مقالة منهجية

تحديد حاتمة الخطي B-خلية المعترف بها الأجسام المضادة وحيدة النسيلة-الببتيد الضوئي بمساعدة

9.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55417

⸱

مارس 24, 2017

 , 
1Institute of Cellular and Organismic Biology, Academia Sinica

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، يقدم المؤلفون بروتوكولا بسيطا وفعالا لتحديد حاتمة مستضدية خطية باستخدام جسم مضاد أحادي النسيلة منقى ومسح الببتيد من خلال تهجين اللطخة النقطية. يمكن بعد ذلك استخدام الحاتمة المحددة في التطبيقات العلاجية والتشخيصية.

الملخص

تحديد حاتمة مولدة من قبل النظام المناعي يسمح لفهم آلية الحماية من الأجسام المضادة التي قد تسهل تطوير اللقاحات والعقاقير الببتيد. الببتيد المسح هي طريقة بسيطة وفعالة تعين مباشر حاتمة الخطية المعترف بها من قبل الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب). هنا، والكتاب تقدم منهجية تقرير حاتمة التي تنطوي على البروتينات اقتطاع متسلسل المؤتلف، تصميم الببتيد الاصطناعية، وتهجين نقطة وصمة عار للاعتراف الأنتيجين من فيروس العصبي نخر بروتين معطف باستخدام ماب تحييد. وتعتمد هذه التقنية على تهجين نقطة وصمة عار من الببتيدات الاصطناعية وMABS على (PVDF) غشاء فلوريد البولي. يمكن تضييق المنطقة مولدة الحد الأدنى من البروتين الفيروسي معطف معترف بها من قبل RG-M56 ماب أسفل خطوة بخطوة قلص رسم الخرائط الببتيد على 6 مير الببتيد حاتمة. وبالإضافة إلى ذلك، مسح ألانين الطفرات وبقايا الفرعيةstitution لا يمكن أن يؤديها لتوصيف أهمية ربط كل بقايا الأحماض الأمينية التي تشكل حاتمة. تم العثور على بقايا المرافقة الموقع حاتمة للعب أدوارا حاسمة في تنظيم الببتيد التشكل. ويمكن استخدام الببتيد حاتمة التي تم تحديدها لتشكيل بلورات من المجمعات الببتيد الأجسام المضادة حاتمة لدراسة حيود الأشعة السينية والمنافسة وظيفية، أو العلاجات.

المقدمة

في الجهاز المناعي، وإعادة التركيب من شرائح V و D و J يسمح لأجسام مضادة لخلق اختلافات هائلة من المناطق التكامل تحديد (تقارير الإنجاز الموحدة) للربط إلى مختلف المستضدات لحماية المضيف من العدوى المسببة للأمراض. الدفاع تحييد الأجسام المضادة ضد المستضدات يعتمد على التكامل المكاني بين تقارير الإنجاز الموحدة من الأجسام المضادة والحواتم من المستضدات. ولذلك، فإن فهم هذا التفاعل الجزيئي مساعدة تصميم لقاح وقائي والتنمية الببتيد المخدرات العلاجية. ومع ذلك، قد تتأثر هذا التفاعل تحييد كل من المجالات مولدة متعددة من مستضد واحد واحد وتقارير الإنجاز الموحدة متعددة من الأجسام المضادة، والتي بالتالي جعل عملية تحديد حاتمة أكثر تعقيدا. لحسن الحظ، وتطوير تكنولوجيا هجين، التي تدمج الخلايا المنتجة للأجسام المضادة الفردية مع خلايا المايلوما، يسمح لدفعة تقسيم باستمرار من الخلايا ثانية الأجسام المضادة المحددة شبكة شعيرية واحد، والمعروفة باسم الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (ماب) 1. خلايا هجين تنتج هذه النقية، MABS عالية تقارب ربط إلى مجال الأنتيجين واحد لمستضد معين. مع العلاقة بين مستضد الضد المعمول بها، العديد من الطرق، بما في ذلك المسح الببتيد، ويمكن استخدامها لتحديد حاتمة من مستضد باستخدام ماب المقابلة. جعلت التطورات الحديثة في تكنولوجيا الببتيد الاصطناعية تقنية الببتيد المسح الضوئي أكثر سهولة وأكثر ملاءمة لأداء. لفترة وجيزة، ويتم إنتاج مجموعة من تداخل الببتيدات الاصطناعية وفقا لتسلسل المستضد الهدف وترتبط إلى الغشاء الصلبة المعتمدة لماب التهجين. الببتيد المسح يوفر ليس فقط وسيلة بسيطة لتعيين الأجسام المضادة المنطقة ملزم، ولكن أيضا يسهل الأحماض الأمينية (أأ) الطفرات من خلال مسح بقايا أو استبدال لتقييم تفاعل ملزم بين كل بقايا أأ من الببتيد حاتمة وتقارير الإنجاز الموحدة من الأجسام المضادة.

معشوقة = "jove_content"> هنا، توضح الدراسة بروتوكول لتحديد كفاءة حاتمة خطية من البروتين معطف الهامور الأصفر فيروس نخر العصبي (YGNNV) باستخدام ماب تحييد 2، 3، 4. ويتضمن البروتوكول ماب إعداد والبناء والتعبير عن البروتينات المؤتلف اقتطاع متسلسل، الاصطناعية تصميم الببتيد متداخلة، تهجين نقطة وصمة عار، مسح ألانين، والطفرات تبديل. ونظرا لارتفاع تكلفة تركيب الببتيد، تم تعديل خطوة من اقتطاع متسلسل البروتينات المؤتلف من البروتين الهدف المنشود، وضاقت المنطقة المستضدات إلى حوالي 100-200 بقايا أأ قبل إجراء الببتيد مجموعة تحليل نقطة وصمة عار الاصطناعية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد وحيدة النسيلة الأجسام المضادة

  1. ثقافة RG-M56 الماوس وحيدة النسيلة خلايا هجين 2 في المصل خالية المتوسطة في قوارير 175T في 37 درجة مئوية مع 5٪ CO 2 الملحق. جمع طاف عند لون المتوسطة يتحول إلى اللون الأصفر بعد خمسة أيام من الحضانة.
    ملاحظة: كانت خلايا ورم هجين مثقف في المتوسط ​​خالية من المصل لتجنب تلوث الأجسام المضادة من المصل البقري الجنين.
  2. أجهزة الطرد المركزي لطاف في 4500 x ج لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية، وتجاهل بيليه الحطام الخلية.
  3. إضافة 2 مل من بروتين G الاغاروز (كما زودت الطين 50٪) إلى عمود 5 مل وتتوازن مع 10 مجلدات الراتنج (10 مل) من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني.
  4. تحميل 200 مل من طاف الأجسام المضادة (الخطوة 1.2) على عمود وتجاهل المار.
  5. إضافة 10 مل من الجليد الباردة PBS إلى العمود لأنه يغسل. كرر مرتين.
  6. إضافة 10 مل من 50 ملي الجلايسين، ودرجة الحموضة 2.7 إلى العمود إلى أزل الأجسام المضادة بروتين G المصاحب. العقيدlect 900 كسور ميكرولتر في أنبوب microcentrifuge تحتوي على 100 ميكرولتر من 10X العازلة تحييد (1 M تريس، 1.5 M كلوريد الصوديوم، و 1 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.0).
  7. تخزين الجسم المضاد النقي في 50٪ الجلسرين مع 0.03٪ نان 3 في -20 درجة مئوية.

2. البناء والتعبير عن تسلسليا اقتطاع البروتينات المؤتلف

  1. إعداد PCR خليط التفاعل: 5 ميكرولتر من العازلة 10X PFU، 0.2 ملم من كل dNTP، 0.2 ميكرومتر التمهيدي إلى الأمام 3 و 0.2 ميكرومتر التمهيدي العكسي 3، 2 ملي MgSO 4، 1 نانوغرام من pET20b-1A59 3 DNA البلازميد، و 2.5 U ( وحدة) من البلمرة PFU الحمض النووي. إضافة ده 2 O إلى الحجم النهائي من 50 ميكرولتر.
    1. عينات تشغيل في cycler الحرارية التلقائي باستخدام المعلمات التالية: دورة 1 (94 درجة مئوية لمدة 5 دقائق)؛ دورات 2-36 (94 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 63 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، و 72 درجة مئوية لمدة 60 ثانية). ودورة 37 (72 درجة مئوية لمدة 7 دقائق).
  2. استخراج تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) المنتجات باستخدام تنقية عدة PCR 5 لتسهيل ما يلي انزيم الهضم قيود.
  3. هضم شظايا تضخيم الحمض النووي PCR مع تجربة الاقتراب من الموت أنا وXho أنا أنزيمات التقييد وligate كل هذه الشظايا الحمض النووي في تجربة الاقتراب من الموت أنا وXho I-المشقوق انزيم PET-20B (+) ناقلات. تحويل ثوابت في كولاي DH-5α المختصة خلايا 6.
    1. تحضير خليط الهضم العازلة في الهضم (20 ملي تريس، خلات، 10 ملي المغنيسيوم (CH 3 COO) 2، 50 ملم KCH 3 COO، و 1 ملي DTT، ودرجة الحموضة 7.9) مع 1 ميكروغرام من تضخيم الحمض النووي PCR أو PET-20B (+) الحمض النووي ناقلات، و2 U من تجربة الاقتراب من الموت أنا وتقييد Xho أنا الانزيمات في الحجم النهائي من 20 ميكرولتر.
    2. مزج الخليط الهضم بلطف وتدور بسرعة إلى أسفل. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في حمام جافة لضمان القطع الكامل للقيود الجلوسوفاق.
    3. استخراج تقييد هضم انزيم شظايا الحمض النووي باستخدام تنقية عدة PCR 5 لتسهيل بناء البلازميد التالية.
    4. تحضير خليط ربط العازلة في ربط (66 ملي تريس، 5 ملي MgCl 2، 1 ملم ATP و 5 ملي DTT، ودرجة الحموضة 7.5) مع 100 نانوغرام من مهضوم، تضخيم الحمض النووي PCR، 10 نانوغرام من مهضوم PET-20B (+) الحمض النووي ناقلات، و 5 يغاز U من T4 الحمض النووي في الحجم النهائي من 10 ميكرولتر.
    5. مزج الخليط ربط بلطف وتدور بسرعة إلى أسفل. احتضان عند 16 درجة مئوية لمدة 18 ساعة في حمام مائي.
    6. وضع 10 ميكرولتر من العينات ربط إلى 100 ميكرولتر من الخلايا DH-5α الحكومية المختصة وتخلط بلطف قبل وضع أنبوب microcentrifuge على الجليد لمدة 30 دقيقة. وضع أنبوب microcentrifuge في حمام الجافة في 42 درجة مئوية لمدة 90 ق للحث على الصدمة الحرارية 7. على الفور نقل أنبوب على الجليد لمدة 2 دقيقة.
    7. إضافة 900 ميكرولتر من لوريا، Bertani (LB) مرق (1٪ Bacto تريبتون، 0.5٪ Bacto الخميرة المقتطفر، و 0.5٪ كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.0) لأنبوب. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 150 دورة في الدقيقة تهتز لمدة 45 دقيقة. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 4000 ز س لمدة 10 دقيقة وتجاهل طاف.
    8. Resuspend وبيليه مع 50 ميكرولتر من مرق LB ونشر كل تحول على لوحات LB استعد مسبقا تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
    9. التقاط مستعمرة واحدة باستخدام تلميح 200 ميكرولتر ووضعه في 3 مل من مرق LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين في توج فضفاضة 15 مل أنبوب. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 150 دورة في الدقيقة تهتز لمدة 12 ساعة.
    10. استخراج DNA البلازميد 8 من كل ثقافة وتسلسل ذلك باستخدام المروج T7 وT7 التمهيدي فاصل لتأكيد تسلسل 9.
  4. بعد تأكيد تسلسل، وتحويل 10 نانوغرام من الحمض النووي من هذه الحيوانات الأليفة 20B (+) البلازميدات مع أطوال YGNNV جين البروتين معطف متفاوتة في BL-21 (DE3) سلالة كولاي من قبلناجي طريقة للحرارة صدمة 7. اتبع الخطوات 2.3.6-2.3.8 لتنفيذ التحويل.
  5. نقل مستعمرة واحدة من كل تتحول كولاي BL-21 خلية في 3 مل من مرق LB تحتوي على 100 ميكروغرام / مل الأمبيسلين في توج فضفاضة 15 مل أنبوب. احتضان الثقافة في 37 درجة مئوية مع 150 دورة في الدقيقة تهتز.
  6. تبريد الثقافة إلى 25 درجة مئوية عند OD 600 من ثقافة حوالي 0.6 وإضافة IPTG إلى تركيز النهائي من 0.4 ملم للحث على التعبير عن بروتين المؤتلف. احتضان الثقافة ل4 ساعات اضافية في 25 درجة مئوية مع 200 دورة في الدقيقة تهتز.
  7. نقل 1 مل من ثقافة إلى أنبوب microcentrifuge. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 12000 x ج لمدة 1 دقيقة وتجاهل طاف.
  8. Resuspend وبيليه الخلية في 100 ميكرولتر من العازلة تمسخ (8 M اليوريا و 20 ملي فوسفات الصوديوم، وكلوريد الصوديوم 0.5 M، ودرجة الحموضة 7.4) من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع micropipette. مزيج من قبل vortexing قوية.
    ملاحظة: سول عينةالآن يجب أن يكون utions شبه شفافة، لزجة قليلا، وعلى استعداد لتهجين فحص نقطة وصمة عار.

3. تصميم وتجميع من الببتيدات تداخل

  1. تصميم وتركيب 3 مسلسل الببتيدات 20 مير التي تتداخل مع بعضها مع خليفتها بنسبة 10 بقايا أأ من المنطقة 195-338 أأ من البروتين معطف YGNNV لتضييق المنطقة حاتمة من RG-M56 ماب بواسطة النشاف نقطة.
  2. تصميم وتركيب الببتيدات 3 ثلاث 8-مير (195 VNVSVLCR 202، 197 VSVLCRWS 204، و 199 VLCRWSVR 206) مع وجود تداخل من 6 بقايا أأ على الببتيد الاصطناعية المقبل لتضييق المنطقة حاتمة من 195-206 أأ من قبل النشاف نقطة.
  3. تصميم وتركيب 3 7-مير (196 NVSVLCR 202 و 195 VNVSVLC 201)، 6-مير (195 VNVSVL 200، 196 NVSVLC 201، و 197 VSVLCR 202)، و 5 مير الببتيدات (195 VNVSV 199، 196 NVSVL 200، 197 VSVLC 201، و 198 SVLCR 202) مع وجود تداخل بين 6 و 5 و 4 بقايا أأ، على التوالي، على الببتيدات المجاورة لها للحد من المنطقة حاتمة بواسطة النشاف نقطة.

4. نقطة وصمة عار التهجين

  1. حل كل الببتيد توليفها في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]) إلى تركيز النهائي من 10 ملغ / مل.
    ملاحظة: للتغلب على الذوبان متنوعة من الببتيدات الاصطناعية، يجب أن يتم حل جميع الببتيدات الاصطناعية في DMSO. DMSO هو مذيب جيد لإذابة تماما الببتيدات مسعور أو ماء.
  2. نقع الغشاء البولي فينيل الفلوريد (PVDF) مع الميثانول لمدة 2 دقيقة.
    ملاحظة: غشاء PVDF هو ما يصل الى مقاومة للDMSO 100٪؛ البعض الآخر قد لا تكون كذلك.
  3. تتوازن غشاء PVDF مع العازلة تعديل Towbin (25 ملي تريس، 192 الجلايسين ملم، و 0.1٪ SDS، ودرجة الحموضة 8.3) ل2 دقيقة.
    ملاحظة: 10-20٪ (ت / ت) من الميثانول يمكن أن تضاف إلى عازلة Towbin تعديلها لتحسين نتائج نقل.
  4. شطف قطعة من الورق اللوني مع العازلة Towbin تعديلها. وضع غشاء PVDF على ورقة اللوني. انتظر حتى اختفى عازلة Towbin معدلة من سطح الغشاء PVDF قبل المتابعة إلى الخطوة التالية.
  5. إضافة 2 ميكرولتر من كل عينة الببتيد إلى الغشاء مع طرف 10 ميكرولتر. الهواء الجاف الغشاء PVDF على ورقة اللوني لمدة 10 دقيقة. إضافة كل عينة الببتيد ببطء وتدريجيا على الغشاء لتجنب الكثير من نشرها.
  6. منع غشاء العازلة في TBST (0.05٪ (ت / ت) توين-20، و 20 ملي تريس، و 150 ملي مول كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4) مع الحليب الخالي 5٪ لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع الهز لطيف.
  7. إضافة RG-M56 ماب في التخفيف النهائي من 1: 1000 العازلة في TBST مع الحليب الخالي من 5٪ إلى الغشاء. احتضان الغشاء في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع الهز لطيف.
  8. إزالة الأجسام المضادة لذلكlution. غسل غشاء العازلة في TBST لمدة 5 دقائق مع اهتزاز لطيف. كرر مرتين.
  9. إضافة الضد الثانوية (الماعز المضادة للمفتش الماوس، FC، مترافق الفوسفاتيز القلوية) في التخفيف النهائي من 1: 5000 العازلة في TBST مع الحليب الخالي من 5٪ إلى الغشاء. احتضان الغشاء في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة مع الهز لطيف.
  10. تجاهل حل الأجسام المضادة. غسل غشاء العازلة في TBST لمدة 5 دقائق مع اهتزاز لطيف. كرر الخطوة غسل مرتين.
  11. تطوير الغشاء مع الحل الركيزة BCIP / NBT في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في الظلام. وقف النامية عن طريق غسل غشاء مع [ده 2 O عندما تظهر إشارة.
  12. الهواء الجاف الغشاء والتقاط صورة نقطة وصمة عار باستخدام نظام الصورة.
  13. قياس كثافة كل وصمة عار نقطة باستخدام صورة برامج التحليل 3.

5. الضوئي ألانين وتبديل

  1. تصميم وتركيب 3 ألانين وميثيالببتيدات استبدال onine. استبدال كل بقايا أأ مع ألانين لالببتيد 8 مير 195 VNVSVLCR 202 وتوليف الببتيد 195 ANVSVLCR 202، 195 VAVSVLCR 202، 195 VNASVLCR 202، 195 VNVAVLCR 202، 195 VNVSALCR 202، 195 VNVSVACR 202، 195 VNVSVLAR 202، و 195 VNVSVLCA 202 . استبدال أأ بقايا يسين 200 إلى ميثيونين لإنشاء SJNNV الوراثي حاتمة الببتيد 195 VNVSVMCR 202.
  2. اتبع القسم 4 لأداء المسح ألانين والطفرات استبدال دوت التنشيف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وكان الهدف من هذه التجربة لتحديد حاتمة من خلال نقطة النشاف باستخدام ماب. لتضييق بسرعة وكفاءة أسفل منطقة مولدة معترف بها من قبل ماب، وأعرب عن كامل طول واقتطاع متسلسل YGNNV بروتينات الغلاف المؤتلف مع علامة الانصهار 6xHis في محطة سي من نظام التعبير كولاي PET 10 (الشكل 1A). وقد شوهدت البروتينات المؤتلف الناتجة على الغشاء PVDF باستخدام RG-M56 ماب ومكافحة 6xHis الأجسام المضادة لتهجين نقطة وصمة عار. كشف نق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يوفر هذا البروتوكول تقنية سريعة ومباشرة لتحديد حاتمة الخطية المعترف بها ماب. مع الأخذ بعين الاعتبار تكلفة تركيب الببتيد وكفاءة الإنتاج من الببتيدات وتوليفها، تم تخفيض المنطقة مولدة للبروتين معطف الفيروس عن طريق التعبير عن البروتينات المؤتلف اقتطاع متسلسل قبل تحليل الببتيد المسح. على هذا النحو، تم استخدام نظام التعبير كولاي الحيوانات الأليفة موثوقة وفعالة لإنتاج هذه البروتينات المؤتلف اقتطاع بشكل متسلسل، والبروتينات المؤتلف مع الأوزان الجزيئية بين 10 و 50 كيلو دالتون يمكن ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين أي تضارب في المصالح فيما يتعلق بهذا التقرير.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون الآنسة تشينغ تشون لين والآنسة ديانا لين من المنشأة الأساسية لمعهد البيولوجيا الخلوية والعضوية (ICOB) التابع لأكاديمية سينيكا على تقديم خبرتهما في تخليق الببتيد وتسلسل الحمض النووي ، على التوالي. تم دعم هذه الدراسة من قبل أكاديميا سينيكا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Hybrid-SFM mediumGibco12045-076
Dulbeccos's Phophate-Buffered Saline (PBS)Gibco21600-069
Pfu DNA Polymerase  ثرمو علمية EP0502 بما في ذلك المخازن المؤقتة
T4 DNA LigaseRoche10799009001بما في ذلك المخازن المؤقتة
NdeI نيو إنجلاند بيولابسR0111Sبما في ذلك المخازن المؤقتة
XhoI نيو إنجلاند بيولابزR0146Sبما في ذلك المخازن المؤقتة
pET-20b (+) ناقلNovagen ، Merck Millipore69739
E. coli< / em> DH-5 & alpha cell المختصRBC BioscienceRH617
E. القولوني< / em> BL-21 (DE3) الخلية المختصةRBC BioscienceRH217
AmpicillinAmresco0339-25G
مرق LB Invitrongen12780-052
Isopropylthio-β-D-thiogalactoside (IPTG)MDBio، Inc.101-367-93-1
ميثانولميرك ميليبور106009
بولي أوكسي إيثيلين 20 سوربيتان مونولورات (توين -20)جي تي بيكرX251-07
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)سيجماD2650
جلايسينأمريسكو0167-5 كجم
تريسأفيمتريكس ، USB75825
كلوريد الصوديومأمريسكو0241-1 كجم
EDTAأمريسكو0105-1 كجم
جلسرينأمريسكو0854-1 لتر
NaN3< / sub>SigmaS2002-500G
BCIP /NBT بيركين إلمرNEL937001PK
الماعز المضاد للفأر IgG ، الجسم المضاد لجزء FCجاكسون ImmunoResearch115-055-008
Immobilon-P (فلوريد البولي فينيلدين ، PVDF)ميرك ميليبورIPVH00010
بروتين G Agarose Fast FlowMerck Millipore16-266
QIAquick PCR Purification KitQiagen28106
UVP BioSpectrum 600 Image SystemUVPn / a
VisionWorks LS Analysis Software الإصدار 6.8UVPn / a
MyCycler الحرارية التدويرBioRad1709713

المراجع

  1. Milstein, C., Kohler, G. Clonal variations of myelomatous cells (proceedings). Minerva Med. 68 (50), 3453(1977).
  2. Lai, Y. S., et al. In vitro neutralization by monoclonal antibodies against yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) and immunolocalization of virus infection in yellow grouper Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel). J Fish Dis. 24 (4), 237-244 (2001).
  3. Chen, C. W., Wu, M. S., Huang, Y. J., Cheng, C. A., Chang, C. Y. Recognition of Linear B-Cell Epitope of Betanodavirus Coat Protein by RG-M18 Neutralizing mAB Inhibits Giant Grouper Nervous Necrosis Virus (GGNNV) Infection. PLoS One. 10 (5), 0126121(2015).
  4. Lai, Y. -S., et al. Propagation of yellow grouper nervous necrosis virus (YGNNV) in a new nodavirus-susceptible cell line from yellow grouper, Epinephelus awoara (Temminck & Schlegel), brain tissue. J Fish Dis. 24 (5), 299-309 (2001).
  5. Lougee, E., Morjaria, S., Shaw, O., Collins, R., Vaughan, R. A new approach to HLA typing designed for solid organ transplantation: epityping and its application to the HLA-A locus. Int J Immunogenet. 40 (6), 445-452 (2013).
  6. Radulovich, N., Leung, L., Tsao, M. S. Modified gateway system for double shRNA expression and Cre/lox based gene expression. BMC Biotechnol. 11, 24(2011).
  7. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253(2007).
  8. Pronobis, M. I., Deuitch, N., Peifer, M. The Miraprep: A Protocol that Uses a Miniprep Kit and Provides Maxiprep Yields. PLoS One. 11 (8), e0160509(2016).
  9. Metzker, M. L. Emerging technologies in DNA sequencing. Genome Res. 15 (12), 1767-1776 (2005).
  10. Chiu, C. C., John, J. A., Hseu, T. H., Chang, C. Y. Expression of ayu (Plecoglossus altivelis) Pit-1 in Escherichia coli: its purification and immunohistochemical detection using monoclonal antibody. Protein Expr Purif. 24 (2), 292-301 (2002).
  11. Atassi, M. Z. Antigenic structures of proteins. Their determination has revealed important aspects of immune recognition and generated strategies for synthetic mimicking of protein binding sites. Eur J Biochem. 145 (1), 1-20 (1984).
  12. Opuni, K. F., et al. Mass spectrometric epitope mapping. Mass Spectrom Rev. , (2016).
  13. Chang, C. Y., Chiu, C. C., Christopher John, J. A. The Aquaculture of Groupers. Liao, I. C., Leaño, E. M. , Taiwan Asian Fisheries Society, World Aquaculture Society, The Fisheries Society of Taiwan, National Taiwan Ocean University, Taiwan Press. 207-224 (2008).
  14. Conti-Tronconi, B. M., et al. Alpha-bungarotoxin and the competing antibody WF6 interact with different amino acids within the same cholinergic subsite. Biochemistry. 30 (10), 2575-2584 (1991).
  15. Briggs, S., Price, M. R., Tendler, S. J. Fine specificity of antibody recognition of carcinoma-associated epithelial mucins: antibody binding to synthetic peptide epitopes. Eur J Cancer. 29 (2), 230-237 (1993).
  16. Chen, N. C., et al. Crystal Structures of a Piscine Betanodavirus: Mechanisms of Capsid Assembly and Viral Infection. PLoS Pathog. 11 (10), e1005203(2015).
  17. Badani, H., Garry, R. F., Wimley, W. C. Peptide entry inhibitors of enveloped viruses: The importance of interfacial hydrophobicity. Biochim Biophys Acta. , (2014).
  18. Qureshi, N. M., Coy, D. H., Garry, R. F., Henderson, L. A. Characterization of a putative cellular receptor for HIV-1 transmembrane glycoprotein using synthetic peptides. AIDS. 4 (6), 553-558 (1990).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PVDF

مقالات ذات صلة