مقالة منهجية

تحليل الخلايا الليمفاوية التسرب باستخدام في المختبر نموذج من الدم في الدماغ الإنسان الحاجز

DOI:

10.3791/55390

⸱

أبريل 5, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neurology with Institute of Translational Neurology, University Hospital Münster

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف نموذج الحاجز الدموي الدماغي البشري الذي يتيح التحقيق في انتقال الخلايا الليمفاوية إلى الجهاز العصبي المركزي في المختبر.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لمفاوية تسرب في النظام العصبي المركزي (CNS) أمر بالغ الأهمية لمراقبة المناعية. التعديلات المتعلقة مرض تسرب الخلايا اللمفاوية قد يؤدي إلى تغيرات الفيزيولوجية المرضية في الجهاز العصبي المركزي. وهكذا، والتحقيق في هجرة الخلايا اللمفاوية في الجهاز العصبي المركزي مهم لفهم الأمراض CNS التهابات وتطوير طرق العلاج الجديدة. هنا نقدم نموذجا في المختبر من حاجز الدم في الدماغ البشري لدراسة الخلايا اللمفاوية التسرب. تزرع الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ البشري الخلايا البطانية (HBMEC) confluently على البولي ايثلين مسامية transwell إدراج لتقليد البطانة من حاجز الدم في الدماغ. التحقق من صحة ظيفة الحاجز من قبل نطيقة النطيقة المناعية، والمقاومة الكهربائية transendothelial (طير) القياسات وكذلك تحليل إيفانز تخلل الأزرق. هذا النموذج يسمح التحقيق في انسلال من مجموعات فرعية لمفاوية نادرة مثل CD56 CD16 مشرق قاتمة / - خلايا NK. Furthermخام، وآثار الخلايا الأخرى، السيتوكينات و chemokines، التعديلات المتعلقة بالمرض، ونظم العلاج واضحة على قدرة المهاجرة من الخلايا الليمفاوية يمكن دراستها. وأخيرا، فإن تأثير محفزات للالتهابات وكذلك نظم العلاج المختلفة على حاجز غشائي يمكن تحليلها.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

اللمفاويات الهجرة من الدم إلى الأنسجة أمر بالغ الأهمية لمراقبة المناعية. A سلسلة من التفاعلات الجزيئية محددة يضمن موقع التسرب معين في الأمعاء الدقيقة، والجلد والغدد الليمفاوية، والجهاز العصبي المركزي (CNS)، وغيرها من الأنسجة 1. وتشارك التعديلات في الهجرة لمفاوية في الفيزيولوجيا المرضية لعدد من الأمراض واسعة الانتشار 2. الهجرة إلى الجهاز العصبي المركزي المناعة متميز ينظم بإحكام وفقا لذلك تشارك التعديلات لهذه العملية في الأمراض المتصلة الجهاز العصبي المركزي مثل التهاب الدماغ والنخاع 3، البصري التهاب النخاع و الأعصاب، والسكتة الدماغية، والتصلب المتعدد (MS) 2، 4، 5، 6، 7. وبالتالي، فمن المهم دراسة لمفاوية تسرب إلى فهم أفضل الفيزيولوجيا المرضية المرض وتطوير أدوات ل تحسين الاراضي من عبء المرض 8، 9، 10، 11، 12.

الخلايا الليمفاوية تهاجر إلى الجهاز العصبي المركزي عبر طرق مختلفة. وقد وصفت التسرب من خلال الأوردة للشعيرات في الفضاء تحت العنكبوتية عبر حاجز السوائل الدم النخاعي داخل الضفيرة المشيمية وعبر حاجز الدم في الدماغ 1 و 13 و 14 و 15. تتم الهجرة عبر حاجز الدم في الدماغ عن طريق التفاعل بين الخلايا الليمفاوية مع الخلايا البطانية 14. وعلى النقيض من الخلايا البطانية في محيط الخلايا البطانية من CNS تعبر عن كميات عالية من جزيئات تقاطع ضيقة، مما يحد بدقة كمية من الخلايا والبروتينات قادرة على عبور حاجز الدم في الدماغمعشوقة = "XREF"> 16. النتائج التهاب في تخفيف منعطفات ضيقة ويستحث التعبير عن جزيئات الالتصاق. وبالتالي، تعزيز الهجرة لمفاوية في الجهاز العصبي المركزي 1 و 17 و 18.

تسرب عبر حاجز الدم في الدماغ هو عملية متعددة الخطوات. الخلايا اللمفية الحبل على الخلايا البطانية ثم لفة طول البطانة في عملية بوساطة أساسا selectins 1، 15. وفي وقت لاحق، والتفاعلات بين كيموكينات التي يفرزها البطانة والمستقبلات chemokine منهما أعرب عن الخلايا الليمفاوية تحدث تغييرات بتكوين لintegrins، وبالتالي تعزيز التصاق الثابت الخلايا البطانية 1. وأخيرا، الخلايا اللمفية إما الزحف على طول حاجز غشائي ضد تدفق الدم قبل transmigrating في الفضاء المحيط بالأوعية، أو المماطلة فورا ومباشرة نقل الحركةigrate في موقع شركة التصاق 1 و 19 و 20. ويمكن تحليل كل هذه الخطوات من تسرب الخلايا اللمفاوية في المختبر باستخدام تقنيات متميزة 21. ويستخدم الوقت الفاصل بين الفيديو المجهر لدراسة الربط الأولي والمتداول 15. توفر فحوصات التصاق معلومات مفصلة حول اعتقال الراسخ البطانية الحواجز 22. فحوصات التهجير كما هو موضح هنا تسمح بتحليل خلايا المناعة التهجير 21، 23، 24، 25، 26، 27، 28، 29.

باستخدام البشرية في الدم في المختبر نموذج حاجز الدماغ، ونحن يمكن أن تظهر في الآونة الأخيرة أن migr العاليالقدرة atory من CD56 CD16 مشرق قاتمة / - خلايا NK مقارنة CD56 خافت انعكس CD16 + نظرائهم من غلبة هذا فرعية الخلايا القاتلة الطبيعية في حجرة داخل القراب 21. وبالتالي، فإن الإعداد التجريبية يبدو أن تكون مناسبة لمحاكاة الوضع في الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. خلية ثقافة الدماغ البشري خلايا الاوعية الدموية الدقيقة البطانية (HBMEC)

  1. طلاء قوارير زراعة الخلايا
    1. لإعداد حل فبرونيكتين، إضافة 10 مل PBS إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. إضافة 150 ميكرولتر فبرونيكتين وتخلط جيدا.
    2. لتغطية الجزء السفلي من T-25 زراعة الخلايا قارورة إضافة 2 مل من محلول فبرونيكتين. احتضان القارورة ثقافة الخلية لا يقل عن 3 ساعات في 37 درجة مئوية في الحاضنة. فبرونيكتين المغلفة قوارير يمكن تخزينها لمدة 2 أسابيع في 37 ° C / 5٪ CO 2.
  2. البذر والغرس وزراعة الخلايا من HBMEC
    1. نضح الحل فبرونيكتين من أسفل القارورة ثقافة الخلية. إضافة 7.2 × 10 4 HBMEC / سم ² مع وقف التنفيذ في 6 مل ECM-ب المتوسطة (= ECM-ب تستكمل مع 5٪ مصل بقري جنيني، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، و 1٪ البطانية تكملة نمو الخلايا). احتضان عند 37 ° C / 5٪ CO 2. تحقق نمو الخلايا يوميا باستخدام المجهر.
    2. تغيير المتوسط ​​كل 3 أيام.الحصاد أو خلايا تقسيم، عندما HBMEC تصل إلى ما يقرب من 80٪ التقاء. وينبغي أن تستخدم HBMEC بين مرور 1 و 15 لتجنب فقدان الخصائص الفيزيولوجية.
  3. حصاد HBMEC.
    1. إعداد accutase حل عن طريق خلط accutase (1X) مع PBS في نسبة 1: 1. الحفاظ accutase الحل عند 37 درجة مئوية في حمام مائي حتى استخدامها مرة أخرى.
    2. نقل ECM-ب المتوسطة من القارورة ثقافة الخلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. غسل HBMEC بإضافة 5 مل PBS إلى أسفل القارورة ثقافة الخلية. نضح PBS وكرر الخطوة غسل مرتين أخريين.
    3. إضافة استعد قبل 2 مل accutase الحل. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة. بعد ذلك، HBMEC يتم إعادة وقف التنفيذ من خلال استغلال بقوة قارورة ثقافة الخلية عدة مرات. يتم التحكم مفرزة الخلية باستخدام المجهر
    4. يتم إضافة ECM-ب-المتوسطة المخزنة مسبقا في أنبوب 15 مل إلى قارورة زراعة الخلايا بمجرد بدء HBMEC إلى فصل. شطف أسفل القارورة بشكل متكرر حتى معظم HBMEC هيإعادة وقف التنفيذ.
    5. نقل تعليق خلية إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تجاهل طاف واعادة تعليق الخلايا في 1 مل ECM-ب متوسطة. عد الخلايا وتمييع تعليق الخلية لتحقيق تركيز النهائي من 3 × 10 5 HBMEC لكل مليلتر ECM-ب متوسطة.

2. إعداد خلية ثقافة إدراجات

  1. طلاء من إدراج خلية ثقافة
    ملاحظة هامة: تجنب لمس الغشاء من إدراج ثقافة الخلية.
    1. إضافة 100 ميكرولتر حل فبرونيكتين (انظر 1.1.1) إلى كل إدراج ثقافة خلية (الشكل 1A) وبئر واحدة من 96-جيدا لوحة مسطحة القاع (مراقبة البصرية أيضا). احتضان لمدة لا تقل عن 3 ساعات في 37 ° C. بعد حل حضانة نضح فبرونيكتين.
    2. إضافة 100 ميكرولتر HBMEC تعليق على إدراج ثقافة الخلية والتحكم البصري أيضا. إضافة 600 ميكرولتر ECM-ب متوسطة إلى المقصورة أقل من الخليةإدراج الثقافة. احتضان لمدة 3-4 أيام عند 37 درجة مئوية / 5٪ CO 2 حتى سلامة الحاجز (الشكل 1B) يتم التوصل، تحقق نمو الخلايا عن طريق التقييم المجهري للHBMEC في السيطرة البصرية أيضا. ملاحظة: لا ينصح نمو الخلية وراء أربعة أيام.
    3. اختياري: لتحاكي حالات الالتهاب نضح المتوسطة من مقصورة الدنيا واستبدالها ECM-ب المتوسطة تستكمل مع 500 U / مل IFN-γ / TNF-α 24 ساعة قبل الفحص الهجرة.

3. مراقبة الجودة مع ايفانز الأزرق يوم من الفحص التهجير

  1. إعداد إيفانز حل الأزرق
    1. لإعداد PBS / B27 مزيج حل 10 مل PBS مع 200 ميكرولتر ملحق B27 باستخدام أنبوب الطرد المركزي 15 مل. تمييع ايفانز الأزرق حل سهم (20 ملغ / مل PBS) 1: 1000 مع PBS / B27.
  2. ايفانز الأزرق نفاذية فحص
    1. نضح في المتوسط ​​من المقصورة أقل تليها المقصورة العليامن إدراج الثقافة خلية واحدة تحتوي على متكدسة HBMEC أحادي الطبقة. إضافة 100 ميكرولتر إيفانز حل الأزرق لإدراج الثقافة الخلية.
    2. إضافة 600 ميكرولتر PBS / B27 إلى المقصورة الدنيا واحتضان لمدة 60 دقيقة عند 37 ° C / 5٪ CO 2. إزالة بعناية إدراج الثقافة الخلية باستخدام ملقط.
  3. ايفانز قياس الأزرق
    1. إزالة PBS / B27 من مقصورة الدنيا ونقل 100 ميكرولتر كل لبئرين من polystyrol الأسود 96-جيدا لوحة مسطحة القاع. إدراج لوحة في TECAN اللانهائي M200 القارئ برو لوحة وتحديد الأمثل ض الموقف.
    2. الإثارة قدر من ايفانز الزرقاء باستخدام إعدادات منها (على سبيل المثال: الإثارة: 620 نانومتر، والانبعاثات: 680 نانومتر، وعرض النطاق الترددي الإثارة: 9 نانومتر، عرض النطاق الترددي الانبعاثات: 20 نانومتر، وتعزيز 175x 25 ومضات، والوقت من التكامل: 20 ميكرو ثانية).
    3. لتحديد وظائف حاجز HBMEC قارن حصلت البيانات إلى منحنى القياسية التي تصور إيفانز تخلل الأزرق عبر HBMEC في نقاط زمنية مختلفة بعد البذورجي الخلايا (الشكل 1B، يمين).

4. هجرة الفحص

  1. إعداد الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMC).
    1. إضافة 10 مل RPMI في أنبوب 15 مل الطرد المركزي وإضافة 200 ميكرولتر B27 الملحق. عد الخلايا PBMC وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق. اعادة تعليق PBMC إلى التركيز النهائي من 5 × 10 6 خلية / مل RPMI / B27.
  2. انشاء لفحص الهجرة
    1. نضح المتوسطة من المقصورة أقل تليها المقصورة العليا من إدراج ثقافة الخلية التي تحتوي متموجة HBMEC الطبقات الوحيدة (الشكل 1A). لكل المانحة إضافة 100 ميكرولتر PBMC تعليق كل لإدراج زراعة الخلايا وكذلك لبئر واحدة من 24 لوحة جيدا في المائة (في المختبر السيطرة).
    2. إضافة 600 ميكرولتر RPMI / B27 إلى المقصورة السفلية من إدراج ثقافة الخلية و 500 ميكرولتر إلى PBMC للتحكم في المختبر واحتضان 6 ساعة عند 37 ° C / 5٪ CO 2.
    3. حصاد ترحيله PBMC
      1. إخراج إدراج الثقافة الخلية باستخدام ملقط وشطف بعناية أسفل مع 400 ميكرولتر PBS دون لمس الغشاء. تجاهل إدراج الثقافة الخلية.
      2. إضافة 20 ميكرولتر fluorospheres عدد التدفق (حوالي 1000 الخرز / ميكرولتر) إلى حجرة الأدنى من الثقافة خلية تضاف كذلك إلى عنصر التحكم في المختبر، وتخلط جيدا. نقل 1 مل من الناتج PBMC تعليق إلى التدفق الخلوي الأنابيب.

    5. التدفق الخلوي

    1. إعداد عينة
      1. الطرد المركزي PBMC في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      2. يعد حل الضد بإضافة الأجسام المضادة تألقي مترافق إلى 100 ميكرولتر التدفق الخلوي عازلة (PBS / 1٪ BSA / 2 ملي EDTA) لكل عينة. للحصول على نتائج عرض أقل من 1 ميكرولتر CD4-FITC، استخدمت 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5، 1 ميكرولتر CD56-PC7، 1 ميكرولتر CD8-A700، و 1 ميكرولتر CD16-A750 في العينة.
      3. إعادة تعليق PBMC في 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة واحتضان لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
      4. إضافة 250 ميكرولتر التدفق الخلوي العازلة وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
    2. اكتساب عينة
      1. اعادة تعليق PBMC في المبلغ المطلوب (قد تختلف تبعا لقياس التدفق الخلوي المستخدمة) من التدفق الخلوي العازلة.
      2. الحصول الملون PBMC باستخدام قياس التدفق الخلوي مع كاشف النشط بين 525 و 700 نانومتر الطول الموجي للكشف عن fluorospheres عدد التدفق (الإثارة 488 نانومتر، وانبعاث 525-700 نانومتر).
        (الخطوات التالية هي مثال إذا تم استخدام تدفق Gallios عداد الكريات تعمل مع برنامج Kaluza G: (1) بدء تشغيل الكمبيوتر (2) عند تحميل نظام التشغيل بالكامل، وبدء قياس التدفق الخلوي عن طريق الضغط على "عداد الكريات على" الزر (3) تحميل بروتوكول اكتساب منها عن طريق الضغط على زر "بروتوكول مفتوحة". (4) اختر البروتوكول المطلوب وحدد "فتح". (5) مكررة بروتوكول لكل عينة عن طريق النقر على الحقزر الماوس على بروتوكول مرئية في دائري الظاهري واليسار انقر على حقل "مكررة". (6) تسمية كل عينة في قائمة العينة. (7) نقل العينات إلى المواقع المحددة من دائري والبدء في عملية الاستحواذ.)
    3. تحليل عينة
      1. فتح التدفق الخلوي مما يؤدي البيانات باستخدام البرنامج منها. تحديد عدد من القطعان التي تهم transmigrated PBMC وكذلك خلايا في المختبر من آبار المراقبة وتدفق fluorospheres العد باستخدام برامج التحليل المعنيين.
        (تم اعطاء مثال للاستراتيجية المعزولة في الجزء النتائج (الشكل 1 C: تحليل التهجير من مجموعات فرعية NK الخلية، أولا تحديد الخلايا الليمفاوية في قناة مبعثر sideward (SSC) مقابل قناة مبعثر إلى الأمام (FSC) مؤامرة الخلايا اللمفاوية هي. ثم عرض في CD3 مقابل CD56 CD56 + المؤامرة وCD3 - يتم اختيار خلايا NK للتمييز بين مجموعات فرعية NK الخلية، يتم عرض الخلايا القاتلة الطبيعية فيويتم اختيار وكذلك CD56 CD16 + قاتمة خلايا NK - على CD56 CD16 مقابل المؤامرة وCD56 CD16 مشرق خافت /. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تحديد fluorospheres عدد التدفق من FSC مقابل SSC مؤامرة وبعد ذلك عرض في مؤامرة لقناة مع الانبعاثات بين 525 و 700 نانومتر مقابل الوقت لتحديد عددهم.)
      2. لحساب عدد الخلايا الكلي لكل عينة، وتطبيع عدد الكشف عن الخلايا باستخدام fluorospheres عدد التدفق:
        figure-protocol-1
      3. تحديد النسبة المئوية للخلايا هاجر كما النسبة بين مجموع الخلايا هاجروا ومجموع الخلايا في عنصر التحكم في المختبر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتظهر نتائج الممثل تظهر التهجير من NK خلايا ومجموعات فرعية T-خلية باستخدام البشري الدم في الدماغ نموذج الحاجز (الشكل 1A). تم التحقق من صحة سلامة أحادي الطبقة HBMEC قبل تلطيخ من مفترق الطرق جزيء ضيق المقاومة الكهربائية القياسات (طير) transendothelial ZO-1، وإيفانز تخلل الأزرق (الشكل 1B). وبعد 3-4 أيام وأعرب ثقافة HBMEC وضيق تقاطع جزيء ZO-1 (الشكل 1B، يسار). وعلاوة على ذلك، نمت HBMEC في الطبقات الوحي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا نقدم تقنية للتحقيق في التهجير من الخلايا الليمفاوية عبر حاجز الدم في الدماغ البشري. في تحليل المختبر الهجرة اللمفاويات إلى الجهاز العصبي المركزي هو مهم لدراسة العمليات الأساسية للتسرب الخلايا اللمفاوية، والتعديلات المحتملة المتعلقة بالمرض، وطرق علاجية جديدة.

العديد من التعديلات من طراز حاجز الدم في الدماغ ممكنة. على سبيل المثال، يمكن تحليل الخلايا من المقصورة العليا للتحقيق في التركيبة السكا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أعلن المؤلف (المؤلفون) عن تضارب المصالح المحتمل التالي فيما يتعلق بالبحث و / أو التأليف و / أو نشر هذه المقالة: A.S.-M. و U.B. ليس لديها إفصاحات مالية. تي إس إتش. استلم نفقات السفر والمؤتمرات من Biogen. حصلت NS على متحدث وأتعاب المجلس الاستشاري من Biogen و Novartis Pharma ، بالإضافة إلى نفقات السفر من Biogen. حصل إتش دبليو على تعويض عن عمله في المجالس الاستشارية العلمية / اللجان التوجيهية لشركة باير للرعاية الصحية ، وبيوجين ، وميرك سيرونو ، ونوفارتيس ، وسانوفي جينزيم. كما حصل على أتعاب المتحدثين ودعم السفر من Bayer Vital GmbH و Bayer Schering AG و Biogen و CSL Behring و Fresenius Medical Care و Glaxo Smith Kline و GW Pharmaceuticals و Lundbeck و Merck Serono و Omniamed و Novartis و Sanofi-Genzyme. حصل على تعويض كمستشار من Biogen و Merck Serono و Novartis و Sanofi-Genzyme. تلقى H.W. دعما بحثيا من Bayer Vital و Biogen و Genzyme و Merck Seronto و Novartis و Sanofi-Aventis Germany و Sanofi US. حصلت CCG على أتعاب المتحدث ونفقات السفر لحضور الاجتماعات من Genzyme و Novartis Pharma GmbH و Bayer Health Care.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذه الدراسة من قبل مركز البحوث التعاونية CRC TR128 "بدء / المستجيب مقابل الآليات التنظيمية في التصلب المتعدد - التقدم نحو معالجة المرض" (المشروع A9 إلى H.W. و CCG ، المشروع B1 إلى NS.).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
PBSGibco14190-094بدون CaCl 2< / sub > أو MgCl 2< / sub>
Fibronectin 1 مجم / ملSigmaF1141-5MGمن قارورة زراعة الخلايا T-25 البلازما
البقرية Greiner BioOne690160
HBMECScienCell1000
PelobiotechPB-H-6023
AccutaseSigmaA6964-100ML
ECM-bScienCell1001-b
FBSScienCell1001-b
البنسلين / الستربتومايسينScienCell1001-b
مكمل نمو الخلايا البطانيةScienCell1001-b
TranswellCorning3472واضح ، قطر 6.5 مم ، 3.0 & الصغيره; م حجم المسام
96 بئر لوحة سفلية مسطحةCorning3596
إيفانز الأزرقSigmaE2129-10Gحل الأسهم: 1 جم / 50 مل PBS
B27Gibco17504-04450x مركز
Infinite M200ProTecan
96 جيدا لوحة قاع مسطحسوداء Greiner BioOne675086
48 بئرCorning3526
RPMI 1640Gibco61870-010
عدد التدفق الفلوروسفيربيكمان كولتر7547053
Na-EDTASigmaE5134
BSASigmaA2153
Gallios مقياس التدفق الخلوي 10 ألوانبيكمان كولتر
كالوزا 1.5aبيكمان كولتر
TNF- & ألفا;Peprotech300-01A
IFN-& gamma;استنساخ Peprotech300-02
CD3-PerCP / Cy5.5Biolegend300430استنساخ UCHT1
CD56-PC7استنساخ بيكمان كولترA21692استنساخ N901
CD16-A750استنساخ بيكمان كولترA66330استنساخ 3G8
CD4-FITCBiolegend300506استنساخ RPA-T4
CD8-A700استنساخ بيكمان كولترA66332استنساخ B9.11

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ransohoff, R. M., Kivisakk, P., Kidd, G. Three or more routes for leukocyte migration into the central nervous system. Nat Rev Immunol. 3 (7), 569-581 (2003).
  2. Takeshita, Y., et al. An in vitro blood-brain barrier model combining shear stress and endothelial cell/astrocyte co-culture. J Neurosci Methods. 232, 165-172 (2014).
  3. Furtado, G. C., et al. A novel model of demyelinating encephalomyelitis induced by monocytes and dendritic cells. J Immunol. 177 (10), 6871-6879 (2006).
  4. Ransohoff, R. M. Illuminating neuromyelitis optica pathogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (4), 1001-1002 (2012).
  5. Petty, M. A., Lo, E. H. Junctional complexes of the blood-brain barrier: permeability changes in neuroinflammation. Prog Neurobiol. 68 (5), 311-323 (2002).
  6. Lopes Pinheiro, M. A., et al. Immune cell trafficking across the barriers of the central nervous system in multiple sclerosis and stroke. Biochim Biophys Acta. 1862 (3), 461-471 (2016).
  7. Holman, D. W., Klein, R. S., Ransohoff, R. M. The blood-brain barrier, chemokines and multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 220-230 (2011).
  8. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Kieseier, B. C., Wiendl, H. Immunotherapeutic approaches in MS: update on pathophysiology and emerging agents or strategies 2006. Endocr Metab Immune Disord Drug Targets. 7 (1), 35-63 (2007).
  9. Kleinschnitz, C., Meuth, S. G., Stuve, O., Kieseier, B., Wiendl, H. Multiple sclerosis therapy: an update on recently finished trials. J Neurol. 254 (11), 1473-1490 (2007).
  10. Wiendl, H., Hohlfeld, R. Multiple sclerosis therapeutics: unexpected outcomes clouding undisputed successes. Neurology. 72 (11), 1008-1015 (2009).
  11. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Breuer, J., Posevitz-Fejfar, A., Wiendl, H. JCV index and L-selectin for natalizumab-associated PML risk stratification. Journal of Neuroimmunology. 275 (1-2), 24(2014).
  12. Schwab, N., et al. L-selectin is a possible biomarker for individual PML risk in natalizumab-treated MS patients. Neurology. 81 (10), 865-871 (2013).
  13. Takeshita, Y., Ransohoff, R. M. Inflammatory cell trafficking across the blood-brain barrier: chemokine regulation and in vitro models. Immunol Rev. 248 (1), 228-239 (2012).
  14. Schwab, N., Schneider-Hohendorf, T., Wiendl, H. Trafficking of lymphocytes into the CNS. Oncotarget. 6 (20), 17863-17864 (2015).
  15. Schneider-Hohendorf, T., et al. VLA-4 blockade promotes differential routes into human CNS involving PSGL-1 rolling of T cells and MCAM-adhesion of TH17 cells. J Exp Med. 211 (9), 1833-1846 (2014).
  16. Girard, J. P., Springer, T. A. High endothelial venules (HEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration. Immunol Today. 16 (9), 449-457 (1995).
  17. Brown, D. A., Sawchenko, P. E. Time course and distribution of inflammatory and neurodegenerative events suggest structural bases for the pathogenesis of experimental autoimmune encephalomyelitis. J Comp Neurol. 502 (2), 236-260 (2007).
  18. Alvarez, J. I., Cayrol, R., Prat, A. Disruption of central nervous system barriers in multiple sclerosis. Biochim Biophys Acta. 1812 (2), 252-264 (2011).
  19. Rudolph, H., et al. Postarrest stalling rather than crawling favors CD8+ over CD4+ T-cell migration across the blood-brain barrier under flow in vitro. Eur J Immunol. , (2016).
  20. Bartholomaus, I., et al. Effector T cell interactions with meningeal vascular structures in nascent autoimmune CNS lesions. Nature. 462 (7269), 94-98 (2009).
  21. Gross, C. C., et al. Impaired NK-mediated regulation of T-cell activity in multiple sclerosis is reconstituted by IL-2 receptor modulation. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), E2973-E2982 (2016).
  22. Gross, C. C., Brzostowski, J. A., Liu, D. F., Long, E. O. Tethering of Intercellular Adhesion Molecule on Target Cells Is Required for LFA-1-Dependent NK Cell Adhesion and Granule Polarization. Journal of Immunology. 185 (5), 2918-2926 (2010).
  23. Grutzke, B., et al. Fingolimod treatment promotes regulatory phenotype and function of B cells. Ann Clin Transl Neurol. 2 (2), 119-130 (2015).
  24. Gobel, K., et al. Blockade of the kinin receptor B1 protects from autoimmune CNS disease by reducing leukocyte trafficking. J Autoimmun. 36 (2), 106-114 (2011).
  25. Schneider-Hohendorf, T., et al. Regulatory T cells exhibit enhanced migratory characteristics, a feature impaired in patients with multiple sclerosis. Eur J Immunol. 40 (12), 3581-3590 (2010).
  26. Huang, Y. H., et al. Specific central nervous system recruitment of HLA-G(+) regulatory T cells in multiple sclerosis. Ann Neurol. 66 (2), 171-183 (2009).
  27. Dehmel, T., et al. Monomethylfumarate reduces in vitro migration of mononuclear cells. Neurol Sci. 35 (7), 1121-1125 (2014).
  28. Gastpar, R., et al. The cell surface-localized heat shock protein 70 epitope TKD induces migration and cytolytic activity selectively in human NK cells. J Immunol. 172 (2), 972-980 (2004).
  29. Gastpar, R., et al. Heat shock protein 70 surface-positive tumor exosomes stimulate migratory and cytolytic activity of natural killer cells. Cancer Res. 65 (12), 5238-5247 (2005).
  30. Vandermeeren, M., Janssens, S., Borgers, M., Geysen, J. Dimethylfumarate is an inhibitor of cytokine-induced E-selectin, VCAM-1, and ICAM-1 expression in human endothelial cells. Biochemical and Biophysical Research Communications. 234 (1), 19-23 (1997).
  31. Rubant, S. A., et al. Dimethylfumarate reduces leukocyte rolling in vivo through modulation of adhesion molecule expression. Journal of Investigative Dermatology. 128 (2), 326-331 (2008).
  32. Hamann, A., et al. Evidence for an accessory role of LFA-1 in lymphocyte-high endothelium interaction during homing. J Immunol. 140 (3), 693-699 (1988).
  33. Shamri, R., et al. Lymphocyte arrest requires instantaneous induction of an extended LFA-1 conformation mediated by endothelium-bound chemokines. Nat Immunol. 6 (5), 497-506 (2005).
  34. Didier, N., et al. Secretion of interleukin-1beta by astrocytes mediates endothelin-1 and tumour necrosis factor-alpha effects on human brain microvascular endothelial cell permeability. J Neurochem. 86 (1), 246-254 (2003).
  35. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Drndarski, S., Fredriksson, S. M. An improved in vitro blood-brain barrier model: rat brain endothelial cells co-cultured with astrocytes. Methods Mol Biol. 814, 415-430 (2012).
  36. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Sci Rep. 4, 4160(2014).
  37. Franke, H., Galla, H. J., Beuckmann, C. T. An improved low-permeability in vitro-model of the blood-brain barrier: transport studies on retinoids, sucrose, haloperidol, caffeine and mannitol. Brain Res. 818 (1), 65-71 (1999).
  38. Abbott, N. J., Dolman, D. E., Patabendige, A. K. Assays to predict drug permeation across the blood-brain barrier, and distribution to brain. Curr Drug Metab. 9 (9), 901-910 (2008).
  39. Cucullo, L., Marchi, N., Hossain, M., Janigro, D. A dynamic in vitro BBB model for the study of immune cell trafficking into the central nervous system. J Cereb Blood Flow Metab. 31 (2), 767-777 (2011).
  40. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (muBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  41. Eugenin, E. A., et al. CCL2/monocyte chemoattractant protein-1 mediates enhanced transmigration of human immunodeficiency virus (HIV)-infected leukocytes across the blood-brain barrier: a potential mechanism of HIV-CNS invasion and NeuroAIDS. J Neurosci. 26 (4), 1098-1106 (2006).
  42. Ubogu, E. E., Callahan, M. K., Tucky, B. H., Ransohoff, R. M. CCR5 expression on monocytes and T cells: modulation by transmigration across the blood-brain barrier in vitro. Cell Immunol. 243 (1), 19-29 (2006).
  43. Bennett, J., et al. Blood-brain barrier disruption and enhanced vascular permeability in the multiple sclerosis model EAE. J Neuroimmunol. 229 (1-2), 180-191 (2010).
  44. Woolf, E., et al. Lymph node chemokines promote sustained T lymphocyte motility without triggering stable integrin adhesiveness in the absence of shear forces. Nat Immunol. 8 (10), 1076-1085 (2007).
  45. Ando, J., Nomura, H., Kamiya, A. The effect of fluid shear stress on the migration and proliferation of cultured endothelial cells. Microvasc Res. 33 (1), 62-70 (1987).
  46. Lawrence, M. B., Smith, C. W., Eskin, S. G., McIntire, L. V. Effect of venous shear stress on CD18-mediated neutrophil adhesion to cultured endothelium. Blood. 75 (1), 227-237 (1990).
  47. Wolff, A., Antfolk, M., Brodin, B., Tenje, M. In Vitro Blood-Brain Barrier Models-An Overview of Established Models and New Microfluidic Approaches. J Pharm Sci. 104 (9), 2727-2746 (2015).
  48. Cucullo, L., et al. Development of a humanized in vitro blood-brain barrier model to screen for brain penetration of antiepileptic drugs. Epilepsia. 48 (3), 505-516 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD56bright CD16dim

مقالات ذات صلة