مقالة منهجية

تصور الأوعية بالفحص المجهري مولتيفوتون في فيفو في "الكائنات المعدلة وراثيا" سقالة 3D-بلجا/نهاب كالفاريال إصلاح العيب العظام الحرجة

DOI:

10.3791/55381

⸱

سبتمبر 7, 2017

 ,  ,  , 
1Center for Translational Medicine Research and Development, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences, 2Department of Orthopedic Surgery, Maastricht UMC+, 3Department of Orthopaedic Surgery, University Hospital RWTH, 4Research Laboratory for Biomedical Optics and Molecular Imaging, Shenzhen Institutes of Advanced Technology, Chinese Academy of Sciences

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم هنا، بروتوكولا لتصور الأوعية الدموية تشكيل في فيفو وفي الوقت الحقيقي في السقالات 3D بالفحص المجهري مولتيفوتون. ودرس الأوعية في السقالات المعدلة وراثيا في نموذج عيب مورين كالفاريال العظام حرجة. تم الكشف عن مزيد من الأوعية الدموية الجديدة في مجموعة العلاج من الضوابط.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إعادة بناء تشوهات العظام الحجم حاسمة لا يزال يمثل مشكلة سريرية خطيرة بسبب ضعف الأوعية داخل هندسة الأنسجة السقالات أثناء الإصلاح، مما يؤدي إلى عدم وجود إمدادات كافية من الدم ويسبب نخر الأنسجة الجديدة. الأوعية السريع شرطا حيويا لبقاء الأنسجة الجديدة والتكامل مع أنسجة المضيف القائمة. جيل دي نوفو المفرج في السقالات واحد من أهم الخطوات في جعل تجديد العظام أكثر كفاءة، مما يسمح لإصلاح الأنسجة أن تنمو لتصبح سقالة. لمعالجة هذه المشكلة، يستخدم التعديل الوراثي سقالة مادة بيولوجية للتعجيل بالأوعية وتكون العظم. ومع ذلك، تصور وتتبع في فيفو تشكيل الأوعية الدموية في الوقت الحقيقي والسقالات (3D) ثلاثي الأبعاد أو أنسجة العظام جديدة لا يزال عقبة لهندسة الأنسجة العظام. مولتيفوتون المجهري (أم) هي طريقة بيو-تصوير رواية التي يمكن الحصول على بيانات حجمية من الهياكل البيولوجية بصورة عالية الاستبانة وكسبها. وكان الهدف من هذه الدراسة لتصور الأوعية مع الفحص المجهري مولتيفوتون في فيفو في سقالة 3D-بلجا/نهاب معدلة وراثيا لإصلاح العيب كالفاريال العظام الحرجة. وقد فونكتيوناليزيد السقالات بلجا/نهاب لإيصال الجين ب pdgf عامل النمو تحمل ناقلات لينتيفيرال (LV-بدجفب) تيسيرا للأوعية وتعزيز التجدد العظام مستمرة. في العظام حرجة كالفاريال مزروع سقالة عيب طراز الماوس، مجالات الأوعية الدموية (بفاس) في السقالات بي كانت أعلى بكثير من درجة الحموضة السقالات. بالإضافة إلى ذلك، زيادة التعبير عن بدجف-ب والجينات المتعلقة بالأوعية، فوف و VEGFR2، في المقابل. تحليل ميكروكت أشارت إلى أن تكوين العظام الجديدة في مجموعة بي إتش بي تحسنت بشكل كبير بالمقارنة مع المجموعات الأخرى. على حد علمنا، هذا هو أول مرة استخدمت مجهرية مولتيفوتون في هندسة الأنسجة العظام للتحقيق في الأوعية في 3D سقالة القابلة للتحلل الأحيائي في فيفو وفي الوقت الحقيقي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العظم هو نسيج vascularized العالية التي لا يزال تشكيلها خلال فترة حياة الفرد1. تجديد العظام السريع والفعال لتشوهات العظام الكبيرة الناجمة عن الصدمات، ونقابية، والورم ريسيكشنز، أو تشوهات الجمجمة عملية فيزيولوجية معقدة. وتشمل النهج العلاجية التقليدية المستخدمة لإصلاح عيب العظام غرس أوتوجرافت و allograft، ولكن استخدامها ينطوي على العديد من المشاكل والقيود، مثل محدودية، والاعتلال موقع كبير من المانحين، وارتفاع مخاطر العدوى، و استضافة الرفض المناعي2،3. ومع ذلك، توفر ترقيع العظام الاصطناعية بديل فعال للتخفيف من هذه القيود. أنها يمكن أن تكون مصنوعة من مواد قابلة للتحلل وسهلة لأن اختﻻق مع حجم مسام مناسبة، ويمكن أن تكون الكائنات المعدلة وراثيا4،5.

حاليا، تم توظيف السقالات هندسة الأنسجة المختلفة في تطوير هندسة الأنسجة العظام6،7. للحث على إصلاح العظام والتجديد أكثر فعالية، ظهرت الهندسة الحيوية جنبا إلى جنب مع عوامل النمو وحققت نتائج جيدة8،9. لسوء الحظ، نصف عمر قصيرة وسهلة لتفقد النشاط وجرعة سوبرافيسيولوجيكال من عوامل النمو للفعالية العلاجية الحد على التطبيق السريري10. للتغلب على هذه المشاكل، أثبت إيصال الجينات عامل النمو بدلاً من عوامل النمو كنهج فعال للحفاظ على بيواكتيفيتي لعلاج العيوب العظمى والأمراض11،12. النواقل الفيروسية إيصال واعدة أدوات لتجديد الأنسجة نتيجة عالية على التعبير عن الكفاءة13.

بين عوامل النمو، عوامل النمو المشتقة من الصفيحات (PDGF-BB) تم اختيارها في هذه الدراسة لأنها ليس فقط mitogen وتشيمواتراكتانت لخلايا mesenchymal وأوستيوجينيك، ولكن أيضا منشط للأوعية14،15 . وأظهرت الدراسات السريرية والسريرية السابقة أن PDGF-BB يمكن تعزيز إصلاح العظام في اللثة العيوب العظمى16،17بأمان وفعالية. وكشفت الدراسات التي أجريت مؤخرا أن يحفز PDGF-BB تولد الأوعية بتحفيز الخلايا غشائي الهجرة والانتشار في فيفو18،19. وعلاوة على ذلك، PDGF-BB يمكن أن تجعل أيضا الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) قادرة على التفريق في خلايا بطانية20، وهذا يسلط الضوء على مواصلة الدور المحتمل ل MSCs في نيوفاسكولاريزيشن. ولذلك، الذي يحفز تشكيل حيثياته المفرج في السقالات مع PDGF-BB خطوة هامة لإصلاح الأنسجة التي نمت في السقالات في هندسة الأنسجة العظام.

شفاء عيب العظام هو عملية morphogenetic أنسجة حيوية تتطلب منسقة تكون العظم والأوعية في مواقف إصلاح21. هو نيوانجيوجينيسيس إلى السقالات هندسة الأنسجة مزروع شرطا مسبقاً أساسيا لتزويد الخلايا بالمغذيات والأكسجين للنمو والبقاء على قيد الحياة وإزالة النفايات الأيضية. يشيع استخدام أساليب التصوير، بما في ذلك الأشعة السينية الصغرى-حسبت التصوير المقطعي (ميكروكت) والتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) والمسح الضوئي المجهر الإلكتروني (SEM)، والتصوير المقطعي التماسك الضوئية (OCT) والليزر [كنفوكل] الفحص المجهري، يتم تطبيق بدلاً من الفحص النسيجي للحصول على الأوعية المعلومات22،23. ومع ذلك، هذه الأساليب عقبات مختلفة في تصور وقياس نيوفاسكولاتوري في 3D السقالات في هندسة الأنسجة العظام. مولتيفوتون المجهري (أم) هو تقنية بيو-تصوير رواية نسبيا يحتوي على ميزة واضحة في نفس الوقت تصور الخلايا، المصفوفة خارج الخلية، والمحيطة بشبكات الأوعية الدموية في المجراة. أنها تمتلك قدرة تصوير ثلاثي الأبعاد الملازمة لاختراق الأنسجة العميقة ويسبب د منخفضة. أم في العقد الماضي، ومن ثم فقد اكتسب الكثير من الاهتمام في الدراسات الطبية24، بما في ذلك في علم الأعصاب، وعلم المناعة، وديناميات الخلايا الجذعية. ومع ذلك، يتم استخدامه بالكاد في أبحاث العظام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العناية بالحيوان كان امتثالا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات مقاطعة قوانغدونغ المختبر. وأجريت جميع الإجراءات تحت إشراف وموافقة "لجنة الأخلاقيات" "بحوث الحيوان"، شنتشن معاهد للتكنولوجيا المتقدمة، الأكاديمية الصينية للعلوم-

1-إنتاج لينتيفيرال (LV)

  1. استنساخ كدنا pdgf-ب إلى ناقل تعبير لينتيفيرال (pLenti6/5-اجفب أو اجفب LV) متعددة-استنساخ مخصصة موقع المصب من المروج الفيروس المضخم للخلايا باستخدام الدائرة الأولى وسأل أنا تقييد مواقع لتشييد بلازميد pLenti6/5-بدجفب-اجفب (LV-بدجفب) 25-
  2. إنتاج جزيئات لينتيفيرال (LV-بدجفب) من الخلايا HEK-293 مترا بالتعاون ترانسفيكتينج مع الفيروس والبلازميدات التغليف (pLP1 و pLP2 وبفسف-ز) باستخدام الأسلوب القياسي من فوسفات الكالسيوم مع الكلوروكين (التركيز النهائي: 25 ميكرومتر) 25-
  3. بعد 48 ساعة تعداء، الحصاد وتصفية 500 مل المحتوية على الفيروس طافية مع عامل تصفية (0.45 ميكرومتر). وفي وقت لاحق، تركز الجزيئات الفيروسية تنبيذ فائق في س 89,000 ز 2 حاء ريسوسبيند في 200 ميليلتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS)، الكوة، وتخزين في-80 درجة مئوية.
  4. لتحديد عيار lentivirus، احتضان خلايا HEK293T مع الحل لينتيفيرال متسلسل المخفف ح 24 وحساب عيار لينتيفيرال، كما هو موضح سابقا 25-

2. تصنيع السقالات بلجا/نهاب طباعة 3D وتجميد LV

المواد
  1. ز حل 20 من بلجا (بولي د، للاكتيدي-co-جليكوليدي) في 20 مل من 1، 4-ديوكساني أن يشكل حلاً متجانسة. إضافة 2 غ نانوسيزيد هاب (نانو-هيدروكسياباتيدي) مسحوق (نهاب) إلى الحل؛ بلجا: ينبغي أن نهاب نسبة 10:1 (w/w).
  2. إثارة الحل مختلطة بشدة (إثارة السرعة: 1500 دورة في الدقيقة) في درجة حرارة الغرفة ح 16 استخدام محرض مغناطيسي لتشكيل عجينة موحدة. اختﻻق في مسامية السقالات بلجا/نهاب استخدام طابعة درجات الحرارة المنخفضة ثلاثية الأبعاد مع فوهة محوسبة تودع أسفل طبقة بطبقة، لصق إلى أعلى، وفقا نموذج تم تصميمه مسبقاً 26؛ أحجام مسام من السقالات تتراوح بين 200 إلى 400 ميكرون.
    3. فريزيدري
  3. فراغ السقالات عن 48 ساعة لإزالة المذيبات تماما قدر الإمكان. نقع السقالات في الحل الإيثانول 75% ح 1 للتعقيم وليوفيليزي للحصول على السقالات محايدة والعقيم.
    ملاحظة: تشمل المعلمات الرئيسية للتجميد فراغ التكثيف درجة الحرارة (درجة مئوية) ودرجة فراغ السلطة (الفلسطينية). تحت درجة 45 فراغ السلطة الفلسطينية، كانت السقالات بلجا/نهاب فراغ المجفف في-78 درجة مئوية ح 48 دقة إزالة المذيب.
  4. إضافة 10 ميليلتر من الجسيمات LV (4.5 × 10 5) لكل بلجا/نهاب سقالة (4 مم × 4 مم × 2 مم) واحتضان السقالات ح 2 في 37 درجة مئوية في حاضنة هوميديفيد للسماح الامتزاز.
  5. بعد التثبيت، شطف السقالات مرتين مع برنامج تلفزيوني لإزالة الجسيمات LV غير منضم. الأداة الإضافية-تجميد السقالات المغلفة بالجسيمات LV في النتروجين السائل وليوفيليزي مرة أخرى وتخزينها في-80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.

3. في المختبر حركية LV الجسيمات الإفراج من السقالات وتوصيل LV نشاط الإنزيم

  1. إينكوباتي 3D السقالات (4 مم × 4 مم × 2 مم) تحمل LV-أخضر نيون البروتين (LV-اجفب، 4.5 × 10 5 LV الجسيمات) في 1 مل دميم كاملة في 2.0 مل المبردة قارورة في 37 درجة مئوية مع الرج لمدة 5 أيام-
  2. أخذ عينة 1 مل كل ح 12 من 12 ساعة إلى 120 ساعة بعد انتهاء الحضانة، واستبدال المتوسطة. عند كل نقطة الوقت، أضف 1 مل متوسطة جديدة بدلاً من 1 مل من الحضانة المتوسطة-
  3. استخدام الوسائط التي تم جمعها إلى ترانسدوسي HEK293T الخلايا التي تفرخ المشترك ل 48 h. تدبير العدد من النشطة بيولوجيا الجزيئات LV بتحديد عدد المصابات بالتجارة والنقل HEK293T الخلايا بالتدفق الخلوي 27-
    1. قبل ترانسدوسينج الخلايا HEK293T، إزالة المتوسطة الثقافة وشطف الخلايا HEK293T مرتين مع برنامج تلفزيوني. إضافة وسائط الإعلام المجمعة التي تحتوي على لينتيفيروس أفرج عنه من السقالات للبئر (1 مل/جيد) والثقافة مع الخلايا HEK293T عن 48 ساعة عند 37 درجة مئوية في حاضنة هوميديفيد.

4. في المختبر تقييم للهجرة "لجنة السلامة البحرية" (بمسك) المشتقة من نخاع العظم

  1. قبل فحص الهجرة، إعداد بمسكس الإعراب عن الطماطم الفلورسنت البروتين (بمسكس-T) و البروتين (بمسكس ف) BB بدجف- 28-
  2. إجراء المقايسة الهجرة بمسك بدائرة Boyden استخدام لوحة 24-جيدا ومرشحات البولي مع حجم مسام ميكرومتر 8-
    1. مكان 0.5 مل بمسكس (5 × 10 4) transfected مع LV معربا عن الطماطم الفلورسنت البروتين (بمسكس-T) في الدوائر العليا. ضع 0.5 مل بمسكس (2 × 10 5) transfected مع LV معربا عن PDGF-BB البروتين (بمسكس ف) في الغرف السفلية.
  3. وتشمل ست مجموعات في هذه التجربة وإضافة 500 ميليلتر إلى حجرة أقل من كل بئر.
    ألف فارغة التحكم، خالية من المصل المتوسط فقط
    FBS باء التحكم، المتوسطة وتستكمل مع 10% FBS
    السيطرة جيم PDGF-BB, 4 نانوغرام/مليلتر PDGF BB في المتوسط خالية من المصل
    دال PDGF-BB تغتنم المجموعة، PDGF-BB (4 نانوغرام/مليلتر) والأجسام المضادة-بدجف-BB (4 نانوغرام/مليلتر) [بولكلونل] في المتوسط خالية من المصل
    الفريق بمسك هاء، 2 × 10 5 بمسكس في المتوسط خالية من المصل
    مجموعة ف. بمسكس-س، 2 × 10 5 ف بمسكس في المصل المتوسطة الحرة.
  4. احتضانها ل 48 ساعة في 5% CO 2 و 37 درجة مئوية في حاضنة هوميديفيد. وبعد ذلك، إزالة الخلايا التي تم ترحيلها على الجانب السفلي من الدائرة وجمعها للتحديد الكمي لعدد بمسكس-T بالتدفق الخلوي-
    1. إزالة الجانب استخدام مكشطة خلية من الخلايا التي تم ترحيلها في مجلس النواب وريسوسبيند الخلايا التي تم ترحيلها مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. تحديد عدد تي بمسكس التي تم ترحيلها بالتدفق الخلوي 29-

5. إنشاء الحرجة كالفاريال موريني العظام عيب النموذجي وزرع السقالة

ملاحظة: الفئران الذكور بالب/c (7 أسابيع) تم شراؤها من قوانغدونغ المركز الطبي للمختبرات الحيوانية (قوانغدونغ، الصين)-

تجربة
  1. تسجيل ما مجموعة 42 الفئران الذكور لعيب كالفاريال العظام. تقسيم الفئران عشوائياً إلى ثلاث مجموعات، مع 14 شخصا في كل مجموعة لتلقي العلاجات التالية: المجموعة أ، لا يزرع؛ المجموعة ب، السقالات PH مزروع (بلجا/نهاب)؛ و "المجموعة جيم"، السقالات بي مزروع (بلجا/نهاب/LV-بدجفب)-
  2. تخدير الحيوانات مع الإدارة داخل للصوديوم بينتوباربيتال (50 مغ/كغ). إزالة الفراء مع لصق مزيل الشعر وتنظيف الجلد الرأس مع 75% من محلول الكحول قبل إجراء الشق الأول. فيكس رئيس كل الماوس مع صك المناظير باستخدام الأشعة للحفاظ على ما زال أثناء الجراحة.
  3. جعل شق أولية مع مشرط وثم تكبيره فيتح مقص لإنشاء شق جلد 1 سم خطية. تتخلص من السمحاق من العظم للجمجمة لتكشف عن سطح العظام الجمجمة باستخدام مسحه القطن معقمة.
  4. استخدام لدغ ترفين لإنشاء عيب حرجة حجم قطرها 4 ملم في الجانب الأيسر من كالفاريا 30. زرع السقالة في الموقع خلل العظام.
    ملاحظة: تم تعريف العيوب الحجم الحرج (كسدس) أصلاً ك " أصغر حجم إينتراوسيوس الجرح في العظام خاصة والأنواع الحيوانية التي لا تشفي تلقائياً خلال فترة حياة الحيوان. " في هذه التجربة، عيب 4 مم-قطر عيب عظم حجم حرجة، وفقا لسبق دراسة 31 ، 32.
  5. استخدام الملقط العيون لنقل السمحاق العودة بلطف إلى تغطية موقع الجراحية. خياطة الجلد قطعي مع ثلاثة غرز كل سم.
  6. أداء الرعاية بوستوبيراشونال. إدارة البوبرينورفين مسكن (0.1 مغ/كغ) لتخفيف الألم. الحفاظ على درجة حرارة الجسم مع وسادة تدفئة حتى يوقظ الحيوان. وفي وقت لاحق، تغذية الحيوانات بالغذاء والماء وتسجيل نشاطهم كل يوم حتى نهاية الاختبار. ملاحظة: يمكن أن تدار التسكين قبل الإجراءات الاعتماد الخاصة بك الرعاية الحيوانية المحلية اللجنة التوجيهية.

6. في فيفو تصوير الأوعية داخل العظام العيب بام

ملاحظة: مترافق FITC 250 دينار كويتي ديكستران (10 مغ/مل) في المحلول الملحي كان حقن الوريد في الفئران للحصول على عالية-دائرة الاستخبارات الوطنية (نسبة الإشارة إلى الضوضاء) صور للأوعية الدموية الجديدة ووفقا دراسة سابقة 33. يرجى ملاحظة أن هذا هو الإجراء البقاء على قيد الحياة.

  1. تجميع نظام الفحص المجهري مولتيفوتون (أم) اثنين-فوتون متحمس الفلورية (تبيف) وجيل التوافقي الثاني إشارة (SHG) تصوير-
  2. تخدير الحيوانات مع حقن داخل بينتوباربيتال الصوديوم (50 مغ/كغ) وشل الحيوانات على لوحة تدفئة الاحتفاظ درجة حرارة الجسم عند 37 درجة مئوية في جميع أنحاء هذه التجارب. استخدام غاز isoflurane 3.0 في المائة في الأكسجين 100% للحفاظ على مرض التخدير والتسكين أثناء عملية التصوير. حقن المحلول الملحي (200 ميليلتر في الحيوان) منع الجفاف قبل التصوير إينترابيريتونيلي.
  3. لحن ليزر femtosecond تي-ياقوت إلى 860 نانومتر. إنشاء مساحة 512 × 512 ميكرومتر أخذ عينات عن طريق مسح زوج من المرايا galvo واستخدام عدسة الهدف غمر المياه NA1.0 لشعاع الإثارة فوكوسثي في العينة وجمع إشارة تبيف/SHG المستطار.
    ملاحظة: أجريت التصوير في المنزل-مولتيفوتون المجهري تصوير نظام البناء (أم). أثناء التصوير، تم ضبطها ليزر femtosecond تي-ياقوت إلى 860 نانومتر كالطول الموجي الإثارة الأمثل. وكان شعاع الليزر النقطية الممسوحة ضوئياً عبر طائرة عينة باستخدام زوج من المرايا جلفانومتر. بعد مرورها عبر مرآة مزدوج اللون من 685 نانومتر، الشعاع انصب على العينة بهدف X NA1.0 20. وجمعت الإشارات تبيف و SHG المستحث بنفس الهدف. تم تقسيم الإشارات من الليزر الإثارة من مرآة مزدوج اللون المذكورة أعلاه وتنقيته من مرشح تمرير قصيرة 680 نانومتر. إشارات تبيف و SHG جمعتها حزمة ألياف وأجرى إلى مرسمه طيف. وكان الكاشف في مرسمه طيف مجموعة خطية من أنابيب ضوئي (بمتس). المزيج من مرسمه طيف و PMTs صفيف خطية تقدم القدرة على تسجيل الإشارات في نطاقات طيفية 16 على التوالي، من 400 نانومتر إلى 600 نانومتر، على فترات 12.5-شمال البحر الأبيض المتوسط. ولذلك، كشف في الوقت نفسه إشارات تبيف و SHG وفصل في النطاقات الطيفية. وعلاوة على ذلك، استخدمت لتصوير ثلاثي الأبعاد، محرك محوري التحكم في عمق التصوير. تم تعيين مجال كل صورة إلى 512 × 512 ميكرومتر، وتم تعيين الفاصل الزمني العمق إلى 2 ميكرومتر (مجموعة المراقبة، 5 ميكرومتر). جدير بالذكر أن 5 مواقع في كل عيب تم تصويرها لجمع البيانات إحصائيا، ومواقع تصوير مختارة ووزعت بالتساوي وعشوائياً على طول العيب.
  4. 5 مسح المواقع على كل عيب لجمع البيانات ذات دلالة إحصائية لقياس تشكيل السفينة.
    1. استخدام مسح مواقع موزعة بالتساوي وعشوائياً على طول العيب. لمجموعة المراقبة، بالميدان لمشاهدة غلاف (FOV) منطقة العظم الأصلي وحافة العيب، ولكن للأس الهيدروجيني وبي المجموعات، فوف على سقالة مزروع.
    2. شق جلد خطي 1 سم باستخدام مشرط وخياطة الجلد مفتوحة لتثبيت البرنامج للكشف عن موقع الزرع. استخدام المحاقن لوضع قطره الماء بين غمس العدسة وزرع شكل كوب الماء.
  5. الحصول على صورة مكدسات كل 12 s على ح 2 التصوير الفترة. عرض وتحليل البيانات الحجمي باستخدام برنامج MATLAB مخصص وتحديد مجالات الأوعية الدموية مع ImageJ البرمجيات 34 ، 35-

7. تحليل التعبير الجينات pdgf-ب والجينات المتعلقة بالأوعية ب RT-قبكر

ملاحظة: بكر كان يؤديها اتباع الخطوات المعتادة: 95 درجة مئوية لمدة 30 s، دورات 40 من 95 درجة مئوية 5 s، و 60 درجة مئوية لصهر 30 وظيفة-بكر س. منحنيات أكدت خصوصية التضخيم الهدف واحد، وتقرر تغيير حظيرة من الجينات ذات الأهمية بالنسبة إلى β-أكتين. أن رد الفعل لكل عينة تم اختبارها ثلاث مرات-

  1. حصاد مزروع السقالات والأنسجة من الفئران التجريبية في 2 و 4 و 8 أسابيع بعد انتهاء العملية 36؛ ومراقبة العينات المجموعة (n = 4)، المتخذة في نفس الوقت النقاط، يجب أن تكون من نسيج العظام المجاورة.
    ملاحظة: في كل مرة نقطة (2، 4، و 8 أسابيع)، euthanized الفئران مع استنشاق أول أكسيد الكربون 2. تشريح في كالفاريا، وبعد ذلك، إزالة وحصاد السقالات مزروع من كالفاريا.
  2. استخدام كاشف تجارية استخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي من كل عينة حسب الشركة المصنعة ' بروتوكول s. استخدام "أدوات النسخ العكسي" لعكس-نسخ الجيش الملكي النيبالي في كدنا عقب الشركة المصنعة ' بروتوكول s-
  3. إجراء الكمي PCR في الوقت الحقيقي باستخدام "نظام كشف الأخضر سيبر"؛ الإشعال ترد في الجدول 1-
Primer(5'–3')
الجينات إلى الأمام عكس
بدجفب كاتككجكتككتتجاتجاتكت جتجكتكججتكاتجتكاجت
فوف كتكتتجججاكجاكتكاتك تكككجاجاتجاجاجاك
VEGFR2 AG جااتجاكاكتجاجككتاكا ز تككاتجكتجتكاكتاكاجا
β-أكتين AGG جتاتككاتجااتاجتجتاك قبل CAAT جكاجتاكاتاتتاكاكاجاج

الجدول 1: مجموعات بيمير.

8-التحليل ميكروكت التجدد العظام

  1. يوثانيزي الفئران مع استنشاق أول أكسيد الكربون 2 في 8 أسابيع بعد انتهاء العملية. في بيئة جيدة التهوية، بلطف ضع كل الماوس داخل قفص ماوس نظيفة وضخ غاز CO 2 إلى القفص تخدير الفئران قبل القتل الرحيم.
  2. تشريح الجمجمة لتصوير ميكروكت من منطقة عيب العظام. المستخدم التالي مسح معلمات في التجارب: 9 ميكرومتر القرار، 50 كيلوفولت الجهد وال 0.5 ملم التصفية والحالي 142 µA.
    3. ركن
  3. البنية جميع بيانات التصوير باستخدام البرمجيات التجارية التي تقدمها الشركة. معايرة عمليات التفحص باستخدام الدالة المعايرة للبرمجيات كتان.
    ملاحظة: وضع وحدة هاونسفيلد (هو جين تاو) تحت الفئران في كل عملية مسح.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بلجا مسامية أسطواني/نهاب السقالات 0.6 مم في الارتفاع، وكانت ملفقة قطرها 4 ملم مع طابعة 3D. مورفولوجيس من السقالات حللت عن طريق المسح الضوئي المجهر الإلكتروني وميكروكت. ويبين الشكل 1A صورة سقالة مزروع. وكشف المسح ميكروكت أن أكثر من 85% المسام أحجام تتراوح بين 200 إلى 400 ميكرون (الشكل 1B). أظهر تصوير وزارة شؤون المرأة أن سطح السقالة من ميكروتوبوجرافي الخام، مع ميكروبوريس (أقطار حوالي 5-10 ميكرون) التي مترابطة داخل السقالات (الشكل 1...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العظم نسيج vascularized عاليا بقدرة فريدة على استمرار الشفاء وإعادة تشكيلها طوال عمر على الفردية1. مستوى الأوعية الدموية مهم لإصلاح تكون العظم وعيب. الأوعية منخفضة يحد التطبيق السريري واسعة لهندسة الأنسجة العظام. بناء العظام هندسة الأنسجة عالية vascularized وفقا لنظرية بيوميميتيقا أصبح أداة لإصلاح تشوهات العظام شريحة كبيرة. أنواع مختلفة من السقالات طبقت بنجاح لإصلاح العيوب العظمى صغيرة نسبيا. ومع ذلك، لعيوب العظام الحرجة، تطبيق السقالات لإصلاح ما زال يواجه عقبات، أساسا بسبب عدم كفاية الدم توريد لإ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذه الدراسة وكان يدعمها "البرنامج الطاووس شنتشن"، الصين (رقم 110811003586331)، برنامج البحوث الأساسية شنتشن (رقم JCYJ20150401150223631، رقم JCYJ20150401145529020، ورقم JCYJ20160331190714896)، قوانغدونغ العامة البحوث وبناء القدرات الخاصة البرنامج (رقم 2015A020212030)، ومؤسسة العلوم الطبيعية الوطنية الصينية (رقم 81501893)، وبرنامج البحوث الأساسية الوطنية الكبرى للصين (2013CB945503)، برنامج الابتكار سيت للباحثين الشباب ممتازة (Y5G010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
بولي (D ، L-lactide-co-glycolide) (PLGA)SigmaP1941L / G نسبة 75:25 ، MW 66000-107000
جسيمات هيدروكسيباتيت النانويةSigma702153متوسط القطر < 200 نانومتر
ملح ثنائي فوسفات الكلوروكينSigmaC6628
FITC مترافق 250 كيلو دالتون ديكسترانSigmaFD250S
1،4-dioxanelingfeng ، مرشحات شنغهاي0.45 ميكرون
StericupMerck MilliporeCorporation SLHV033RB
PDGF-BB CdnaSino Biological، IncMZ50801-G
Anti-PDGF-BB الفأر متعدد النسيلة  ؛ BioVision، Inc5489-30T
PDGF-BB بروتين4489-50
محلول تعدين الكالسيوم والفوسفاتPromega CorporationE1200
L-DMEMHycloneSH30021.01
DPBSHycloneSH30028.01
البنسلين الستربتومايسين ، السائلالحراري فيشر العلمي15140122
FBSThermo Fisher Scientific10099-141
Transwell Corning3422
ذكر BALB / c الفئرانGuangdong المختبر الطبي مركز   ;
بنتوباربيتال الصوديوم ميرك1063180500
الفحصمحلي الصنع في معاهد شنتشن للتكنولوجيا المتقدمة للكشف عن التألق المتحمس ثنائي الفوتون (TPEF) وإشارة التوليد التوافقي الثاني (SHG).
isofluraneKeyuan ، كاشف شاندونغ401750169
TRIzolInvitrogen15596018
PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) TakaraRR420B
SYBR Premix Ex Taq (Tli RNaseH Plus)TakaraRR036B
Hematoxylin و eosinBeyotimeC0105
ParaffinLeica & نب سب.RM2235
جهاز طرد مركزي فائق OPtima L-100XPBeckman CoulterL-100XP
طابعة ذات درجة حرارة منخفضة تسينغهوامحلية الصنع في جامعة تسينغهوا
LightCycler 480 أداة  روش5815916001
microCTBruker1176
البرمجيات التجاريةBruker
Buprenorphine
شركة مؤتلف المجهري متعدد الفوتون جامعة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, X., et al. GPNMB enhances bone regeneration by promoting angiogenesis and osteogenesis: potential role for tissue engineering bone. J Cell Biochem. 114 (12), 2729-2737 (2013).
  2. Schroeder, J. E., Mosheiff, R. Tissue engineering approaches for bone repair: concepts and evidence. Injury. 42 (6), 609-613 (2011).
  3. Chiarello, E., et al. allograft and bone substitutes in reconstructive orthopedic surgery. Aging Clin Exp Res. 25, S101-S103 (2013).
  4. Elangovan, S., et al. The enhancement of bone regeneration by gene activated matrix encoding for platelet derived growth factor. Biomaterials. 35 (2), 737-747 (2014).
  5. Bouyer, M., et al. Surface delivery of tunable doses of BMP-2 from an adaptable polymeric scaffold induces volumetric bone regeneration. Biomaterials. 104, 168-181 (2016).
  6. Rezwan, K., et al. Biodegradable and bioactive porous polymer/inorganic composite scaffolds for bone tissue engineering. Biomaterials. 27 (18), 3413-3431 (2006).
  7. Burg, K. J., Porter, S., Kellam, J. F. Biomaterial developments for bone tissue engineering. Biomaterials. 21 (23), 2347-2359 (2000).
  8. Xiao, Y., et al. Modifications of collagen-based biomaterials with immobilized growth factors or peptides. Methods. 84, 44-52 (2015).
  9. Chen, G., Lv, Y. Immobilization and Application of Electrospun Nanofiber Scaffold-based Growth Factor in Bone Tissue Engineering. Curr Pharm Des. 21 (15), 1967-1978 (2015).
  10. Kofron, M. D., Li, X., Laurencin, C. T. Protein- and gene-based tissue engineering in bone repair. Curr Opin Biotechnol. 15 (5), 399-405 (2004).
  11. Chen, F. M., et al. New insights into and novel applications of release technology for periodontal reconstructive therapies. J Control Release. 149 (2), 92-110 (2011).
  12. Winn, S. R., et al. Gene therapy approaches for modulating bone regeneration. Adv Drug Deliv Rev. 42 (1-2), 121-138 (2000).
  13. Chang, P. C., et al. Adenovirus Encoding Human Platelet-Derived Growth Factor-B Delivered to Alveolar Bone Defects Exhibits Safety and Biodistribution Profiles Favorable for Clinical Use. Hum Gene Ther. 20 (5), 486-496 (2009).
  14. Phipps, M. C., Xu, Y. Y., Bellis, S. L. Delivery of Platelet-Derived Growth Factor as a Chemotactic Factor for Mesenchymal Stem Cells by Bone-Mimetic Electrospun Scaffolds. Plos One. 7 (7), (2012).
  15. Gehmert, S., et al. Angiogenesis: The role of PDGF-BB on Adiopse-tissue derived Stem Cells (ASCs). Clin Hemorheol and Microcirc. 48 (1-3), 5-13 (2011).
  16. Chang, P. C., et al. PDGF-B gene therapy accelerates bone engineering and oral implant osseointegration. Gene Ther. 17 (1), 95-104 (2010).
  17. Javed, F., et al. Significance of the platelet-derived growth factor in periodontal tissue regeneration. Arch Oral Biol. 56 (12), 1476-1484 (2011).
  18. Murali, R., et al. Biomimetic hybrid porous scaffolds immobilized with platelet derived growth factor-BB promote cellularization and vascularization in tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 104 (2), 388-396 (2016).
  19. Andrae, J., Gallini, R., Betsholtz, C. Role of platelet-derived growth factors in physiology and medicine. Genes Dev. 22 (10), 1276-1312 (2008).
  20. Wosnitza, M., et al. Plasticity of human adipose stem cells to perform adipogenic and endothelial differentiation. Differentiation. 75 (1), 12-23 (2007).
  21. Hankenson, K. D., et al. Angiogenesis in bone regeneration. Injury. 42 (6), 556-561 (2011).
  22. Schmidt, C., et al. Rapid three-dimensional quantification of VEGF-induced scaffold neovascularisation by microcomputed tomography. Biomaterials. 30 (30), 5959-5968 (2009).
  23. Perng, C. K., et al. In Vivo Angiogenesis Effect of Porous Collagen Scaffold with Hyaluronic Acid Oligosaccharides. J Surg Res. 168 (1), 9-15 (2011).
  24. Sun, Y., et al. Imaging tissue engineering scaffolds using multiphoton microscopy. Microsc Res Tech. 71 (2), 140-145 (2008).
  25. Fan, X., et al. Noninvasive monitoring of placenta-specific transgene expression by bioluminescence imaging. PLoS One. 6 (1), e16348(2011).
  26. Yeo, M. G., Kim, G. H. Preparation and Characterization of 3D Composite Scaffolds Based on Rapid-Prototyped PCL/β-TCP Struts and Electrospun PCL Coated with Collagen and HA for Bone Regeneration. Chem Mater. 24 (5), 903-913 (2012).
  27. Mao, Y., et al. Lentiviral Vectors Mediate Long-Term and High Efficiency Transgene Expression in HEK 293T cells. Int J Med Sci. 12 (5), 407-415 (2015).
  28. Li, J., et al. Investigation of angiogenesis in bioactive 3-dimensional poly (D,L-lactide-co-glycolide)/nano-hydroxyapatite scaffolds by in vivo multiphoton microscopy in murine calvarial critical bone defect. Acta Biomater. 42, 389-399 (2016).
  29. Abbasi, H., et al. Lentiviral vector-mediated transduction of goat undifferentiated spermatogonia. Anim Reprod Sci. 163, 10-17 (2015).
  30. Pigossi, S. C., et al. Bacterial cellulose-hydroxyapatite composites with osteogenic growth peptide (OGP) or pentapeptide OGP on bone regeneration in critical-size calvarial defect model. J Biomed Mater Res A. , (2015).
  31. Bos, G. D., et al. The effect of histocompatibility matching on canine frozen bone allografts. J Bone Joint Surg Am. 65 (1), 89-96 (1983).
  32. Hollinger, J. O., Kleinschmidt, J. C. The critical size defect as an experimental model to test bone repair materials. J Craniofac Surg. 1 (1), 60-68 (1990).
  33. Hollanders, K., et al. Bevacizumab Revisited: Its Use in Different Mouse Models of Ocular Pathologies. Curr Eye Res. 40 (6), 611-621 (2015).
  34. Gao, L. QSIM: quantitative structured illumination microscopy image processing in ImageJ. Biomed Eng Online. 14, 4(2015).
  35. Kobat, D., et al. Deep tissue multiphoton microscopy using longer wavelength excitation. Opt Express. 17 (16), 13354-13364 (2009).
  36. Lohmann, P., et al. Bone regeneration induced by a 3D architectured hydrogel in a rat critical-size calvarial defect. Biomaterials. 113, 158-169 (2016).
  37. Lv, J., et al. Enhanced angiogenesis and osteogenesis in critical bone defects by the controlled release of BMP-2 and VEGF: implantation of electron beam melting-fabricated porous Ti6Al4V scaffolds incorporating growth factor-doped fibrin glue. Biomed Mater. 10 (3), (2015).
  38. Guldberg, R. E., et al. 3D imaging of tissue integration with porous biomaterials. Biomaterials. 29 (28), 3757-3761 (2008).
  39. Boehler, R. M., et al. A PLG/HAp composite scaffold for lentivirus delivery. Biomaterials. 34 (21), 5431-5438 (2013).
  40. Heo, S. J., et al. Fabrication and characterization of novel nano- and micro-HA/PCL composite scaffolds using a modified rapid prototyping process. J Biomed Mater Res A. 89 (1), 108-116 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Multiphoton MicroscopyAngiogenesis VisualizationPLGA nHAp ScaffoldCalvarial Bone DefectLentiviral Vector DeliveryIn Vivo ImagingBlood Vessel AreaFlow Cytometry AnalysisMicroCT Bone FormationGenetic Scaffold Modification

مقالات ذات صلة