مقالة منهجية

استخدام الإنزيم بيوسينسور كوندوكتيميتريك β-lactamase المستندة إلى الكشف عن التفاعلات الجزيئية البيولوجية

DOI:

10.3791/55414

⸱

فبراير 1, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Life Science Department, University of Liège, 2Institute of Condensed Matter and Nanoscience, Catholic University of Louvain, 3Laboratory of Clinical Microbiology, Catholic University of Louvain, 4Biotechnology Department, CER Group

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا العمل، نحن تقرير أسلوب جديد لدراسة تفاعلات البروتين البروتين استخدام بيوسينسور كوندوكتيميتريك على أساس تكنولوجيا β-lactamase الهجين. ويعتمد هذا الأسلوب على الإفراج عن البروتونات عند التحلل من β-لاكتامس.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجهزة استشعار العوامل البيولوجية تزداد أهمية وتنفيذها في مختلف الميادين مثل الكشف عن مسببات المرض والتشخيص الجزيئي، والرصد البيئي، ومراقبة سلامة الأغذية. وفي هذا السياق، استخدمنا lactamases بيتا كمراسل كفاءة الإنزيمات في عدة دراسات التفاعل البروتين-بروتين. وعلاوة على ذلك، تشجع قدرتها على قبول الملاحق من الببتيدات أو منظم البروتينات/المجالات بشدة استخدام هذه الإنزيمات لتوليد بروتينات تشيميريك. في دراسة أجريت مؤخرا، ونحن إدراج جزء من جسم مجال واحد في بلاب Bacillus ليتشينيفورميس β-lactamase. يتم تعريف هذه المجالات الصغيرة، وتسمى أيضا نانوبوديس، كنطاقات مستضد ملزمة للأجسام المضادة واحد في سلسلة من الإبليات. وتظهر مثل الأجسام المضادة المشتركة لسلسلة مزدوجة، الانتماءات عالية والخصوصيات لأهدافها. معارضها البروتين تشيميريك الناتجة من تقارب عالية ضد هدفه مع الاحتفاظ بالنشاط β-lactamase. وهذا يوحي أن تظل مويتيس نانوبودي و β-lactamase الوظيفية. في هذا العمل، نحن تقرير بروتوكول مفصل الذي يجمع بين نظامنا β-lactamase الهجين للتكنولوجيا بيوسينسور. ويمكن الكشف عن ملزمة محددة من نانوبودي إلى هدفها بفضل مقياس كوندوكتيميتريك للبروتونات الصادرة عن نشاط الإنزيم الحفاز.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجهزة استشعار العوامل البيولوجية هي الأجهزة التحليلية التي تجمع تفاعل الحيوي جزيئي مع أجهزة إرسال الإشارات الفيزيائية أو الكيميائية المشار إليها كمحولات الطاقة1. يمكن تفسير الإشارات المسجلة وتحويلها إلى رصد التفاعلات بين الشركاء المعطل تداولها ومجانا. معظم أجهزة استشعار العوامل البيولوجية تنطوي على استخدام جسم مضاد للكشف عن تحليلها مثل الهرمونات أو علامات الممرض مختلفة2. تنسيقات استشعار مختلفة يمكن استخدامها، وتشمل هذه الأجهزة المستندة إلى كتلة أو مغناطيسية، بصرية أو الكهروكيميائية. هذه الأخيرة هي من بين الأكثر شيوعاً المستخدمة في أجهزة الاستشعار، وتعمل عن طريق تحويل حدث ملزم إلى إشارة كهربائية. الأداء والحساسيات جميع هذه الأجهزة المستندة إلى جسم تعتمد بشدة على أساسا معلمتين من معلمات: ط) نوعية الجسم والثاني) خصائص النظام المستخدمة لتوليد إشارة2.

الأجسام المضادة هي بروتينات dimeric كتلة عالية-الجزيئية (150 – 160 كاتشين) التي تتألف من اثنين من سلاسل ثقيلة واثنين من سلاسل خفيفة. واستقرت بالتفاعل بين السلاسل الخفيفة والثقيلة معظمها التفاعلات مسعور، فضلا عن سندات ثنائي كبريتيد مصانة. ويشمل كل سلسلة متغير مجال الذي يتفاعل مع مستضد أساسا عبر ثلاث مناطق هايبرفاريابل اسمه "مكملة تحديد المناطق" (CDR1-2-3). وعلى الرغم من العديد من التطورات في هذا المجال، التعبير على نطاق واسع من أجسام كاملة الطول مع أنظمة تعبير منخفضة التكلفة (مثل كولاي) غالباً ما يؤدي إلى إنتاج بروتينات غير مستقرة ومجمعة. وهذا السبب في مختلف أجزاء جسم قد تم إجراء هندسة عكسية مثل متغير واحد-سلسلة الأجزاء3 (سكففس ≈ كاتشين 25). وهي تتألف من مجالات متغير واحد على التوالي الثقيلة وسلاسل خفيفة واحدة مرتبطة تساهميا بتسلسل الأحماض الأمينية اصطناعية. بيد أن هذه الشظايا غالباً ما تعرض استقرار فقراء ولديهم ميل لتجميع، نظراً لأنها تعرض جزء كبير من مناطقها مسعور ل المذيبات4. وفي هذا السياق، يبدو أن سلسلة واحدة الكامليد جسم الشظايا، يشار إلى نانوبوديس أو فحص، بدائل ممتازة سكففس. تتوافق هذه المجالات إلى مجالات متغير من الأجسام المضادة أحادية السلسلة الكامليد. على النقيض من الأجسام المضادة التقليدية، الأجسام المضادة الكامليد تخلو من سلاسل خفيفة وتحتوي فقط على اثنين من سلاسل ثقيلة5. ولذلك، نانوبوديس هي أصغر جسم أحادي الأجزاء (12 كاتشين) قادرة على ربط مستضد مع تقارب مماثل للأجسام المضادة التقليدية6. وباﻹضافة إلى ذلك، فإنها تعرض تحسين الاستقرار والقابلية للذوبان في مقارنة بغيرها طول الأجسام المضادة أو أجزاء جسم. أخيرا، أحجام صغيرة وعلى الحلقات CDR3 الموسعة يسمح لهم بالاعتراف بخفي [ابيتوبس] وربط إنزيم مواقع نشطة7،8. في الوقت الحاضر، هذه المجالات التي تحظى باهتمام كبير وتضافرت للتكنولوجيا بيوسينسور. على سبيل المثال، هوانغ وآخرون. وقد وضعت بيوسينسور على أساس نانوبودي للكشف والتحديد الكمي للبشرية مستضد البروستات محددة (PSA)9.

كما ذكر أعلاه، هو معياراً هاما في فحوصات biosensor كفاءة النظام المستخدمة لتوليد إشارة كهربائية. ولهذا السبب، المستندة إلى إنزيم أجهزة الاستشعار الكهروكيميائية تجتذب اهتماما متزايداً، وقد استخدمت على نطاق واسع لمختلف التطبيقات مثل الرعاية الصحية والسلامة الغذائية، والرصد البيئي. أجهزة الاستشعار هذه تعتمد على التحلل الحفاز من الركازة بإنزيم لتوليد الإشارة الكهربائية. وفي هذا السياق، عرضت β-لاكتاماسيس أن تكون أكثر تحديداً، وأكثر حساسية وأسهل في التنفيذ تجريبيا من العديد من الإنزيمات الأخرى مثل الفوسفاتيز القلوية أو الفجل البيروكسيديز10. Β-lactamases هي الإنزيمات التي المسؤولة عن مقاومة الجراثيم للمضادات الحيوية بيتا لاكتام التي هيدروليزينج لهم. وهم أحادي، ومستقرة جداً، والكفاءة، وصغيرة الحجم. وعلاوة على ذلك، تولد الملاحق المجال/الببتيد إلى β-lactamases البروتينات تشيميريك ثنائية-الوظائف التي عرضت أن تكون أدوات فعالة لدراسة تفاعلات البروتين-يجند. في الواقع، أظهرت دراسات أجريت مؤخرا أن إدراج أجزاء جسم متغير في نتائج β-lactamase TEM1 في بروتين تشيميريك التي ما زالت قادرة على ربط مع تقارب عالية على مستضد المستهدفة به. من المثير للاهتمام، والربط مستضد أبدى للحث على تنظيم نشاط الحفاز TEM111،12اللوستيريك. وعلاوة على ذلك، أظهرت أننا في العديد من الدراسات أن الإدراج المجال البروتين في حلقة متساهلة من Bacillus ليتشينيفورميس بلاب β-lactamase يولد البروتينات تشيميريك الوظيفية التي مناسبة تماما لرصد تفاعلات البروتين-يجند13 ،14. ونحن مؤخرا إدراج نانوبودي، اسمه كاب-Lys3، في هذا الموقع الإدراج المتساهلة بلاب15. وأبدى هذا نانوبودي لربط lysozyme الدجاجة-البيض-أبيض (هول) وكبح النشاط الأنزيمي16. لقد أظهرنا أن البروتين الهجين الذي تم إنشاؤه، اسمه بلاب-كاب-Lys3، الاحتفاظ خصوصية عالية/تقارب ضد هول بينما ظل النشاط β-lactamase بدون تغيير. ثم أننا بنجاح الجمع بين التكنولوجيا الهجينة β-lactamase إلى biosensor الكهروكيميائية وأظهر أنه يعتمد التفاعل بين بلاب-كاب-Lys3 وهول معطلة في قطب كمية الإشارات الكهربائية التي تم إنشاؤها. وفي الواقع، يدفع التحلل من المضادات الحيوية بيتا لاكتام بلاب بيان بروتون التي يمكن تحويلها إلى إشارة كهربائية كمية. هذا المزيج من التكنولوجيا الهجينة β-lactamase مع biosensor الكهروكيميائية سريعة وحساسة، الكمية، ويتيح قياس الإشارات التي تم إنشاؤها في الوقت الحقيقي. ويرد وصف هذه المنهجية هنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد نموذج البروتين

  1. إنتاج وتنقية البروتين الهجين بلاب-كاب-Lys3 كما ورد في أعمالنا السابقة الدراسة15. تخزين البروتين في 50 ملم الفوسفات المخزن المؤقت الأس الهيدروجيني 7.4 على النحو التالي: 8 غرام من كلوريد الصوديوم، 0.2 جم من بوكل، ز 1.44 غ2هبو4 و 0.24 ز خ2بو4 حله في 800 مل ماء المقطر إصلاح الرقم الهيدروجيني للحل إلى 7.4 قبل ضبط حجم الصوت النهائي من حل 1 تصفية ل. تعقيم حل البروتين.
  2. تحضير دجاجة البيض أبيض lysozyme (هيول) حل أسهم. حل 100 مغ (40,000 وحدات/mg) من هول تجارياً المشتراة في 10 مل من المحلول الملحي العازلة الفوسفات (راجع الخطوة 2.1.1 من برنامج تلفزيوني). تعقيم حل البروتين عن طريق الترشيح باستخدام عوامل التصفية مع قطع 0.22 ميكرومتر.

2. فحوصات بيوسينسور

  1. إعداد المخزن المؤقت للحل
    1. إعداد 50 مم برنامج تلفزيوني بتذويب ز 0.2 من بوكل وز 1.44 غ2هبو4، 8 غرام من كلوريد الصوديوم و 0.24 ز خ2ص4 في 800 مل ماء المقطر. ضبط على درجة الحموضة 7.4 مع 1 N HCl أو هيدروكسيد الصوديوم N 1 قبل ضبط وحدة تخزين حل 1 تصفية ل. تعقيم وتخزين في 4 درجات مئوية.
    2. إعداد حل حظر/تشبع بتذويب 3 ز من الكازين هيدروليساتي في 100 مل من برنامج تلفزيوني أعد كما هو موضح أعلاه (راجع الخطوة 2.1.1). فلتر تعقيم وتخزين في 4 درجات مئوية.
    3. إعداد حل ملزم بتذويب ز 1 من الكازين هيدروليساتي في 100 مل من برنامج تلفزيوني أعد كما هو موضح أعلاه (راجع الخطوة 2.1.1). فلتر تعقيم وتخزين في 4 درجات مئوية.
    4. تعد حلاً غسيل (0.1% توين-برنامج تلفزيوني) بإضافة 100 ميكروليتر من 20 توين (100%) في 100 مل من برنامج تلفزيوني أعد كما هو موضح أعلاه (راجع الخطوة 2.1.1). مخزن في 4 درجات مئوية.
    5. تعد حلاً إعداد قطب كهربائي (1% Triton X-100-برنامج تلفزيوني) بإضافة 1 مل من Triton X-100 (100%) في 100 مل من برنامج تلفزيوني أعد كما هو موضح أعلاه (راجع الخطوة 2.1.1). مخزن في 4 درجات مئوية.
    6. تعد حلاً تجدد قطب كهربائي (3.5 م بوكل) بتذويب ز 26 من بوكل في الماء المقطر لوحدة تخزين نهائي 100 مل. فلتر تعقيم ومخزن في 4 درجات مئوية.
    7. إعداد 5 ملم من محلول كلوريد الصوديوم بتذويب 0.29 جم من كلوريد الصوديوم في الماء المقطر لوحدة تخزين نهائي 1 تصفية ل. تعقيم وتخزين في 4 درجات مئوية. ثم، تعد حلاً كشف (بينزيلبينيسيلين 4 ملم) بتذويب 26.7 مغ بينزيلبينيسيلين في 20 مل من محلول كلوريد الصوديوم 5 ملم. فلتر تعقيم وتخزين في-20 درجة مئوية.
  2. إعداد أجهزة الاستشعار والتجديد
    ملاحظة: بوليانيليني المغلفة استشعار وضعت رقائق وتفضلت المقدمة من د. ب. بوجارتس والدكتور يونس س. أ. د. ي. جلوبكزينسكي (الكاثوليكية جامعة لوفين-لوس أنجليس--نوف-تشو مونت-جودين). مفصلة وصف الاستشعار، فضلا عن بوليانيليني الكهربائية-البلمرة البروتوكولات المستخدمة لتجميع هذه المجسات على العمل السابق17. بإيجاز، أن هذا النظام يستخدم أجهزة استشعار قابلة لإعادة الاستخدام من ثماني رقائق الفردية التي صنعت بتقنيات الكلاسيكية الدوائر المطبوعة المجلس (ثنائي الفينيل متعدد الكلور). رقائق الفردية تتكون من ثلاثة قطب الجولة البقع. رأس واحد هو العامل الكهربائي في بوليانيليني التي تم توليفها الكهربائية. واحدة متوسطة مسرى المرجعية ويشكل القطب السفلي مسرى العداد. يتم فونكتيوناليزيد على حد سواء، والإشارة، واقطاب مكافحة استخدام مزيج Ag/AgCl الصلبة فوق طبقة الكربون.
    1. إجراء 3 يغسل من أقطاب كهربائية بغمس النصائح في آبار صفيحة 96-كذلك تحتوي على 300 ميليلتر/جيدا من قطب كهربائي إعداد الحل (انظر Triton X-100-برنامج تلفزيوني، 1% خطوة 2.1.5.). أداء كل غسل لمدة 2 دقيقة مع خلط لطيف في درجة حرارة الغرفة.
    2. شطف أقطاب كهربائية بغمس النصائح في آبار صفيحة 96-كذلك تحتوي على 300 ميليلتر/جيدا من الماء المقطر لمدة 2 دقيقة مع خلط لطيف في درجة حرارة الغرفة.
    3. إعادة إنشاء أقطاب كهربائية بغمس النصائح في آبار صفيحة 96-كذلك تحتوي على 300 ميليلتر/جيدا لحل التجديد (3.5 م بوكل، راجع الخطوة 2.1.6) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو ح 1 في درجة حرارة الغرفة.
    4. إجراء 3 يغسل من أقطاب كهربائية بغمس النصائح في آبار صفيحة 96-كذلك تحتوي على 300 ميليلتر/جيدا من الفوسفات المالحة المخزن المؤقت (راجع الخطوة 2.1.1.). أداء كل غسل لمدة دقيقتين مع خلط لطيف في درجة حرارة الغرفة.
  3. ملزمة والرزن يقوم على استشعار
    1. معطف هول إلى سطح المؤسسة الوطنية للطفولة (بوليانيليني) القطب بإيداع قطره 15 ميليلتر من 40 ميكروغرام/مل هول أعدت في برنامج تلفزيوني على سطح القطب. تبني بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
    2. أداء يغسل ثلاثة من الأقطاب مع الفوسفات المالحة المخزن المؤقت (راجع الخطوة 2.1.1) بغمس أجزاء القطب من رقائق الاستشعار في آبار صفيحة 96-كذلك تحتوي على 300 ميليلتر/بئر المالحة العازلة الفوسفات. أداء كل غسل لمدة 2 دقيقة مع خلط لطيف في درجة حرارة الغرفة.
    3. تشبع أقطاب كهربائية بإضافة قطره 50 ميليلتر من عرقلة الحل (راجع الخطوة 2.1.2) على سطح القطب. احتضانها ح 1 في درجة حرارة الغرفة. ثم يغسل ثلاث مرات، كما هو موضح في السابق خطوة (راجع الخطوة 2.3.2).
    4. تمييع الحل بلاب-كاب-Lys3 إلى 20 ميكروغرام/مل في ربط حل (راجع الخطوة 2.1.3) وتطبيق قطره 15 ميليلتر من هذا محلول مخفف على أقطاب كهربائية. احتضان لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد رد فعل مستضد نانوبودي، يغسل ثلاث مرات كما وصفت في الخطوة السابقة باستخدام الحل أغسل (راجع الخطوة 2.1.4). ثم شطف مسرى مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني (راجع الخطوة 2.1.1).
    5. للكشف، قم بتوصيل رقاقة الاستشعار عن طريق الجزء النحاس-الدوائر إلى متعدد رقمية. ثم بدء استجابة جهاز استشعار بتطبيق قطره 50 ميليلتر من الكشف عن الحل (راجع الخطوة 2.1.7) إلى أقطاب الإيجابية وتطبيق قطره 50 ميليلتر من محلول كلوريد الصوديوم 5 مم على الأقطاب السالبة (راجع الخطوة 2.1.7). احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. رصد في الموصلية مع متعدد رقمية.
      ملاحظة: المتعدد قدم الدكتور ب. بوجارتس والدكتور يونس س. أ. د. ي. جلوبكزينسكي (الكاثوليكية جامعة لوفين-لوس أنجليس--نوف-تشو مونت-جودين. هذا بوتينتيوستات الخاضعة لسيطرة جهاز الكمبيوتر عبر منفذ USB ويحلل رقائق مختلفة ثمانية من أجهزة الاستشعار في وقت واحد. البرامج التي تم إنشاؤها بواسطة يونس وزملاؤه17 ينشئ مؤامرة في الوقت الحقيقي التي تمثل قياسات الموصلية الفرق بين أقطاب المرجعية وعينه مع الزمن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التصميم والهندسة للبروتين تشيميريك بلاب-كاب-Lys3

ويمثل الرقم 1 إدراج Lys3 سيارة الأجرة في حلقة متساهلة من الفئة أ بالب β-lactamase من Bacillus ليتشينيفورميس. وأجرى الإدراج بين بقايا Asp198 و Lys199. وعرض موقع انقسام ثرومبين على كل جانب من Lys3 سيارة أجرة. الخلايا التي تتحول مع بلازميد تعبير تأسيسي ترميز البروتين تشيميريك بلاب-كاب-Lys3 تمكنوا من ينمو حضور تركيز الأمبيسلّين صغيرة. هذه النتيجة تشير إلى أن الهجين β-lactamase ق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا العمل نقدم طريقة فونكتيوناليزي نانوبودي استخدام بلاب β-lactamase بروتين الناقل ونظهر أن يمكن أن ننفذ البروتين الهجين الناتجة بنجاح في مقايسة استشعار فرق الجهد. الجانب الابتكار الرئيسي لعملنا مقارنة بغيرها فحوصات بيوسينسور هو اقتران التساهمية الجزء الأجسام المضادة للنشاط الأنزيمي الذي يولد الإشارة الكهربائية. ويعرض هذه التكنولوجيا الإدراج البروتين يسمى المزايا والقيود التي سوف يكون التركيز الرئيسي لهذا القسم.

مزايا التكنولوجيا β-lactamase الهجين.

Β-lactamases...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعترف أصحاب المنطقة الفالونية لبلجيكا في إطار مشاريع البحوث سينسوتيم ونانوتيك وكذلك الوطنية الأموال للبحث العلمي (F.R.S.-F.N.R.S) لتقديم الدعم المالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Reagents
KH2PO4Sigma-AldrichtV000225 
K2HPO4Sigma-Aldricht1551128
NaClSigma-AldrichtS7653
Tris– HClRoche10812846001
EDTA Sigma-AldrichtE9884
KClSigma-AldrichtP9541
Na2HPO4 Sigma-AldrichtNIST2186II
2-mercaptoethanolSigma-AldrichtM6250
ألانينSigma-AldrichtA7627
HClO4< / sub>Fluka342881M HClO4 ، الموزع: Sigma-Aldricht
الكازين المتحللسيجما ألدريخت22090
بنزيل بنسلين الصوديومسيجما ألدريتشB0900000
الدجاجة البياض ليزوزيمروش10837059001
هيبتانسيجما ألدريتشت246654
الميثانولسيجما ألدريخت322415
محلول هيدروكسيد الأمونيومسيجما ألدريخت38053928٪ NH3 & nbsp ؛ في H2O ، منقى عن طريق التقطير المزدوج (مركز؟)
< قوية > مستهلكات مختبرية < / قوية >
6 بئر لوحة   ؛Greiner Bio-One657165CELLSTAR 6-Well Plate
Equipment< / قوي >
درجة الحموضة مقياسWTW1AA110مختبر مقياس الأس الهيدروجيني inoLab درجة الحموضة 7110
نظام الفراغ والترشيحNalgeneNALG300-4100حاملات المرشح مع جهاز الاستقبال ، الموزع:
رقائقالمصنعة من قبل Yunus و الزملاء (المرجع 16)
AutolabMetrohmAutolab ، الناجح Autolab PGSTAT302N
المقياس الرقمي المتعدد ، توقف METRAHit 22MGossen Metrawatt، خليفة Metrahit Base
بيض مستشعر الجهد VWR PGSTAT30 تم إيقاف

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Higgins, I. J., Lowe, C. R. Introduction to the principles and applications of biosensors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 316, 3-11 (1987).
  2. Byrne, B., Stack, E., Gilmartin, N., O'Kennedy, R. Antibody-based sensors: principles, problems and potential for detection of pathogens and associated toxins. Sensors (Basel). 9, 4407-4445 (2009).
  3. Huston, J. S., et al. Protein engineering of antibody binding sites: recovery of specific activity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci U S A. 85, 5879-5883 (1988).
  4. Mechaly, A., Zahavy, E., Fisher, M. Development and implementation of a single-chain Fv antibody for specific detection of Bacillus anthracis spores. Appl Environ Microbiol. 74, 818-822 (2008).
  5. Hamers-Casterman, C., et al. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 363, 446-448 (1993).
  6. Sheriff, S., Constantine, K. L. Redefining the minimal antigen-binding fragment. Nat Struct Biol. 3, 733-736 (1996).
  7. Stijlemans, B., et al. Efficient targeting of conserved cryptic epitopes of infectious agents by single domain antibodies. African trypanosomes as paradigm. J Biol Chem. 279, 1256-1261 (2004).
  8. Thanongsaksrikul, J., et al. A V H H that neutralizes the zinc metalloproteinase activity of botulinum neurotoxin type A. J Biol Chem. 285, 9657-9666 (2010).
  9. Huang, L., et al. Prostate-specific antigen immunosensing based on mixed self-assembled monolayers, camel antibodies and colloidal gold enhanced sandwich assays. Biosens. Bioelectron. 21, 483-490 (2005).
  10. Yolken, R. H., Wee, S. B., Van Regenmortel, M. The use of beta-lactamase in enzyme immunoassays for detection of microbial antigens. J Immunol Methods. 73, 109-123 (1984).
  11. Kojima, M., et al. Activation of circularly permutated beta-lactamase tethered to antibody domains by specific small molecules. Bioconjug Chem. 22, 633-641 (2011).
  12. Iwai, H., Kojima-Misaizu, M., Dong, J., Ueda, H. Creation of a Ligand-Dependent Enzyme by Fusing Circularly Permuted Antibody Variable Region Domains. Bioconjug Chem. 27, 868-873 (2016).
  13. Vandevenne, M., et al. The Bacillus licheniformis BlaP beta-lactamase as a model protein scaffold to study the insertion of protein fragments. Protein Sci. 16, 2260-2271 (2007).
  14. Vandevenne, M., et al. Rapid and easy development of versatile tools to study protein/ligand interactions. Protein Eng Des Sel. 21, 443-451 (2008).
  15. Crasson, O., et al. Enzymatic functionalization of a nanobody using protein insertion technology. Protein Eng Des Sel. 28, 451-460 (2015).
  16. Yunus, S., Attout, A., Vanlancker, G., Bertrand, P., Ruth, N., Galleni, G. A method to probe electrochemically active material state in portable sensor applications. Sensors and Actuators B: Chemical. 156, 35-42 (2011).
  17. Bogaerts, P., Yunus, S., Massart, M., Huang, T. D., Glupczynski, Y. Evaluation of the BYG Carba Test, a New Electrochemical Assay for Rapid Laboratory Detection of Carbapenemase-Producing Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol. 54, 349-358 (2016).
  18. Wang, L. P., Wang, W., Di, L., Lu, Y. N., Wang, J. Y. Protein adsorption under electrical stimulation of neural probe coated with polyaniline. Colloids Surf B Biointerfaces. 80, 72-78 (2010).
  19. Piletsky, S., Piletska, E., Bossi, A., Turner, N., Turner, A. Surface functionalization of porous polypropylene membranes with polyaniline for protein immobilization. Biotechnol. Bioeng. 82, 86-92 (2003).
  20. Khatkhatay, M. I., Desai, M. A comparison of performances of four enzymes used in ELISA with special reference to beta-lactamase. J Immunoassay. 20, 151-183 (1999).
  21. Worn, A., et al. Correlation between in vitro stability and in vivo performance of anti-GCN4 intrabodies as cytoplasmic inhibitors. J Biol Chem. 275, 2795-2803 (2000).
  22. Ostermeier, M. Engineering allosteric protein switches by domain insertion. Protein Eng Des Sel. 18, 359-364 (2005).
  23. Choi, J. H., Laurent, A. H., Hilser, V. J., Ostermeier, M. Design of protein switches based on an ensemble model of allostery. Nat Commun. 6, 6968(2015).
  24. Collinet, B., et al. Functionally accepted insertions of proteins within protein domains. J Biol Chem. 275, 17428-17433 (2000).
  25. Betton, J. M., Jacob, J. P., Hofnung, M., Broome-Smith, J. K. Creating a bifunctional protein by insertion of beta-lactamase into the maltodextrin-binding protein. Nat Biotechnol. 15, 1276-1279 (1997).
  26. Ay, J., Gotz, F., Borriss, R., Heinemann, U. Structure and function of the Bacillus hybrid enzyme GluXyn-1: native-like jellyroll fold preserved after insertion of autonomous globular domain. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 6613-6618 (1998).
  27. Ruth, N., et al. DNA vaccination for the priming of neutralizing antibodies against non-immunogenic STa enterotoxin from enterotoxigenic Escherichia coli. Vaccine. 23, 3618-3627 (2005).
  28. Zervosen, A., et al. Characterization of the cattle serum antibody responses against TEM beta-lactamase and the nonimmunogenic Escherichia coli heat-stable enterotoxin (STaI). FEMS Immunol Med Microbiol. 54, 319-329 (2008).
  29. Chevigne, A., et al. Use of bifunctional hybrid beta-lactamases for epitope mapping and immunoassay development. J Immunol Methods. 320, 81-93 (2007).
  30. Ke, W., et al. Structure of an engineered beta-lactamase maltose binding protein fusion protein: insights into heterotropic allosteric regulation. PloS One. 7, 39168(2012).
  31. Saeedfar, K., Heng, L. Y., Ling, T. L., Rezayi, M. Potentiometric urea biosensor based on an immobilised fullerene-urease bio-conjugate. Sensors (Basel). 13, 16851-16866 (2013).
  32. D'Orazio, P. Biosensors in clinical chemistry. Clin Chim Acta. 334, 41-69 (2003).
  33. Szucs, J., Pretsch, E., Gyurcsanyi, R. E. Potentiometric enzyme immunoassay using miniaturized anion-selective electrodes for detection. Analyst. 134, 1601-1607 (2009).
  34. Ding, J., Wang, X., Qin, W. Pulsed galvanostatic control of a polymeric membrane ion-selective electrode for potentiometric immunoassays. ACS Appl Mater Interfaces. 5, 9488-9493 (2013).
  35. Wang, X., et al. A polymeric liquid membrane electrode responsive to 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine oxidation for sensitive peroxidase/peroxidase mimetic-based potentiometric biosensing. Anal Chem. 86, 4416-4422 (2014).
  36. Grieshaber, D., MacKenzie, R., Voros, J., Reimhult, E. Electrochemical Biosensors - Sensor Principles and Architectures. Sensors (Basel). 8, 1400-1458 (2008).
  37. Bakker, E., Pretsch, E. Nanoscale potentiometry. Trends Analyt Chem. 27, 612-618 (2008).
  38. Zhang, D., Liu, Q. Biosensors and bioelectronics on smartphone for portable biochemical detection. Biosens Bioelectron. 75, 273-284 (2016).
  39. Nemiroski, A., et al. Universal mobile electrochemical detector designed for use in resource-limited applications. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 11984-11989 (2014).
  40. Socio-economic impact of mHealth- An assessment report for the European Union. , Price Waterhouse Coopers. Commission, T.E (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة