذه الفجوة من خلال تطبيق عضيات الدماغ ثلاثية الأبعاد المشتقة من iPSC ، "الأدمغة في طبق" ، والتي تمثل العديد من ميزات نمو الدماغ البشري المعقد. هنا, طريقة لتوليد iPSC مشتقة, يتم وصف عضيات الدماغ 3D. يمكن أن تساعد العضيات في نمذجة صغر الرأس الأولي الوراثي المتنحي (MCPH) ، وهو اضطراب نادر في النمو العصبي البشري. التفسير المقبول على نطاق واسع لتشوه الدماغ في MCPH هو استنفاد تجمع الخلايا الجذعية العصبية خلال المراحل المبكرة من نمو الدماغ البشري ، وهو عيب في النمو يصعب إعادة إنشائه أو إثباته في المختبر. < ص فئة = 'jove_content'>لدراسة MCPH, ولدنا iPSCs من الخلايا الليفية المشتقة من المريض تحمل طفرة في بروتين سنتروزومي CPAP. من خلال تحليل المنطقة البطينية لعضيات الدماغ ثلاثية الأبعاد صغر الرأس ، أظهرنا التمايز المبكر للأسلاف العصبية. هذه العضيات الدماغية ثلاثية الأبعاد هي نظام قوي في المختبر سيكون مفيدا في نمذجة اضطرابات الدماغ الخلقية التي تسببها المواد الكيميائية السامة للأعصاب أو الالتهابات الفيروسية العصبية أو الطفرات الجينية الموروثة.

المقدمة

اضطرابات النمو العصبي الإنسان، مثل صغر الرأس، لا يمكن إلا أن تدرس بشكل سيئ في النماذج الحيوانية يرجع ذلك إلى حقيقة أن العقول البشرية لديها سطح القشرة الموسعة، وهي ميزة فريدة من نوعها مختلفة من الحيوانات غير البشرية.

هذا الجانب يجعل نمو الدماغ الإنسان عملية معقدة لا يمكن دراستها بشكل كاف في 2D، في نظام زراعة الخلايا في المختبر. الناشئة تقنيات زراعة 3D تسمح توليد organoids مثل الأنسجة من الخلايا الجذعية المحفزة التي يسببها (iPSCs). تمايز في المختبر من خلايا جذعية المحفزة في ثقافة تعليق 3D يسمح بتشكيل مختلف أنواع الخلايا في الوقت المناسب وبطريقة منطقة محددة، مما أدى إلى والأنسجة المنظمة الطبقية 1، 2، 3. بفضل المختبرات التي كانت رائدة تقنيات ثقافة 3D وبسط تعقيد تشكيل الجهاز، بدءا من الخلايا الجذعية،قمنا بتطوير وسيلة قوية لتوليد organoids الدماغ لتحديد الأحداث في وقت مبكر من نمو الدماغ البشرية ونموذج صغر الرأس في المختبر 1، 2، 3. ومن الجدير بالذكر أننا تكييف طريقة الأصلي التي وضعتها لانكستر وآخرون. لتوليد organoids الدماغي 1. تم تعديل هذه الطريقة وفقا لمتطلبات التجريبية لدينا.

والهدف من دراسة من جبريل وآخرون. كان لتحليل الآليات الخلوية والجزيئية من العصبية صيانة الخلايا الجذعية أثناء نمو المخ. من أجل القيام بذلك، وقد أجريت دراسة الآلية عن طريق تحليل الخلايا الاولية العصبية (الشخصيات) في organoids الدماغ 3D المستمدة من المريض صغر الرأس (4). حمل هذا المريض طفرة في CPAP، وهو بروتين centrosomal الحفاظ اللازمة لنشوء حيوي الجسيم المركزي 5. A فراش لا تسبب مقبولة على نطاق واسعالأطروحة هو أن صغر الرأس هو نتيجة لنضوب حوض السباحة مجلس الشعب، وهذا قد يكون راجعا إما إلى موت الخلية أو التمايز من السابق لأوانه 1 و 6 و 7 و 8 و 9.

من خلال تحليل مناطق البطين (VZs) من organoids الدماغ صغر الرأس، تبين أن عددا كبيرا من الشخصيات الخضوع لانقسام الخلايا غير متناظرة، على عكس organoids الدماغ مشتقة من متبرع سليم (4). وكشفت التحليلات المجهرية والكيمياء الحيوية واسعة من organoids الدماغ صغر الرأس دورا غير متوقع لCPAP في أهداب في الوقت المناسب التفكيك 4. على وجه التحديد، ويرتبط CPAP تحور مع التفكيك هدب المتخلفين وتأخر دورة الخلية اعادة الدخول، مما يؤدي إلى تمايز سابق لأوانه من الشخصيات 4. وتشير هذه النتائج دور للأهداب في صغر الرأس والعشرينمشاركة الاستخراجية خلال تكوين الخلايا العصبية وحجم الدماغ السيطرة على 10.

الجزء الأول من هذا البروتوكول هو وصف لطريقة من ثلاث خطوات لتوليد organoids الدماغ متجانسة. كما ذكرت من قبل، تم تكييفها على بروتوكول لانكستر الأصلي وتعديلها لتتناسب مع هدفنا 1. أولا، iPSCs البشرية المستزرعة في حالة محددة خالية من التغذية على Engelbreth-هولم-سرب (EHS) المصفوفة. هذه الخطوة يتجنب الاختلافات المحفزة مزارع الخلايا الجذعية التي تعتمد على التغذية. في هذا البروتوكول، وتحريض التمايز العصبي لتشكيل الظهارة العصبية تبدأ مباشرة من iPSCs. من خلال تخطي الخطوة تشكيل هيئة مضغي (EB)، عائدات التمايز العصبية بطريقة أكثر رقابة وموجهة. هذا النهج يحد من تشكيل عفوية وصليات من طبقات الخلايا الجرثومية الأخرى مثل الأديم المتوسط ​​والأديم الباطن. من خلال تطبيق هذا البروتوكول، neurospheres تحتوي على ريدات العصبية يمكن أن تحصد في يوم 5 لEHS تضمين المصفوفة وثقافة تعليق ثابتة. وتستكمل المتوسط ​​عضوي الشكل المستخدمة في الخطوة الثالثة من بروتوكول لدينا مع dorsomorphin وSB431542. Dorsomorphin هو المانع جزيء صغير من البروتين morphogenic العظام (BMP)، وSB431542 يمنع TGFβ / activin / العقدي مسار الإشارات. مزيج من هذه العوامل يمكن أن تعزز التمايز العصبي أكثر كفاءة من حمض الريتينويك وحده 11 و 12 و 13 و 14.

وإجمالا، تمكن هذه التعديلات الجيل استنساخه من organoids الدماغ، مع الحد الأدنى من الاختلافات عبر organoids. الأهم من ذلك، تم تطبيق هذه الطريقة لتوليد بقوة organoids الدماغ صغر الرأس من iPSCs المرضى، والتي تحمل طفرات في الجينات التي تؤثر جسيم مركزي وديناميات دورة الخلية.

الجزء الثاني من هذا البروتوكول يعطي تعليمات لإعداد رعين organoids لتحليل وتفسير العيوب الخلوية في صغر الرأس. وهذا يشمل التثبيت، cryosectioning، تلوين مناعي، والتحليل المجهري متحد البؤر. وهذا البروتوكول توفر للقارئ وصفا مفصلا للنتائج المتوقعة ومع التوجيه للتفسير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. جيل من الدماغ Organoids (23 يوما)

  1. بدء الأديم الظاهر العصبي (5 أيام)
    ملاحظة: ينبغي النظر في النقاط التالية قبل بدء التمايز. طريقة إعادة برمجة (الخ lentiviral-، المستندة إلى الرنا الميكروي-سينداي virus-، episomal-، أو) للحصول على iPSCs الإنسان يجب أن يكون مثاليا واحدة لجميع المريض والسيطرة على خطوط IPSC. تتوفر 15، 16، 17، 18 مجموعات برمجة مختلفة والتعليمات بناء على البروتوكولات التي تم نشرها. نوعية خطوط IPSC الإنسان هو المفتاح لتحقيق والتمايز الأمثل. مراقبة مستعمرة ومورفولوجيا الخلايا تحت المجهر والتحقق من صحة تعدد القدرات عن طريق اختبار التعبير عن علامات مثل Oct3 / 4، NANOG، أو TRA-1-60.
    1. iPSCs الثقافة البشرية في ظل ظروف خالية من التغذية في المتوسط ​​وعلى طبق المغلفة مع Engelbreth-هولم-سرب(EHS) المصفوفة.
      ملاحظة: تنمو iPSCs الإنسان والحفاظ على حالة ثقافة محددة وتجنب خطوة إضافية لإزالة الخلايا المغذية الماوس الجنينية (MEFS) قبل بدء التمايز خالية من المصل خالية من وحدة التغذية. عدد مرور الأمثل لiPSCs الإنسان لبدء نطاقات التمايز من مرور 15 على إعادة برمجة لمرور 70 في المجموع. عندما الركض، فصل المستعمرات hiPSC باسم خلايا الكلي باستخدام محلول الخلايا المفرزة المناسب مع إجهاد منخفضة وماصة المصلية 2 مل لنقل الركام إلى طبق جديد. تجنب التفكك إلى خلايا واحدة، لأن ذلك قد يحفز التمايز وموت الخلايا المبرمج في معظم خطوط IPSC. وأفيد أن على المدى الطويل، الركض وحيدة الخلية يمكن أن تزيد التعديلات الجينية في الإنسان iPSCs 19 و 20. تجنب الإجراءات مفرزة الخلية، والتي تتطلب خطوة الطرد المركزي لإزالة حل مفرزة، وهذا يقلل من الجدوى الشاملة للiPSCs. اختبارجميع الثقافات عن التلوث الميكروبي وخاصة الميكوبلازما، على أساس منتظم، لأن هذا قد يغير نوعية iPSCs والقدرة على التمايز بهم.
      1. معطف 60 ملم الأنسجة صحن الثقافة مع EHS المصفوفة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      2. ذوبان الجليد قسامة من 1 × 10 6 iPSCs الإنسان. البذور وiPSCs في طبق نسيج الثقافة 60 ملم مغلفة الصحة والسلامة في المصفوفة وتحتوي على 5 مل من المتوسط A (انظر الجدول المواد). تغيير متوسطة يوميا والمرور بعد 5-7 أيام عندما تصل خلايا ~ 80٪ confluency.
        ملاحظة: تمرير iPSCs إذابة بنسبة 80٪ confluency باستخدام الأساليب القياسية، مثل مفرزة خالية من إنزيم المستعمرات 21، مرة واحدة على الأقل قبل البدء في التمايز. وباختصار، وإزالة المتوسطة IPSC، وغسل خلايا مرة واحدة مع درجة حرارة ما قبل 37 المعدلة ° C Dulbecco والمتوسطة النسر: المغذيات خليط F12 (DMEM / F12)، واحتضان iPSCs التالية الشركة المصنعةتعليمات باستخدام كاشف A (انظر الجدول المواد). لا تتجاوز فترة حضانة الموصى بها من أجل تفادي التفكك إلى الخلايا واحد. يجب فصل iPSCs الإنسان ويتحرك كما المجاميع والخلايا لا واحدة كما. أنها يمكن بعد ذلك نقل إلى أطباق جديدة المغلفة مصفوفة الصحة والسلامة. على سبيل المثال، IPSC المجاميع من يمكن توزيعها واحد طبق 60 ملم إلى 4 أطباق جديدة من عيار 60 ملم.
      3. تحقق من الميكوبلازما مع مجموعة الكشف عن الميكوبلازما وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام iPSCs فقط خالية من الميكوبلازما، والميكوبلازما يمكن أن يغير من قدرة التفريق بين iPSCs.
    2. فصل iPSCs (80٪ متموجة) وإعداد وحيدة الخلية تعليق باستخدام كاشف B.
      1. يغسل مرة واحدة مع iPSCs قبل تحسنت (37 ° C) DMEM / F12.
      2. إضافة قبل تحسنت كاشف B (على سبيل المثال، 1 مل في صحن 60 ملم) واحتضان iPSCs لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
      3. نفض الغبار 20 مرات مع بصعوبة على الجانب السفلي منطبق لفصل iPSCs. التحقق من وجود مفرزة من الخلايا تحت المجهر.
      4. ماصة تعليق الخلية صعودا وهبوطا في الطبق 5 مرات مع micropipette 1 مل.
      5. إضافة 3 مل من المتوسط ​​ولتمييع 1 مل من كاشف B وجمع تعليق خلية في أنبوب الطرد المركزي 15 مل.
      6. تدور بلطف أسفل iPSCs (500 x ج) لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      7. إعادة تعليق بيليه خلية في 1 مل من المتوسط ​​B وحساب عدد الخلايا مع عدادة الكريات.
        ملاحظة: كن على علم فقط باستخدام المتوسط ​​B لإعادة تعليق. تجنب استخدام المتوسطة A، كما أنه يحتوي على تركيز عال من اللازم bFGF، والتي قد تحول دون تمييز.
    3. تمييع تعليق خلية إلى 4.5 × 10 5 خلايا لكل مل في المتوسط B تستكمل مع المرتبطة رو 10 ميكرومتر بروتين كيناز المانع (Y-27632).
    4. إضافة 100 ميكرولتر لكل بئر في غير ملتصقة، والخامس أسفل، لوحة 96-جيدا.
      ملاحظة: تأكد من توزيع الخلايا على قدم المساواة في سوسالتقاعد عن طريق هز أنبوب كل مرة قبل أخذ 100 ميكرولتر أجزاء. من المهم أن كل بئر يجب أن تحتوي على عدد الخلايا يعادل من أجل الحصول على neurospheres متجانسة في الحجم والشكل (جولة والأسطح محددة).
    5. تدور بلطف إلى أسفل لوحة مع الخلايا في 500 x ج ودرجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق واحتضان عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪.
    6. تغيير المتوسطة يوميا عن طريق إزالة 50 ميكرولتر وإضافة 50 ميكرولتر من الطازجة المتوسطة B في كل بئر لمدة 5 أيام القادمة.

2. تضمين Neurospheres الصحة والسلامة في مصفوفة (4 أيام)

  1. إعداد المتوسطة neurosphere عن طريق خلط ما يلي: 1: 1 خليط من DMEM / F12 والمتوسطة C (ت / ت)، 1: 200 (ت / ت) الملحق 1، 1: 100 (ت / ت) ملحق 2 بدون (ث / س) فيتامين A، 1: 100 L-الجلوتامين، 0.05 ملي الأحماض الأمينية غير الأساسية (MEM)، و 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 1.6 غرام / L الأنسولين، و 0.05 ملم β-المركابتويثانول.
  2. جمع neurospheres الطرافةها 200 ميكرولتر micropipette باستخدام ملم غيض ~ 2 قطع سابقا مع مقص العقيمة.
  3. ضع neurospheres حوالي 5 ملم بعيدا عن بعضها البعض على الفيلم البارافين (3 × 3 سم 2) في طبق فارغ 100 ملم وإزالة بعناية أكبر قدر من المتوسطة المتبقية وقت ممكن.
  4. إضافة قطرة (7 ميكرولتر) من EHS مصفوفة على كل neurosphere واحد.
  5. احتضان مصفوفة EHS تنخفض مع neurospheres لمدة 15 دقيقة في حاضنة.
  6. غسل neurospheres بعناية من الفيلم البارافين عن طريق تنظيف لهم المتوسطة neurosphere. للقضاء، واستخدام 1 مل micropipette والجديد 100 ملم طبق بتري تحتوي على 10 مل من المتوسط ​​neurosphere.
  7. احتضان neurospheres لمدة 4 أيام القادمة، وإضافة 2 مل من المتوسط ​​neurosphere جديدة في يوم 2.
    ملاحظة: تأكد من أن الرفوف في حاضنة مسطحة بحيث سوف neurospheres جزءا لا يتجزأ من مصفوفة EHS لا تتجمع معا على جانب واحد من الطبق.

3. Organoids في تعليق الروتاريثقافة (14 يوم)

  1. إعداد الدماغ المتوسط ​​عضوي الشكل عن طريق خلط ما يلي: 1: 1 خليط من DMEM / F12 والمتوسطة C (ت / ت)، 1: 200 (ت / ت) الملحق 1، 1: 100 (ت / ت) ملحق 2 ث / س فيتامين A، 1: 100 L-الجلوتامين، 0.05 ملي MEM، 100 U / مل البنسلين، 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين، 1.6 غرام / L الأنسولين، و 0.5 ميكرومتر dorsomorphin، 5 ميكرومتر SB431542، و 0.05 ملم β-المركابتويثانول.
  2. إضافة 100 مل من الدماغ عضي المتوسطة إلى كل قارورة الدوار من خلال الأسلحة جانبها ووضعها في حاضنة لمرحلة ما قبل ارتفاع درجات الحرارة لمدة 20 دقيقة على الأقل.
  3. وضع برنامج التحريك في 25 دورة في الدقيقة، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    ملاحظة: قبل نقل neurospheres جزءا لا يتجزأ من مصفوفة الصحة والسلامة في قوارير الدوار، تأكد من أن يتم فصل أنهم جميعا. إذا كنت متصلا اثنين أو أكثر من خلال EHS المصفوفة، تفصل بينهما عن طريق قطع مصفوفة التواصل مع مشرط.
  4. نقل بعناية neurospheres جزءا لا يتجزأ من مصفوفة الصحة والسلامة في قوارير الدوار تحتوي على 100 مل من المتوسط ​​عضوي الشكل لناجي ماصة المصلية 2 مل. استخدام الأسلحة جانبية القارورة الدوار لنقل neurospheres في قارورة.
  5. وضع قوارير الدوار على منصة التحريك المغناطيسي في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. هذا هو اليوم 0 من الثقافة عضي.
  6. تغيير متوسطة مرة واحدة في الأسبوع (أو أكثر في كثير من الأحيان عندما يكون هناك تغير لونها) عن طريق إزالة نصف المتوسط ​​وإضافة نفس الكمية من متوسطة جديدة.
    ملاحظة: عند نقل قوارير الدوار من الحاضنة، الانتظار 3-5 دقائق للسماح للorganoids تغرق إلى أسفل القارورة. إزالة المتوسطة من خلال وضع طرف زجاج ماصة (متصلة مضخة) على سطح السائل. نضح المتوسطة بعناية من خلال فتح جانب واحد / ذراع القارورة. يجب أن يتم هذه المناورات تحت غطاء محرك السيارة الصفحي.

4. تحليل الدماغ Organoids

  1. تثبيت من organoids
    1. جمع organoids في يوم 14 من واي ثقافة الدوار قارورةث قطع 1 مل micropipette (قطع ~ 5 ملم). وضع كل منهم في صحن 60 ملم وغسلها مرة واحدة مع 5 مل من DMEM دافئ / F12 لمدة 3 دقائق.
    2. إعداد أنبوب 1.5 مل مع 500 ميكرولتر من الحارة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA).
      الحذر: ارتداء الجلد وحماية العين والعمل تحت غطاء السلامة عند التعامل مع PFA تثبيتي.
    3. وضع كل عضي على حدة في كل أنبوب واصلاحها لمدة 30 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. لا إصلاح organoids لمدة أطول من 60 دقيقة. لنقل organoids، استخدم حلقة التلقيح أو أي ابتكار الأخرى التي هي مريحة.
    4. إزالة PFA وغسل organoids الثابتة مرتين لمدة 10 دقيقة لكل منهما مع 1 مل من برنامج تلفزيوني.
    5. تخزين organoids في 1 مل من برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام، حتى استخدامها مرة أخرى.
  2. تضمين organoids لcryosectioning
    1. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من السكروز 30٪ في محلول الماء المقطر في أنبوب ليذوى organoids قبل cryofreezing عليها؛ بعد إضافة sucroحد ذاتها الحل، organoids يجب أن يتحرك على السطح. تخزين organoids بين عشية وضحاها في حل السكروز في 4 درجات مئوية. في اليوم التالي، كان ينبغي أن غرقت organoids إلى أسفل الأنبوب.
      ملاحظة: Organoids يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 3-5 أيام في 4 درجات مئوية في محلول السكروز، إذا لزم الأمر.
    2. ملء قالب الفينيل عينة مع 400 ميكرولتر من أفضل درجة حرارة القطع (أكتوبر) مركب واستخدام حلقة التلقيح لوضع عضي في وسط القالب. تسمية حافة القالب مع اسم العينة.
    3. تجميد قالب يحتوي عضوي الشكل-في -80 درجة مئوية حتى cryosectioning.
    4. cryoslides الزجاج معطف مع 0.1٪ بولي لام، ليسين حل (PLL) في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة والسماح للشرائح تجف لمدة 3 ساعات. تخزين الشرائح في 4 درجات مئوية، وتدفئة لهم حتى المعتدلة الغرفة قبل الاستخدام.
      ملاحظة: PLL طلاء خطوة هامة، لأنها سوف تمنع شرائح عضي من العائمة بعيدا. جمع وتخزين حل PLL في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 3الشهور. قبل إعادة استخدامها، تصفية مع حقنة 0.22 ميكرون والسماح لها الحارة إلى درجة حرارة الغرفة.
    5. organoids قسم cryofrozen إلى 20-50 ميكرون شرائح سميكة على الزجاج المطلي PLL-cryoslides 22. دعونا الشرائح مع أقسام تجف لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. تخزين المقاطع في -80 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.

5. مناعي تلطيخ الأقسام عضي

ملاحظة: للحصول على توصيف العام للorganoids، تلطيخ مع nestin، علامة السلف العصبية، وTUJ1، علامة عموم العصبية، فمن المستحسن. كأمثلة إضافية، مناعي تلطيخ مع الفوسفات-فيمنتين (ف فيم)، التي تصف الخلايا الدبقية شعاعي قمية الإنقسامية، وArl13b، على هدب، موصوفة. لاختبار موت الخلايا المبرمج، استخدم فحص محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز (TDT) dUTP نيك-نهاية الوسم (النفق). ضع الشرائح في علبة بلاستيكية خلال حضانات لحمايتهم من الغبار والضوء،والجفاف.

  1. ذوبان الجليد الشرائح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. تغسل الشرائح مرتين مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني-الجلايسين (0.225 غرام من الجلايسين في PBS) لمدة 3 دقائق لإرواء تألق ذاتي الناجمة PFA.
  3. Permeabilize الأقسام مع 200 ميكرولتر من 0.5٪ تريتون X100 / 0.1٪ توين في حل PBS لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. غسلها مرتين مع 200 ميكرولتر من محلول PBS-جليكاين لمدة 3 دقائق.
  5. احتضان لهم مع 200 ميكرولتر من 0.5٪ الجيلاتين الأسماك / 0.1٪ تريتون X100 في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية لمنع المستضد غير محددة ملزمة.
    ملاحظة: إذا كنت بحاجة لفحص النفق، نفذ الفحص وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. نبدأ مع فحص النفق قبل تنفيذ المناعية، لأنها قد تتداخل مع الأجسام المضادة الثانوية وإخماد fluorophores عند استخدامها بعد ذلك.
  6. تمييع الأجسام المضادة في عرقلة الحل في التركيزات التالية: nestin، 1: 200. ف فيم، 1: 500. TUJ1، 1: 200.Arl13b، 01:20. والأجسام المضادة الثانوية، 1: 1000.
  7. احتضان مع 200 ميكرولتر من أول الأجسام المضادة الأولية (على سبيل المثال، nestin) لمدة 1-2 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  8. غسل 3 × 3 دقائق مع 200 ميكرولتر من عرقلة الحل.
  9. تمييع الأول (مكافحة فأر 488) الأجسام المضادة الثانوية 1: 1000 في عرقلة الحل واحتضان الشريحة في 200 ميكرولتر لمدة 1-2 ساعات في درجة حرارة الغرفة. من الآن فصاعدا، ودائما حماية الشرائح من الضوء.
  10. غسل 3 × 3 دقائق مع 200 ميكرولتر من عرقلة الحل.
  11. احتضان مع 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المقبل (على سبيل المثال، TUJ1) لمدة 1-2 ساعات في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  12. غسل 3 × 3 دقائق مع 200 ميكرولتر من عرقلة الحل.
  13. إضافة 200 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية التالي (المضادة للأرنب 647) لمدة 1-2 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
  14. غسل 3 × 3 دقائق. مع 200 ميكرولتر من عرقلة الحل.
  15. إضافة 200 ميكرولتر من 4، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي) في 30 نانومتر اضربentration في برنامج تلفزيوني لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لتلطيخ النووي.
  16. غسل 2 × 3 دقائق مع 200 ميكرولتر من عرقلة الحل.
  17. غسل 1 × 1 دقيقة مع 200 ميليلتر من الماء المقطر، والسماح للأقسام تجف لمدة 10-20 دقيقة، حتى لا قطرة ماء وضوحا هو واضح أكثر من ذلك.
  18. جبل الأقسام مع تضمين المتوسطة. تخزينها محمية من الضوء في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى عدة أسابيع.
  19. الشروع في التحليل المجهري لصورة لمحة عامة عن، منطقة عضي البطين، لوحة القشرية البدائية، وغيرها من المجالات ذات الاهتمام.
  20. استخدام المجهر متحد البؤر مع النفط 63X مرشحات موضوعية والفلورسنت، الذي تم اختياره وفقا لالأجسام المضادة الثانوية فلوري الموسومة الصبغة المستخدمة 1، 10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

توليد organoids المخ يتطلب على الأقل ثلاثة أسابيع من زراعة المستمرة (الشكل 1A). ولتحقيق نتائج يمكن استنساخه، ونحن نوصي بأن الباحث يوثق كل خطوة، والأهم من ذلك، يتجنب أي تعديلات بشأن المكونات المتوسطة، ونقاط الوقت، والتعامل مع الخلية. هنا، نقدم ملخصا لكيفية تقييم ما إذا تم التوصل إلى معالم حاسمة من أجل الحصول على organoids ذات نوعية كافية في نهاية التجربة. وينبغي أن يكون تشكيل neurospheres في لوحة 96 جيدا واضحة للعيان من يوم 4. Neuro...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

MCPH هو اضطراب النمو العصبي البشري المعقد الذي لا يمكن تلخيصها في النماذج الحيوانية في الجسم الحي أو في نهج بسيطة زراعة الخلايا البشرية في المختبر. مظهر من مظاهر السريرية للMCPH يبدأ في الظهور خلال الأشهر الثلاثة الأولى، عندما يبدأ في وقت مبكر الخلايا العصبية. وهكذا، organoids الدماغ 3D يمثل نظام تجريبي يمكن الاعتماد عليها لنموذج التنمية MCPH. وبالإضافة إلى ذلك، 3D organoids الدماغ البشري والنهج المثالي منذ ط) أنها تسمح للتكيف طائفة من عينات المرضى مع مختلف خلفيا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة تايسن فريتز (Az.10.14.2.152). ونحن ممتنون للمنشأة تضمين الأنسجة ومرفق المجهر جوهر CMMC. ونحن ممتنون للمناقشات والدعم الفني المقدم من أعضاء مختبر الجسيم المركزي والهيكل الخلوي علم الأحياء. نشكر لي مينغ GOOI لتنقيح الكتابة المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الثانوي المضاد للماعز 488InvitrogenA-11001الماعز المضاد للفأر IgG (H + L) ، Alexa Fluor 488
المضاد للأرانب 647InvitrogenA-21245الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، Alexa Fluor 647
Arl13bproteintech17711-1-APARL13B الأرانب متعدد النسيلة الجسم المضاد   ؛
نظام CELLPINIBS Integra Bioscience183001
DAPISigma-Aldrich, US326704′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride; العديد من الموردين
DMEM / F-12Gibco, الولايات المتحدة31331093Dulbecco's Modified Eagle Medium: خليط المغذيات F-12 & nbsp;
DorsomorphinSigma-Aldrich, USP5499Compound C; موردين متعددين
تضمين متوسطAppliChemA9011, 0100Mowiol; تضمين متوسط; العديد من الموردين
Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) مصفوفةCorning354277Matrigel hESC-qualified مصفوفة; هام: hESC مؤهل
جيلاتين السمك سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدةG7765-250MLالجيلاتين من جلد أسماك الماء البارد ؛ موردين متعددين ؛ الأوتوكلاف بعد إضافته إلى PBS لإذابة وتعقيم ، وتخزينه في 4 درجات ؛ C
GlycineAppliChemA1067،1000Glycine للبيولوجيا الجزيئية ؛ موردين متعددين   ؛
حلقة التلقيح بإبرة ، يمكن التخلص منها (1 & micro; L)Sigma Aldrich ، الولايات المتحدةBR452201-1000EAموردين متعددين   ؛
الأنسولينسيجما ألدريتش ، الولايات المتحدةI3536-100MGالموردين المتعددين
L-الجلوتامينجيبكو ، الولايات المتحدة25030081L-الجلوتامين (200 مليمتر) تقنيات
الخلايا الجذعيةالمتوسطة A # 05850mTeSR1 (hiPSC متوسط) تقنيات
الخلايا الجذعيةالمتوسطة B# 05835وسط الحث العصبي (NIM) ؛ التمايز العصبي المتوسط
CGibco ، الولايات المتحدة21103049العصبي القاعدي المتوسط
MEMGibco ، الولايات المتحدة11140035MEM محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية (100x)
MycoAlert MycoAlert Mycoplasma DetectionKit Lonza ، سويسرا#LT07-218طقم الكشف عن الميكوبلازما ؛ موردين متعددين
NestinNovus biologicalsNBP1-92717الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر Nestin (4D11)
بارافورمالدهيد (PFA)AppliChemA3813 ، 05004٪ في PBS ، حل المتجر عند -20 درجة ؛ C; تحذير: ارتداء واقي للبشرة والعين والعمل تحت غطاء محرك السيارة ؛
أقراص PBSGibco ، الولايات المتحدة18912014انظر الشركة المصنعة & حاد ؛ تعليمات ق. موردين متعددين
البنسلين ستربتومايسين (10.000 وحدة / مل)جيبكو ، الولايات المتحدة15140122الموردين
العديد من حل بولي إل ليسين (PLL)سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدةP8920-100MLموردين متعددين
pVimMBLD076-3Sفوسفو فيمنتين (Ser55) كاشف
mAb A & nbsp ؛تقنيات الخلايا الجذعية# 05872ملاحظة على البروتوكول 1.1.1.2; ReLSR (اختيار الخلايا البشرية الخالية من الإنزيم ES و iPS ومرور الكاشف) ؛ يرجى اتباع manufactorer´ بروتوكول ق. المنتجات البديلة من الموردين المولين المتاحة
كاشف B & nbsp ؛Sigma-Aldrich ، محلولA6964-100MLالأمريكي هو حل إنزيمي لتفكك الخلية المفردة ؛ موردون متعددون ؛ بروتوكول 1.1.2 "حل تفكك الخلايا الأنزيمية"  
البحث Cryostat Leica CM3050 SLeica biosystemsCM3050 Sموردين متعددين
SB431542Selleckchem.comS1067موردين
متعددين قارورة سبينر 250 ملIBS Integra Bioscience182026
السكروزAppliChemA4734 ، 1000موردين متعددين
Superfrost ultra plus المجهر الشرائحالحرارية العلمية ، الولايات المتحدةيجب تسمية J3800AMNZالشرائح ب "+" ومشحونة بشكل إيجابي
الملحق 1Gibco ، ملحقالولايات المتحدة 17502048N-2 (100x)
الملحق 2 مع فيتامين أجيبكو ، مكمل12587010الأمريكي B-27 (50x) ، ناقص فيتامين أ ؛ موردين متعددين
Tissue-Tek CryomoldSakura ، NL4565موردين متعددين
مركب Tissue-Tek O.C.T.ساكورا ، هولندا4583موردين متعددين
Triton X-100AppliChemA1388،0500موردين متعددين
TUJ1Sigma-Aldrich ، الولايات المتحدةT2200& بيتا ؛ - Tubulin III (أرنب متعدد النسيلة) اختبار
TUNELPromega ، نظام TUNELالفلورومتري المسدود الأمريكي G3250 ؛ موردين متعددين
Tween 20 للبيولوجيا الجزيئيةAppliChemA4974،0500العديد من الموردين
ورقة مقاومة للماءشركة BEMIS ، inc.PM996بارافيلم " M”; موردين متعددين
Y-27632   ؛Selleckchem.comS1049ROCK inhibitor (Y-27632 2HCL) ؛ موردين متعددين
& بيتا ؛ ميركابتو إيثانولجيبكو ، الولايات المتحدة313500102-mercaptoethanol (50 mM) ؛ موردين متعددين
الجسم المضاد Accutase فيتامين

المراجع

  1. Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501, 373-379 (2013).
  2. Eiraku, M., Sasai, Y. Mouse embryonic stem cell culture for generation of three-dimensional retinal and cortical tissues. Nat Protoc. 7, 69-79 (2012).
  3. Nakano, T., et al. Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs. Cell Stem Cell. 10, 771-785 (2012).
  4. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35 (8), 803-819 (2016).
  5. Al-Dosari, M. S., Shaheen, R., Colak, D., Alkuraya, F. S. Novel CENPJ mutation causes Seckel syndrome. J Med Genet. 47, 411-414 (2010).
  6. Wollnik, B. A common mechanism for microcephaly. Nat Genet. 42, 923-924 (2010).
  7. Thornton, G. K., Woods, C. G. Primary microcephaly: do all roads lead to Rome? Trends Genet. 25, 501-510 (2009).
  8. Barbelanne, M., Tsang, W. Y. Molecular and cellular basis of autosomal recessive primary microcephaly. Biomed Res Int. 2014, 547986(2014).
  9. Homem, C. C., Repic, M., Knoblich, J. A. Proliferation control in neural stem and progenitor cells. Nat. Rev. Neurosci. 16, 647-659 (2015).
  10. Gabriel, E., et al. CPAP promotes timely cilium disassembly to maintain neural progenitor pool. EMBO J. 35, 803-819 (2016).
  11. Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. , (2012).
  12. Morizane, A., Doi, D., Kikuchi, T., Nishimura, K., Takahashi, J. Small-molecule inhibitors of bone morphogenic protein and activin/nodal signals promote highly efficient neural induction from human pluripotent stem cells. J. Neurosci. Res. 89, 117-126 (2011).
  13. Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nat Protoc. 7, 1836-1846 (2012).
  14. Zhou, J., et al. High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors. Stem Cells. 28, 1741-1750 (2010).
  15. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  16. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nat Methods. 8, 409-412 (2011).
  17. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324, 797-801 (2009).
  18. Lieu, P. T., Fontes, A., Vemuri, M. C., Macarthur, C. C. Generation of induced pluripotent stem cells with CytoTune, a non-integrating Sendai virus. Methods Mol. Biol. 997, 45-56 (2013).
  19. Bai, Q., et al. Temporal analysis of genome alterations induced by single-cell passaging in human embryonic stem cells. Stem Cells Dev. 24, 653-662 (2015).
  20. Garitaonandia, I., et al. Increased risk of genetic and epigenetic instability in human embryonic stem cells associated with specific culture conditions. PLoS One. 10, e0118307(2015).
  21. Ohnuma, K., et al. Enzyme-free passage of human pluripotent stem cells by controlling divalent cations. Sci. Rep. 4, 4646(2014).
  22. Currle, D. S., Monuki, E. S. Flash freezing and cryosectioning E12.5 mouse brain. J Vis Exp. , (2007).
  23. Yingling, J., et al. Neuroepithelial stem cell proliferation requires LIS1 for precise spindle orientation and symmetric division. Cell. 132, 474-486 (2008).
  24. Rakic, P. A small step for the cell, a giant leap for mankind: a hypothesis of neocortical expansion during evolution. Trends Neurosci. 18, 383-388 (1995).
  25. Hu, B. Y., et al. Neural differentiation of human induced pluripotent stem cells follows developmental principles but with variable potency. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 4335-4340 (2010).
  26. Wilson, P. G., Stice, S. S. Development and differentiation of neural rosettes derived from human embryonic stem cells. Stem Cell Reviews. 2, 67-77 (2006).
  27. Dhara, S. K., Stice, S. L. Neural differentiation of human embryonic stem cells. J. Cell Biochem. 105, 633-640 (2008).
  28. Christie, V. B., et al. Synthesis and evaluation of synthetic retinoid derivatives as inducers of stem cell differentiation. Org Biomol Chem. 6, 3497-3507 (2008).
  29. Kim, D. S., et al. Robust enhancement of neural differentiation from human ES and iPS cells regardless of their innate difference in differentiation propensity. Stem Cell Reviews. 6, 270-281 (2010).
  30. Gabriel, E., et al. Recent Zika Virus Isolates Induce Premature Differentiation of Neural Progenitors in Human Brain Organoids. Cell stem cell. , (2017).
  31. Wu, J., Hunt, S. D., Xue, H., Liu, Y., Darabi, R. Generation and Characterization of a MYF5 Reporter Human iPS Cell Line Using CRISPR/Cas9 Mediated Homologous Recombination. Sci. Rep. 6, 18759(2016).
  32. Li, H. L., Gee, P., Ishida, K., Hotta, A. Efficient genomic correction methods in human iPS cells using CRISPR-Cas9 system. Methods. 101, 27-35 (2016).
  33. Grobarczyk, B., Franco, B., Hanon, K., Malgrange, B. Generation of Isogenic Human iPS Cell Line Precisely Corrected by Genome Editing Using the CRISPR/Cas9 System. Stem Cell Reviews. 11, 774-787 (2015).
  34. Camp, J. G., et al. Human cerebral organoids recapitulate gene expression programs of fetal neocortex development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 112, 15672-15677 (2015).
  35. Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165, 1238-1254 (2016).
  36. Jo, J., et al. Midbrain-like Organoids from Human Pluripotent Stem Cells Contain Functional Dopaminergic and Neuromelanin-Producing Neurons. Cell Stem Cell. 19, 248-257 (2016).
  37. Mariani, J., et al. FOXG1-Dependent Dysregulation of GABA/Glutamate Neuron Differentiation in Autism Spectrum Disorders. Cell. 162, 375-390 (2015).
  38. D'Avanzo, C., et al. Alzheimer's in 3D culture: challenges and perspectives. Bioessays. 37, 1139-1148 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

جيل المستمدة IPSC-Organoids الدماغ البشري لنموذج اضطرابات النمو العصبي في وقت مبكر
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.