هنا ، نقدم بروتوكولا لإجراء اختبار هجرة الخلايا شبه الإنتاجية على لوحة زراعة الخلايا المكونة من 96 بئرا. هذا البروتوكول هو طريقة سريعة وبسيطة واقتصادية لإنشاء جروح خدش متسقة على طبقة أحادية الخلية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
جهاز لأداء الهجرة خلية / شفاء الجروح في لوحة 96-حسنا
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الهجرة خلية / اصابة الفحص هو الطريقة المستخدمة عادة لدراسة الهجرة الخلية والعمليات الحيوية الأخرى، مثل الأوعية الدموية والانبثاث ورم. في هذا الاختبار، تزرع الخلايا لتشكيل أحادي الطبقة متموجة ويتم إنشاء الجرح الميكانيكية بواسطة خدش مع الجهاز. ثم يمكن رصدها معدل الهجرة من الخلايا باتجاه منطقة الجرداء بواسطة التصوير. تم تصميم wounder الميكانيكية 8 قنوات لمعالجة معظم المشاكل المرتبطة فحص الهجرة الخلية. أولا، wounder لدينا يمكن تعقيمها بسهولة عن طريق التعقيم أو مع المطهرات الشائعة. ثانيا، دبابيس قابل للتعديل الفردية تسمح الاتصال حتى مع لوحة الثقافة الخلية بحيث يمكن إنشاء الجروح الحادة وقابلة للتكرار. ثالثا، قضبان توجيه على كلا الجانبين من wounder ضمان موقف جرح ثابت في كل بئر. استخدام المتاح نصائح ماصة بلاستيكية للإصابة يمكن أن يزيد من توفير معالجة أفضل للwounder وكذلك لتقليل عبر contaminatأيون. في الختام، يمكن لنا wounder خلية توفر الباحثين مع جهاز سهل الاستخدام وقابلة للتكرار لأداء الفحص الهجرة الخلية باستخدام معيار لوحة ثقافة 96-جيدا.
المقدمة
تلعب هجرة الخلايا دورا مهما في العمليات الخلوية ، مثل التطور الجنيني ، وتكوين الخلايا العصبية ، وتكوين الأوعية الدموية ، والتئام الجروح ، وإصلاح الغشاء المخاطي ، والتحولات الظهارية واللحمية المتوسطة في ظل التطور الطبيعي وحالة المرض< فئة الدعم = "xref">1. إنها عملية معقدة تتضمن تنسيق العديد من الأحداث بين الخلايا وداخلها بما في ذلك تفاعلات جزيئات الإشارات ، واستقطاب الخلايا ، وإعادة تنظيم الهيكل الخلوي ، وإعادة تشكيل المصفوفة ، ونتوء الغشاء ، وتعديل التصاق الخلية الديناميكية < فئة sup = "xref">2. من خلال دراسة هجرة الخلايا ، يمكن تحديد اكتشاف والتحقق من صحة المواد الكيميائية أو الجزيئات الحيوية التي تؤدي إلى حركة الخلايا والمسارات الكيميائية الحيوية المرتبطة بها. يمكن استخدام هذه العملية الأساسية بشكل مفيد كوكيل لتطبيقات مختلفة ، مثل علاج الأمراض واستهداف الأدوية.
اختبار الجرح هو أحد فحوصات هجرة الخلايا < فئة sup = "xref" >3. هنا ، ستتم إزالة عينة فردية من الخلايا جزئيا بوسائل ميكانيكية لإنتاج منطقة مجردة حيث تهاجر الخلايا لتغطية المنطقة. سيتم مراقبة النسبة المئوية للتعافي في نقطة زمنية معينة. عند التعامل مع عدد كبير من العينات ، يمكن أن تكون مشكلات مثل التكلفة التجريبية والتلوث المتبادل داخل العينات مشكلة. على الرغم من توفر العديد من الأدوات والمقايسات التجارية لدراسة هجرة الخلايا < sup class = "xref" >4,< sup class = "xref" >5,< sup class = "xref" >6 ، إلا أن العديد منها يتطلب معدات باهظة الثمن ومتطورة ولا تزال هناك حاجة إلى تحسينات. لهذه الأسباب ، تم تطوير جرح خلية ميكانيكي ذو 8 قنوات (الشكل 1).
لقد أدرج جرح الخلية الميكانيكية ذو 8 قنوات العديد من الميزات الفريدة في حل المشكلات المذكورة أعلاه. يوفر المرونة لإجراء فحوصات هجرة / جرح الخلايا في شكل لوحة ثقافة 96 بئرا. يضمن تصميم شريط التوجيه القابل للتعديل أن تكون منطقة الخدش في الموضع المركزي لكل بئر. أيضا ، يمكن ضبط ارتفاع قضبان التوجيه بحيث يكون الجرح قابلا للتطبيق على مختلف العلامات التجارية للوحات الثقافة. وأخيرا، يتيح تصميم دبوس الجرح القابل للتعديل ملامسة متساوية لأطراف الماصة مع سطح لوحة الاستزراع لتحقيق الجرح المتزامن والقابل للتكرار<فئة الجرح="xref">7,8.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. مقدمة عن أجزاء جهاز إحداث الجروح (الشكل 1)
- قم بتجهيز حامل الدبابيس عن طريق تثبيت دبابيس الجرح على مسافات متساوية. أمسك برؤوس الماصة واضبط ارتفاع الرأس عن طريق تحريك دبابيس الجرح القابلة للتعديل للأعلى وللأسفل.
- قم بتركيب قضيب التوجيه القابل للتعديل على مختلف العلامات التجارية لأطباق الزرع ذات الـ 96 بئراً، وتأكد من أن منطقة الجرح في موضع ثابت.
- ثبّت دبوس الجرح القابل للتعديل عن طريق إحكام ربط المسمار السداسي. ثبّت قضيب التوجيه في موضعه عن طريق إحكام ربط براغي الرأس السداسية في كلا الطرفين.
2. ضبط عرض حامل الدبابيس (الشكل 2)
- قم بفك براغي الرأس السداسية باستخدام مفتاح سداسي M5.
- أدخل عدداً مناسباً من حلقات الضبط على كلا جانبي حامل المسمار بحيث تتناسب قضبان التوجيه تماماً مع عرض طبق الزرع ذو الـ 96 بئراً.
ملاحظة: تتطلب أطباق Corning وIwaki زوجاً واحداً من الحلقات الكبيرة وزوجاً واحداً من الحلقات الصغيرة. بينما تتطلب أطباق Falcon وNunc زوجاً واحداً من الحلقات الكبيرة. - أحكم ربط براغي الرأس السداسية لتثبيت قضيب التوجيه.
3. ضبط قضبان التوجيه (الشكل 3)
- قم بتركيب رؤوس ماصات بلاستيكية معقمة سعة 10-µL على دبابيس الجرح.
- قم بفك أغطية رؤوس البراغي سداسية المقبس باستخدام مفتاح سداسي M5.
- أمسك بأداة الجرح واغمس دبابيس الجرح في عمود واحد من لوحة زراعة ذات 96 بئراً.
- اضبط ارتفاع قضبان التوجيه حتى تلامس جميع الرؤوس قاع الآبار بالكاد.
- أحكم ربط أغطية رؤوس البراغي سداسية المقبس. تأكد من أن أداة الجرح تتناسب الآن تماماً مع لوحة الزراعة وأن الدبابيس متمركزة جيداً في منتصف الآبار.
4. معايرة الدبابيس
- أمسك مسبّب الجروح بشكل عمودي على سطح معقم ومسطح (أي: (طبق بتري) ثم قم بفك جميع البراغي سداسية الرؤوس باستخدام مفتاح سداسي M3.
- انقر على جهاز إحداث الجروح حتى تلامس جميع الرؤوس السطح العقيم المسطح بشكل متساوٍ.
- أحكم ربط براغي سداسية الرؤوس (hex screws) مرة أخرى لتثبيت المسامير في موضعها.
- تحقق من استواء كل سن عن طريق نقر أداة إحداث الجروح برفق على السطح العقيم المسطح.
5. خدش الطبقة الخلوية الأحادية (الشكل 4)
- يتم استزراع خلايا بطانية وعائية سرية بشرية على طبق زراعة خلايا مكون من 96 بئراً ومطلي بـ 0.1% جيلاتين. تُزرع الخلايا في وسط Medium 199 مضاف إليه 20% مصل جنين بقري مثبط حرارياً، و1% بنسيلين/ستربتوميسين، و0.09 g/L هيبارين. تُحفظ الخلايا في حاضنة رطبة تحتوي على 5% ثاني أكسيد الكربون عند 37 ºC طوال الليل قبل الاستخدام. يجب أن تصل الخلايا إلى حالة الاندماج الكامل بنسبة 100% قبل إحداث الجرح.
- ضع رؤوس إحداث الجروح عند الجانب الأيسر (أو الأيمن) لكل بئر ضمن العمود نفسه في طبق الزراعة. حرك أداة إحداث الجروح عبر البئر إلى الجانب الآخر؛ مع التأكد من ملامسة رؤوس الإحداث لقاع البئر.
- كرر عملية الخدش (الخطوة 5.2) لجميع الأعمدة.
- بعد إحداث الجروح، يتم التخلص من الوسط في كل بئر واستبداله بوسط جديد يحتوي على المركبات المختبرة.
6. الحصول على البيانات وتحليل الصور
- قم بتصوير البئر بالكامل التي تحتوي على الجرح الميكانيكي في طبقة الخلايا أحادية الطبقة باستخدام مجهر منخفض القوة مزود بكاميرا رقمية (مثلاً عدسة شيئية 10X) فور إحداث الجرح (t=0 h).
- أضف المركبات المختبرة إذا لزم الأمر واحضنها للمدة المطلوبة. قم بتصوير البئر بالكامل مع منطقة الجرح مرة أخرى بعد انتهاء وقت الحضن المطلوب (t=Δh).
- باستخدام برنامج لتحليل الصور مثل ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/)، قم بقياس منطقة الجرح في الصورة باستخدام أداة الرسم الحر (freehand tool).
- احسب النسبة المئوية لانغلاق الجرح:
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم تصميم أداة إحداث الجروح الميكانيكية ذات الـ 8 قنوات هذه لخدش طبقة أحادية من الخلايا من أجل إجراء مقايسة هجرة الخلايا. وهي جهاز سهل الاستخدام يمكنه تنفيذ مقايسات خدش الخلايا في أطباق ذات 96 بئراً في أقل من دقيقة دون الحاجة إلى تدريب خاص. يمكن لهذه الأداة إحداث مناطق جروح في الطبقات الأحادية للخلايا بعرض موحد يبلغ حوالي 600 µm وبحواف حادة (الشكل 5 و 6). ويعتمد عرض الجروح على العلامة التجارية لرؤوس الماصات وأداء المستخدم. ويعد هذا المدى من عرض الجرح مناسب...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يتميز جرح الخلايا الخاص بنا بالعديد من الميزات الفريدة في حل مشاكل فحوصات هجرة الخلايا التقليدية. آلة جرح الخلايا الميكانيكية ذات 8 قنوات مصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ عالي الجودة (فولاذ 304) مع عمر طويل يمكن تعقيمه عن طريق التعقيم. يمكن استخدام جميع العلامات التجارية تقريبا لألواح الثقافة ذات 96 بئرا المتوفرة في السوق مع جهاز الجرح الميكانيكي هذا بسبب شريط التوجيه القابل للتعديل. يضمن تصميم شريط التوجيه القابل للتعديل أيضا أن تكون منطقة الخدش في وسط كل بئر. يمكن للجرح في الوضع المركزي للبئر تسهيل التقاط الصور باستخدام...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
شكر وتقدير
يود المؤلفون أن يشكروا السيد تام بو ليونغ والسيد وونغ تشي كين والموظفين الفنيين في ورشة عمل كلية العلوم ، جامعة هونغ كونغ المعمدانية ، على مهاراتهم الفنية ونصائحهم في صنع النموذج الأولي لهذا الجرح.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| لوحة ثقافة الخلايا ذات 96 بئر | Nunc | 167008 | يمكن أيضا استخدام العلامات التجارية الأخرى للوحة زراعة الخلايا ذات 96 بئرا |
| ماصة P10 | Axygen | 301-03-051 | ماصة P10 قصير أكثر سهولة في إنشاء جرح واضح |
| Wounder | R & P Technology Limited | ||
| Medium 199 | Sigma | M2520-1L | لزراعة الخلايا الخلوية للخلايا البطانية للوريد السري البشري. استخدم وسط الثقافة المناسبة والحالة لنوع آخر من الخلايا. |
| مصل الأبقار الجنيني | Gibco | 26140079 | لزراعة الخلايا للخلايا البطانية للوريد السري البشري. استخدم وسيط زراعة مناسب وحالة لنوع آخر من الخلايا. |
| البنسلين / الستربتومايسين | جيبكو | 15140122 | لزراعة الخلايا للخلايا البطانية للوريد السري البشري. استخدم وسط زراعة القراصة المناسبة والحالة لنوع آخر من الخلايا. |
| ملح الصوديوم الهيبارين من الغشاء المخاطي المعوي للخنزير | Sigma | H3393 | لزراعة الخلايا الخلوية للخلايا البطانية للوريد السري البشري. استخدم وسط زراعة القراصة المناسب والحالة لنوع آخر من الخلايا. |
| الجيلاتين من جلد البقر | Sigma | G9391 | لزراعة الخلايا للخلايا البطانية للوريد السري البشري. استخدم وسط الثقافة المناسب والحالة لنوع آخر من الخلايا. |
المراجع
- Friedl, P., Wolf, K. Tumour-cell invasion and migration: diversity and escape mechanisms. Nat Rev Cancer. 3 (5), 362-374 (2003).
- Friedl, P. Prespecification and plasticity: shifting mechanisms of cell migration. Curr Opin Cell Biol. 16 (1), 14-23 (2004).
- Lampugnani, M. G. Cell migration into a wounded area in vitro. Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).
- Sholley, M. M., Gimbrone, M. A. Jr, Cotran, R. S. Cellular migration and replication in endothelial regeneration: a study using irradiated endothelial cultures. Lab Invest. 36 (1), 18-25 (1977).
- Gotlieb, A. I., Spector, W. Migration into an in vitro experimental wound: a comparison of porcine aortic endothelial and smooth muscle cells and the effect of culture irradiation. Am J Pathol. 103 (2), 271-282 (1981).
- Chen, Y. C., et al. Single-cell migration chip for chemotaxis-based microfluidic selection of heterogeneous cell populations. Sci Rep. 18 (5), 9980(2015).
- Yarrow, J. C., Periman, Z. E., Westwood, N. J., Mitchison, T. J. A high-throughput cell migration assay using scratch wound healing, a comparsion of image-based readout methods. BMC Biotechnol. 4, 21(2004).
- Lauder, H., Frost, E. E., Hiley, C. R., Fan, T. P. Quantification of the repair process involved in the repair of a cell monolayer using an in vitro model of mechanical injury. Angiogenesis. 2 (1), 67-80 (1998).
- Yue, P. Y. K., Leung, E. P. Y., Mak, N. K., Wong, R. N. S. A simplified method for quantifying cell migration/ wound healing in 96-well plates. J. Biomol Screen. 15 (4), 427-433 (2010).
- Yue, P. Y., et al. Elucidation of the mechanisms underlying the angiogenic effects of ginsenoside Rg(1) in vivo and in vitro. Angiogenesis. 8 (3), 205-216 (2005).
- Kwok, H. H., Chan, L. S., Poon, P. Y., Yue, P. Y., Wong, R. N. Ginsenoside-Rg1 induces angiogenesis by the inverse regulation of MET tyrosine kinase receptor expression through miR-23a. Toxicol Appl Pharmacol. 287 (3), 276-283 (2015).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
