Method Article

الخلوية الأكسدة التنميط باستخدام عالية المحتوى المجهري

DOI:

10.3791/55449

⸱

May 14th, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Cell Biology and Histology, Department of Veterinary Sciences, University of Antwerp, 2Cell Systems and Imaging Research Group (CSI), Department of Molecular Biotechnology, Ghent University, 3Department of Biochemistry , Radboud Institute for Molecular Life Sciences, Radboud University Medical Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تقدم هذه الورقة سير العمل المجهري عالية المحتوى لتحديد الكمي في وقت واحد من مستويات روس داخل الخلايا، فضلا عن إمكانات الغشاء الميتوكوندريا والمورفولوجيا - يشار إليها مجتمعة باسم مورفوفونكتيون الميتوكوندريا - في الخلايا الملتصقة الحية باستخدام الخلايا الخلوية جزيئات مراسل الفلورسنت 5- 6) -كلوروميثيل -2 '، 7'- ثنائي كلورودي هيدروفلورسئين دياسيتات، استر أستيل (سم-H 2 دسفدا) وتيتراميثيلرودامين ميثيلستر (تمرم).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) تنظم العمليات الخلوية الأساسية بما في ذلك التعبير الجيني، والهجرة، والتمايز والانتشار. ومع ذلك، فإن مستويات روس الزائدة تحفز حالة من الإجهاد التأكسدي، الذي يرافقه الأكسدة لا رجعة فيه الضرر إلى الحمض النووي، والدهون والبروتينات. وبالتالي، الكمي من روس يوفر بديلا مباشرا للحالة الصحية الخلوية. منذ الميتوكوندريا هي من بين المصادر الخلوية الرئيسية وأهداف روس، التحليل المشترك لوظيفة الميتوكوندريا وإنتاج روس في نفس الخلايا أمر بالغ الأهمية لفهم أفضل للربط في الظروف الفيزيولوجية المرضية. لذلك، تم تطوير استراتيجية عالية المستندة إلى المجهري على أساس الكمي في وقت واحد من مستويات روس الخلايا، والغشاء الميتوكوندريا المحتملة (ΔΨ م ) والتشكل الميتوكوندريا. لأنه يقوم على الآلي ويبيدفيلد المجهر مضان وتحليل الصور من الخلايا الملتصقة الحية، نمت في لوحات متعددة جيدا، وستيند مع جزيئات مراسل الفلورسنت خلية نفاذية سم-H 2 دكفدا (روس) و تمرم (ΔΨ م والتشكل الميتوكوندريا). على النقيض من قياس الفلور أو التدفق الخلوي، وهذه الاستراتيجية تسمح الكمي من المعلمات تحت الخلية على مستوى الخلية الفردية مع ارتفاع القرار الزماني الزماني، قبل وبعد التحفيز التجريبي. الأهم من ذلك، فإن الطبيعة القائمة على الصورة من طريقة يسمح استخراج المعلمات المورفولوجية بالإضافة إلى شدة الإشارة. وتستخدم مجموعة الخصائص المجمعة للتحليل الاستكشافي والإحصائي للبيانات المتعددة المتغيرات لكشف الاختلافات بين المجموعات السكانية الفرعية وأنواع الخلايا و / أو العلاجات. هنا، يتم تقديم وصف مفصل للمقايسة، جنبا إلى جنب مع مثال التجربة التي تثبت قدرتها على التمييز لا لبس فيه بين الحالات الخلوية بعد الاضطراب الكيميائي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وينظم تركيز روس داخل الخلايا بدقة من خلال التفاعل الديناميكي بين روس إنتاج ونظم روس إزالة الغبار. الخلل بين اثنين يثير حالة من الاكسدة. من بين المصادر الرئيسية لل روس هي الميتوكوندريا 1 . نظرا لدورها في التنفس الخلوي، فهي المسؤولة عن الجزء الأكبر من الفوق الخلايا داخل الخلايا (O 2 • - ) جزيئات 2 . وهذا ينتج في معظمه من تسرب الإلكترون إلى O 2 في مجمع 1 من سلسلة النقل الإلكترون في ظل ظروف قوية سلبية سلبية الغشاء الميتوكوندريا الداخلي (Δψ م )، أي فرط الاستقطاب الميتوكوندريا. من ناحية أخرى، كان الاستقطاب الميتوكوندريا يرتبط أي....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يوصف البروتوكول أدناه على أنها نفذت للخلايا ندف ومع استخدام لوحات مولتيويل المحددة في ملف المواد. انظر الشكل 1 للحصول على نظرة عامة حول سير العمل.

1. إعداد الكواشف

  1. إعداد المتوسطة كاملة عن طريق استكمال دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) مع 10٪ V / V مصل البقري الجنين (فبس) و 100 إيو / مل البنسلين و 100 إيو / مل الستربتومايسين (بس). ل 500 مل المتوسطة كاملة، إضافة 50 مل من فبس و 5 مل من بس إلى 445 مل من دمم.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم قياس مقايسة باستخدام العديد من التجارب السيطرة، ونتائجها وصفها في سيبراث وآخرون. 1 - وباختصار، فإن استجابة مضان سم-H 2 دكفدا و تمرم إلى التغيرات التي يسببها خارجيا في روس الخلايا و Δψ م، على التوالي تم تحديدها لتحديد النطاق الديناميكي. ل سم-H 2 دكفدا، أظهرت ندف زيادة خطية في إشارة مضان عند التعامل مع زيادة تركيزات تبهب بين مجموعة من 10 ميكرومتر إلى 160 ميكرومتر. وبالمثل، ل تمر.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه الورقة طريقة عالية المجهر المحتوى للكمية في وقت واحد من مستويات روس داخل الخلايا و مورفوفونكتيون الميتوكوندريا في ندف. وأظهرت أدائها مع دراسة حالة عن ندف الصندوق العالمي للمصايد. النتائج تدعم الأدلة السابقة من الأدب التي زادت مستويات روس أو ضعف الميتوكوندريا لوحظت بعد العلاج مع مثبطات الأنزيم البروتيني من نوع 1 فيروس نقص المناعة البشرية، وإن كان في تجارب منفصلة 19 ، 20 ، 21 ،.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويقول المؤلفون إنه لا توجد مصالح مالية متنافسة أو تضارب مصالح آخر. ويكفل المؤلف المناظر أيضا أن يطلب من جميع المؤلفين الكشف عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث من قبل جامعة أنتويرب (TTBOF / 29267 ، TTBOF / 30112) ، وصندوق البحوث الخاص بجامعة غنت (مشروع BOF / 11267/09) ، و NB-Photonics (رمز المشروع 01-MR0110) ومبادرة CSBR (مراكز أبحاث بيولوجيا الأنظمة) من المنظمة الهولندية للبحث العلمي (NWO; لا: CSBR09 / 013V). تم اقتباس أجزاء من هذه المخطوطة من منشور آخر < sup class = 'xref'>1 ، بإذن من Springer. يشكر المؤلفون خيرت ميسن على مساعدته في المجهر الواسع.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي > كواشف < / قوي >
رباعي ميثيل رودامين ، ميثيل إستر ، بيركلورات (TMRM) ThermoFisherScientificT668
CM-H2DCFDA (مؤشر الإجهاد التأكسدي العام) ThermoFisherScientificC6827
ثنائي ميثيل سلفوكسيدسيجما) ألدريتشD8418
MatriPlate 96-Well زجاجي قاع MicroWell Plate 630 & micro ؛ L-Black 0.17 مم أنظمة علوم الحياة ذات الزجاج المنخفضMGB096-1-2-LG-L
HBSS مع الفينول الأحمر 500 ملLonzaBE10-527F
DMEM نسبة عالية من الجلوكوز مع L-glutamineLonzaBE12-604F
محلول ملحي من الفوسفات (PBS) بدون Ca و MgLonzaBE17-516F
HEPES 1 M 500 ملLonza17-737F
محلول التربسين فيرسين (EDTA)LonzaBE17-161E
Cy3 AffiniPure F (ab') 2< / sub> جزء الحمار المضاد للأرانب IgG (H + L)جاكسون711-166-152الجسم المضاد المستخدم للحصول على صورة المجال المسطح
Alexa Fluor 488 AffiniPure F (ab') 2< / sub> جزء حمار مضاد للأرانب IgG (H + L)جاكسون711-546-152الجسم المضاد المستخدم للحصول على صورة المجال المسطح
<قوي>الاسم<قوي>الشركة رقم الكتالوجتعليقات
Equipment
Nikon Ti eclipse المجهرنيكون
نظام التركيز المثالي (PFS)نيكونالمستند إلى الأجهزة نظام التركيز التلقائي
CFI Plan Apo Lambda 20X الهدفNikon
NameCompanyCatalog NumberComments
Software
NIS Elelements Advanced Research 4.5 مع وحدة JOBSنيكونيستخدم هذا البرنامج لتوجيه المجهر وبرمجة / تنفيذ بروتوتوكول الحصول التلقائي
على الصور ImageJ (FIJI) الإصدار 2.0.0-rc-43 / 1.50g
RStudio الإصدار 1.0.44Rstudio
R الإصدار 3.3.2
واسع المجال

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sieprath, T., Corne, T. D. J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H., De Vos, W. H. Integrated High-Content Quantification of Intracellular ROS Levels and Mitochondrial Morphofunction. AAEC. 219, 149-177 (2016).
  2. Marchi, S., et al. Mitochondr....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

High content MicroscopyReactive Oxygen SpeciesMitochondrial Membrane PotentialMitochondrial MorphologyCellular Redox ProfilingFluorescence MicroscopyImage AnalysisCM H2DCFDA StainingTMRM StainingPrincipal Component Analysis

Related Articles