مقالة منهجية

التصور الكمي من التسلل الكريات البيض في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب مداهم من قبل ورقة ضوء المجهري

DOI:

10.3791/55450

⸱

مايو 31, 2017

 ,  ,  , 
1Department of Translational Skin Cancer Research, University of Duisburg/Essen, 2Institute for Experimental Immunology and Imaging, University of Duisburg/Essen, 3Imaging Center Essen, Electron Microscopy Unit, University Hospital of Essen

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، ونحن تصف نهج ورقة المجهر الضوئي لتصور القلب CD45 + الكريات البيض التسلل في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب مداهم العقيم، والذي يسببه العلاج داخل الخناق السموم علاج الفئران CD11c.DTR.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح ضوء ورقة المجهري مضان (لسفم)، جنبا إلى جنب مع بروتوكولات المقاصة الكيميائية، المعيار الذهبي لتحليل الهياكل فلورزنتلي المسمى في العينات البيولوجية الكبيرة، وينخفض ​​إلى دقة الخلوية. وفي الوقت نفسه، فإن التحسين المستمر للبروتوكولات الأساسية وتعزيز توافر النظم التجارية المتخصصة تمكننا من التحقيق في المجهرية لأجهزة الفأر كله وحتى تسمح لتوصيف السلوك الخلوي في مختلف نهج التصوير الخلية الحية. هنا، نحن تصف بروتوكول للتصور المكاني كله جبل والتقدير الكمي للسكان CD45 + الكريات البيض في قلوب الفأر الملتهبة. طريقة توظف سلالة الماوس المعدلة وراثيا (CD11c.DTR) التي أظهرت مؤخرا لتكون بمثابة نموذج قوي، محرض لدراسة تطور التهاب عضلة القلب المميتة مداهم، تتميز عدم انتظام ضربات القلب القاتلة. ويشمل هذا البروتوكول تحريض عضلة القلب الحث، إنترافيتتلطيخ خلية بوساطة الأجسام المضادة، وإعداد الجهاز، و لسفم مع صورة بمساعدة الحاسوب بعد المعالجة. على الرغم من تقديمها على أنها وسيلة تكييفها للغاية لسؤالنا العلمي معين، بروتوكول يمثل مخططا لنظام قابل للتعديل بسهولة التي يمكن أيضا استهداف هياكل الفلورسنت مختلفة تماما في الأجهزة الأخرى وحتى في الأنواع الأخرى.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلال تطور المجهر الضوئي، ظهرت العديد من الأشكال المتخصصة، وكلها وضعت للحد من القيود في عملية التصور لعينات معينة. واحدة من هذه الطريقة هي ورقة ضوء المجهر مضان (لسفم). وضعت لأول مرة في عام 1903 من قبل سيدنتوف وزيغموندي 1 وإيجاد أول التطبيقات البيولوجية الأساسية في 1990s في وقت مبكر 2 ، أصبح لسفم أداة المجهرية أقوى حتى الآن لتصور العينات الكبيرة، مثل أجهزة الماوس سليمة، مع إشارة إشارة الفلورسنس وصولا الى المستوى الخلوي. وبسبب هذه الفوائد، جنبا إلى جنب مع إمكاناتها لتصوير الخلايا الحية، واسم طرق الطبيعة لسفم "أسلوب السنة 2014 3 ".

وكما يوحي اسمها، يتم إجراء إضاءة العينة في لسفم من قبل ورقة الضوء، والتي يتم توجيهها عموديا على محور الهدف المستخدم fأو جمع الضوء الانبعاثات وتشكيل الصورة اللاحقة. وعادة ما يتم إنشاء ورقة الضوء إما عن طريق التركيز واسعة، شعاع الليزر الموازاة مع عدسة أسطوانية أو عن طريق حركة جانبية سريعة من الحزم الليزر الضيقة، وتركز في واحد فقط الأفقي أو الرأسي الطائرة 4 ، 5 . وبهذه الطريقة، يتم إضاءة فقط المستوى البؤري للبصريات التصوير، وعادة مع سمك 1-4 ميكرون. وبالتالي، لعينة الفلورسنت وضعت في الطائرة الإضاءة، كل من جيل من الضوء المتناثرة وآثار فوتوبلاشينغ من المناطق فوق أو تحت الطائرة البؤرية يتم القضاء عليها أو قمعها إلى حد كبير 6 ، 7 . وبما أن جميع الطائرات خارج البؤرة ليست مضيئة، يتم حذف تأثيرات فوتوبلاشينغ في هذه المناطق. على النقيض من متحد البؤر القياسية أو متعددة الفوتون المجهري، ومسارات ضوء مضيئة والمنبعثة منفصلة عن بعضها البعض، وبالتالي فإن الصورة النهائية كوال إيتي لا تعتمد على التركيز المثالي من شعاع ضوء الإثارة من خلال الأهداف. اعتمادا على السؤال الأساسي، وبالتالي فمن الممكن استخدام الأهداف مع مجال هائل من الرأي (فوف) بحيث أكبر منطقة ممكنة من الطائرة مضيئة يمكن تصويرها دون أي أجزاء مكون تتحرك في اتجاه زي.

في أنظمة لسفم الحديثة، يتم التقاط صورة الفلورسنت من القسم البصري ولدت على جهاز حساسة للغاية تهمة اقتران (كسد) أو مكملة أشباه الموصلات أكسيد المعادن (كموس) الكاميرات، التي هي قادرة على الحصول على كامل مجال الرؤية (فوف) في ميكروثانية. لذلك، عن طريق تحريك العينة من خلال ورقة الضوء والحصول على الصور في خطوات Z محددة، فمن الممكن الحصول على معلومات 3D كاملة من عينة في فترة معقولة من الزمن 8 ، 9 ، مما يجعل هذه التقنية تنطبق على الخلية الحية الدراسات 10 ،أس = "كريف"> 11 ، 12 .

ومع ذلك، على الرغم من لسفم يوفر طريقة سريعة وحساسة، ومضان مضان، انتقال الضوء من خلال العينة لا تزال قضية رئيسية، وخصوصا عندما تكون العينات البيولوجية الكبيرة هي الهدف لتحليل 3D. يتم تعديل انتقال الضوء بشكل حاسم من قبل الجوانب الفيزيائية للامتصاص وبانتثار الضوء في واجهات الهياكل مع مؤشرات الانكسار مختلفة 13 . لذلك، عندما عينات التصوير عدة مليمترات في الحجم، يتم الجمع بين لسفم في الغالب مع بروتوكولات المقاصة لجعل العينات شفافة بصريا. وتستند هذه التقنيات على فكرة إزالة المياه من الأنسجة البيولوجية ذات الصلة وتبادلها مع وسائل الإعلام الغمر المائي أو العضوي القائم على المذيبات، والتي يتم اختيارها لتتناسب بشكل ضيق مع مؤشرات الانكسار من مكونات الأنسجة المستهدفة معينة. ونتيجة لذلك، يتم تقليل تشتت الضوء الجانبي، وجميع الأطوال الموجيةمن الضوء يمكن أن تمر أكثر كفاءة من خلال الأنسجة 13 . في كثير من الحالات، تظهر العينات البيولوجية التي تعامل بهذه الطريقة ظاهريا واضحة وضوح الشمس، والتي تمكن لسفم أن تجري، حتى على أجهزة الماوس بأكملها، وذلك باستخدام لمسافات طويلة العمل، وأهداف التكبير منخفضة.

هنا، نقدم بروتوكول التحضير للتصوير عينة كبيرة في المجهر ورقة الضوء (انظر الجدول من المواد)، التي أنشأناها للتحقيق في التسلل القلبي الخلوي في نموذج الفئران من التهاب عضلة القلب 15 . CD11c.DTR الفئران تعبر عن مستقبلات السموم الخناق الرئيسيات (دتر) تحت سيطرة CD11c المروج 16 . ونتيجة لذلك، يتم عرض الخلايا في هذه الفئران، والتي تعبر عن CD11c جنبا إلى جنب مع دتر، حساسة للذيفان الداخلي للالدفتيريا الخناق (الدفتيريا السم، دتكس). والعلاج المنهجي لهذه الحيوانات مع دتكس النتائج في استنفاد جميع CD11c + سيLLS. CD11c هو إنتغرين و، كمستقبلات سطح الخلية لمجموعة متنوعة من العوامل القابلة للذوبان المختلفة، وتشارك في عمليات التنشيط والنضج أساسا في خلايا النسب مونوسيتيك 17 . ونتيجة لذلك، وقد تم استخدام نموذج الماوس CD11c.DTR بشكل مكثف لدراسة دور الخلايا الجذعية والمجموعات الفرعية بلعم في سياق العديد من الأسئلة المناعية المختلفة. مع مرور الوقت، فقد أفيد أن الفئران CD11c.DTR تعامل بشكل منهجي مع دتكس يمكن أن تتطور الآثار الجانبية السلبية ويمكن عرض معدلات وفيات مرتفعة بقوة 18 ، 19 . في الآونة الأخيرة، كنا قادرين على تحديد السبب الكامن وراء الوفاة 15 ، واصفا تطور التهاب عضلة القلب مداهم بعد تطبيق دتكس داخل القصبة الهوائية في هذه الحيوانات. تسبب تحدي السموم الدمار الخلوي، بما في ذلك في الأجزاء الوسطى من نظام نقل التحفيز في القلب. ورافق ذلك CD45 ضخمة+ الكريات البيض التسلل، مما يؤدي في النهاية إلى عدم انتظام ضربات القلب القاتلة. في هذه الحالة، لم يكن فقط ظهور السكان الكريات البيض مهمة، ولكن أيضا التوزيع المكاني داخل القلب. هذا السؤال التجريبي هو التحدي للتصوير المجهري الحديث، والتي قمنا حلها من خلال نهج ورقة المجهر الضوئي الذي يدعمه تلطيخ الأجسام المضادة إنترافيتال والبروتوكول القائم على المذيبات العضوية القائمة على المقاصة البصرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية للاتحاد الأوروبي وتمت الموافقة عليها من قبل السلطات المحلية ذات الصلة في إيسن (أز 84-02.04.2014A036 - لاندسامت فور ناتور، أومويلت أوند فيربراوشرشوتز نوردرهين-ويستفالين، إسن، جيرماني). واستخدمت الحيوانات وأقامت تحت ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض.

1. تحريض التهاب عضلة القلب عن طريق الدفتيريا السموم (دتكس)

  1. إعداد حل دتكس لتحريض التهاب عضلة القلب عن طريق تمييع حل الأسهم دتكس مع المالحة الفوسفات مخزنة (بس) إلى 1 ميكروغرام / مل حل العمل.
  2. تطبيق 100 ميكرولتر من هذا الحل إنتراتراشيالي (إيت) إلى 8 إلى 10 الفئران CD11c.DTR عمرها (5 نانوغرام / غرام من وزن الجسم (بو))، كما هو مبين من قبل هاسنبرغ وآخرون. لأنه تطبيق تعليق بوغ الفطرية 20 .
    ملاحظة: التطبيق داخل الصفاق من السم قد يؤدي إلى تحريض مماثل منالتهاب عضلة القلب القاتلة. ومع ذلك، فإن هذا النهج سيتعين أولا التحقق من صحته.
    1. لذلك التطبيق، تخدير الحيوانات عن طريق الحقن داخل الصفاق (إب) من 100 ملغ / كغ من الكيتامين و 10 ملغ / كغ من وزن زيلازين.
    2. بعد الوصول إلى تخدير عميق (أخمص القدمين قرصة الاختبار)، إنتوبات الحيوانات باستخدام 22 G القسطرة الوريدية إندويلت من خلال تجويف الفم. التحقق من المواقع الصحيحة للأنبوب العدسة عن طريق تهوية الحيوانات مع جهاز التنفس الصناعي الحيوانات الصغيرة بمعدل 250 نفسا في الدقيقة وحجم استنشاق 250 ميكرولتر في التنفس، كما أظهرها هاسنبرغ وآخرون. الله. 20 .
      ملاحظة: عند وضعه بشكل صحيح، فإن معدل التنفس من الحيوانات تتغير وفقا لإعدادات التهوية تطبيقها.
    3. قطع نظام التهوية وغرس 100 ميكرولتر من حل دتكس أو مبلغ مساو من برنامج تلفزيوني كسيطرة من خلال القسطرة في الرئة ومواصلة تهوية الحيوانات لمدة 1 دقيقة إضافية.
  3. السماح للحيوانات التعافي من التخدير ومراقبة الحالة الصحية العامة وتغير وزن الجسم لمدة 4 أيام.
    ملاحظة: اعتمادا على الخلفية الوراثية، سلالة الماوس، أو الوزن الأولي، وشدة وظهور التهاب عضلة القلب قد تختلف وينبغي تحديدها أولا.

2. إعداد عينة للضوء ورقة المجهري

  1. 4 أيام بعد تطبيق السموم، تخدير الفئران عن طريق بيغ غرفة تحريض مع تبخير 2٪ إيسوفلوران / مزيج الأكسجين. حقن 15 ميكروغرام من الأجسام المضادة المضادة CD45 المسمى مباشرة (استنساخ 30-F11، AlexaFluor647 (AF647)) في 50 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني عن طريق الوريد (4) باستخدام الطريق التطبيق المدارية الرجعية، والذي يضمن تطبيق سريع جدا ودقيق للغاية من كمية صحيحة من الأجسام المضادة.
    ملاحظة: تم الوصول إلى عمق المطلوب من التخدير عندما الفئران هي راقد ولا تتفاعل مع أخمص القدمين قرصة الاختبار.
  2. بعد 2 ساعة من الحضانة، التضحية الفئران عن طريق خلع عنق الرحمد يروي قلوب في الموقع مع 5 مل من برنامج تلفزيوني / إدتا (5 ملم).
    1. فضح القلب وحقن حل نضح في البطين الأيمن باستخدام 21 G القسطرة. إرضاء مع بطيئة، الضغط المستمر والتأكد من أن الدم يمكن أن تنضب بعد قطع فتح الشريان الأورطي.
      ملاحظة: هذا نضح ترانزكارديال قد يؤدي إلى التحف الصغيرة التحف، والتي يمكن أن تزعج التصور 3D النهائي للجهاز. لذلك، يمكن أن تجريب الحيوانات المتقدمة أداء نضح من خلال الوريد الأجوف السفلي، مما يستثني الشريان الأورطي البطني.
  3. لتثبيت الكيميائية، يروي القلب من خلال نفس العطلة مع 5 مل من بارافورمالدهيد 4٪ (بفا). الحفاظ على القسطرة في مكان وببساطة إرفاق حقنة جديدة مليئة بفا. إرضاء مع الضغط البطيء والثابت.
    ملاحظة: بارافورمالدهيديس سامة للغاية. وتجنب الاتصال مع الجلد والعينين وغيرها من الغشاء المخاطي.
    1. فهم بلطف القلب مع ملقط مسننة. بوليرة لبنانية قليلا صعودا؛ وقطع جميع الاتصالات الأنسجة، بما في ذلك الشرايين الواردة والصادرة والأوردة. تخزين الجهاز لمدة 4 ساعة إضافية في بفا 4٪ لمزيد من التثبيت.
  4. لتجفيف الجهاز، احتضان القلب في سلسلة الايثانول تصاعدي في 50٪، 70٪، ومرتين في 100٪، كل لمدة 12 ساعة، في 4 درجات مئوية في الظلام. هنا، استخدم الأسود 5 مل أنابيب البولي بروبيلين رد فعل، والسماح لهم لتدوير باستمرار في دوار أنبوب باستخدام سرعة دوران بطيئة لمنع تشكيل فقاعة الهواء.
  5. إعداد عينة كاملة عن طريق المقاصة الكيميائية. لجعل قلوب شفافة، احتضان لهم في 98٪ ديبنزيل الأثير (دب) بينما تدور باستمرار بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: دب هو مهيج للعيون، والجلد، والجهاز التنفسي.

3. ضوء ورقة المجهري

  1. إجراء لسفم باستخدام المجهر ورقة الضوء (انظر الجدول من المواد). وضع العينة على حامل عينة القياسية من المجهر في سو مليئة دبفيت، وهو مناسب للعينات حتى 30 مم × 30 مم × 15 مم.
  2. عقد العينة بقوة في مكان خلال الحصول على الصور باستخدام كتل الاغاروز المجففة والمطهرة.
    1. لإعداد كتل الاغاروز، صب 2٪ الاغاروز المنصهر في قالب (15 مم × 15 مم × 5 ملم). السماح للأغاروز يبرد حتى يصلب.
    2. يذوى في سلسلة إيثانول تصاعدي (50٪، 70٪، ومرتين في 100٪). احتضان كتل الاغاروز بين عشية وضحاها في 98٪ دب. تخزين الاغاروز في دب حتى يتم استخدامه.
      ملاحظة: كما يتكون الاغاروز أساسا من الماء، ويمكن تمديد أوقات حضانة لكل خطوة الجفاف، اعتمادا على حجم الكتلة.
      ملاحظة: دب هو مهيج للعيون، والجلد، والجهاز التنفسي.
    3. عند الحاجة، وقطع كتلة أغاروس أعدت إلى الشكل المطلوب باستخدام مشرط حاد. عادة، وقطع أشكال المنشور أو إسفين على شكل لوضع على حواف محول العينة.
      ملاحظة: كما كتل الاغاروز مرنة،تبقى العينة في مكانها عندما دفعت بقوة قليلة.
  3. كشف إشارات مضان من الفائدة (هنا، تألق ذاتي ومكافحة CD45 تلطيخ الأجسام المضادة) مع الإثارة المناسبة والانبعاثات مرشح الانبعاثات.
    1. للكشف عن إشارة التضامن التلقائي الضام المستمدة، استخدم مرشح الموجة الخلفية 525/50 نانومتر في الطول الموجي الإثارة من 488 نانومتر (أوبسل: 50 ميغاواط). تم الكشف عن تلطيخ CD45 مع الأجسام المضادة ل AF647 في 668 نانومتر (مرشح الموجة العريضة: 680/30 نانومتر) وفي الطول الموجي الإثارة من 647 نانومتر (ليزر الصمام الثنائي: 50 ميغاواط).
    2. اختيار 4 ميكرون كما المسافة بين اثنين من الطائرات Z الفردية.

4. صورة بعد المعالجة

ملاحظة: تمت معالجة بيانات الصورة الرقمية المكتسبة بشكل أكبر باستخدام برنامج معالجة الصور وتحليلها ثلاثي الأبعاد / 4D العلمي (انظر جدول المواد).

  1. فتح ملفات البيانات وتعديلها مسبقا.
    1. بعد بدء برنامج التحليل، حدد زر "تجاوز" في الزاوية العلوية اليسرى. لفتح أكوام الصور، اختر "ملف"، "فتح"، وحدد مجلدا يحتوي على البيانات من القناة المكتسبة الأولى. اختر "تعديل" و "إضافة قنوات" لإضافة قنوات أخرى تم الحصول عليها.
      ملاحظة: اعتمادا على حجم البيانات ونظام الكمبيوتر، قد تستغرق هذه العملية عدة دقائق. بروتوكول عرض يوضح جميع الخطوات ل 2 قنوات اكتساب (تألق ذاتي و AF647).
    2. قم بتصحيح أبعاد x و y و z فوكسل بالنقر على "تعديل" وتحديد "خصائص الصورة". عند فتح النافذة الجديدة، اضبط المعلمات.
      ملاحظة: هذه الخطوة تعتمد على نظام المجهر المستخدمة وتنسيق البيانات معين. تصحيح قيم شيز أمر بالغ الأهمية لحجم لاحق والقياسات البعيدة. في معظم الحالات، يتم تخزين هذه المعلمات كبيانات ميتا في ملفات ميكروغراف. ومع ذلك، إذا كان الملف فورمات لا يمكن تفسيرها بشكل صحيح من قبل برنامج التحليل، فمن المهم أن تدخل يدويا حجم بكسل. حجم بكسل في x و y أبعاد تعتمد على حجم بكسل الكاميرا، بينينغ تطبيقها المحتملة، والعدسة والتكبير موضوعي. حجم بكسل في z ما يعادل حجم خطوة Z محددة ذاتيا (على سبيل المثال، 4 ميكرون).
  2. تعديلات القناة
    1. أولا تحويل إشارة تألق ذاتي إلى الرمادي عن طريق فتح "تعديل العرض" ("تحرير" و "عرض عرض التكيف"). سوف نافذة جديدة قائمة كافة القنوات المفتوحة وإعدادات العرض لجميع منهم. لتغيير لونه الافتراضي، حدد قناة تألق ذاتي واختيار "الأبيض" نمط العرض. انقر على "موافق" للتطبيق.
    2. لتعديل مستوى أسود، والعودة إلى "تعديل العرض" وضبط قيمة مستوى أسود لاستبعاد إشارات الخلفية غير المرغوب فيها التي لا تمثل بنية عينةالصورة.
      1. للقيام بذلك، استخدم المثلث العلوي الأيسر على شريط القناة واسحبه من اليسار إلى اليمين.
        ملاحظة: سيتم تصور التغييرات على الفور. تأكد من قمع الإشارات غير المستمدة من العينة فقط. يجب ألا تكون القيم الدنيا في الخلفية "0" لتجنب وحدات البكسل السوداء، حيث قد تكون هناك حاجة إلى إشارات ضوئية لإجراء عمليات حسابية إضافية. تأكد من أن جميع التغييرات مستوى أسود يتم تنفيذها بعد الحصول على الصور. وإلا، قد تفقد معلومات العينة القيمة. إن التسوية على مستوى اللون الأسود تخدم أغراض تمثيلية فقط. لاستخدام نفس إعدادات العرض عبر عينات مختلفة، يمكن إدخال القيم الدقيقة في الحقل "مين" العددي أسفل قائمة القنوات. وهذا مفيد جدا للتحليلات الكمية.
    3. إجراء تعديل كثافة، إما عن طريق استخدام المثلث العلوي الأيمن لضبط كثافة قناة منها أو عن طريق إدخال قيم دقيقة في الحقل "ماكس" العددية تحت تشانl.
    4. إجراء تعديل التباين عن طريق سحب المثلث السفلي في منتصف شريط القناة لزيادة أو تقليل قيمة غاما أو عن طريق إدخال القيم الدقيقة.
    5. ضبط قناة AF647 وفقا لقناة تألق ذاتي. كالفارق، تعيين التصور للإشارة AF647 إلى جدول خريطة اللون الحرارة نظرة المتابعة. القيام بذلك عن طريق اختيار وضع القناة "النار" في نهج مماثل لتلك الموجودة في الخطوة 4.2.1.
      ملاحظة: كما شدة إشارة الإجمالية هي أقل بكثير بالمقارنة مع قناة تألق ذاتي، يتم تعديل مستويات سوداء عادة لقيم أقل بكثير. أما بالنسبة للقناة تألق ذاتي، وعادة ما يتم زيادة سطوع هذه القناة.
    6. حدد "وضع مزيج" لتصور هياكل الأنسجة في التفاصيل. تحليل جميع العينات من سلسلة واحدة مع نفس القيم المعلمة.
  3. لقطة افتراضية
    1. لقطع تقريبا فتح الجهاز قبل المعرض المشهد 3Dرت، وتطبيق طائرة لقطة على كائن 3D المقدمة.
      1. انقر فوق "لقطة الطائرة" رمز (مقص) في قائمة الكائن. داخل عرض الصورة، سيظهر إطار أصفر ومناور (مغزل أبيض). تدوير المغزل في نهاية أرق مع الماوس، وبالتالي تغيير اتجاه الطائرة لقطة، ونقل الجزء الأوسط سمكا من المغزل لتحديد عمق المطلوب من لقطة.
      2. إخفاء الإطار والمناورة عن طريق إلغاء تحديد خانات الاختيار الخاصة بها أسفل قائمة الكائن وإنشاء اللقطات المطلوبة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نهج لسفم عرض يحلل توزيع الكريات البيض وكمية في قلوب الفئران عند تحريض التهاب عضلة القلب الحاد. الشكل 1A يفسر بروتوكول ما قبل المعالجة للفئران المعدلة وراثيا CD11c.DTR لالتهاب عضلة القلب الحث. هذه الخطوة تمثل الزناد اللازم لتجنيد الكريات البيض إلى عضلة القلب. بعد تطبيق دتكس ناجحة، والحيوانات تتطور أعراض المرض الشديد، مثل الضعف العام، وفقدان الشهية، وفقدان الوزن في حدود 2-4 أيام. بعد 4 أيام، هي ملطخة الكريات البيض من قبل الرابع ....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في علوم الحياة الحديثة، والتصور المجهري للعمليات البيولوجية يلعب دورا متزايد الأهمية. في هذا السياق، تم تحقيق العديد من التطورات خلال القرنين الماضيين التي تساعد على الإجابة على الأسئلة التي لا يمكن معالجتها حتى هذه النقطة،. أولا، كان هناك ميل واضح إلى زيادة جذرية في قدرة القرار المجاهر الخفيفة. مع المجهر إضاءة منظم (سيم) 21 ، 22 ، حفز انبعاث الانبعاث (ستيد) المجهري 23 ، والمجهر توطين الصورة تنشيط (...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيدت البحوث في مختبر غونزر من قبل وزارة التعليم والبحث الاتحادية الألمانية (منحة رقم 0315590 م) ومؤسسة الأبحاث الألمانية (منحة رقم GU769 / 4-1، GU769 / 4-2). كما نشكر إمسيس على الدعم الفني وسيباستيان كوبات للمساعدة في 3D النمذجة الكرتون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
توكسين الدفتيرياسيجما ألدريتشD0564
فوسفات محلول ملحيمخزن بيوكرومL182-10
كيتامين [50 مجم / مل]إنريساPZN 4089014
زيلازين [2٪] حقنةسيفا
براونREF 9161502براون أومينكان F & nbsp ؛
القسطرة الوريدية Indwelt بكتون ديكنسونREF 381923BD Insyte Autoguard
التنفس الصناعي للحيواناتالصغيرة هارفارد73-0044
الجسم المضاد MiniVent anit-CD45 (AF647)BioLegend103124
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ملح ثنائي الصوديوم ثنائي هيدراتكارل روث8043.2
قسطرة (21 جم)BD BiosciencesREF 387455BD valu-set
أنبوب بارافورمالدهايدسيجما ألدريتشP6148
PE (5 مل)كارل روثEKY9.1روتيلابو
إيثانولكارل روث9065.4
ثنائي بنزيل إيثرسيجما ألدريتش108014
أنبوب دوارميلتيني بيوتيك130-090-753ماكسيمكس
الاغاروز (التبلور المنخفض)سيجما ألدريتشA4018
(15 × 15 × 5 مم)Tissue Tek4566Cryomold   ؛
نظام مجهر الألواح الخفيفةLaVision BiotecUltramicroscope 
جسم المجهرأوليمبوسMVX10  
الهدفأوليمبوس0.5  NA MVPLAPO 2XC ، WD 5.5   ؛ مم  
كاميرا sCMOS 5.5 ميجابكسلAndor Technology
488 نانومتر OPSL (50mW) ليزرمتماسك
647 نانومتر & nbsp ليزر (50 ميجا واط) برنامجمتماسكة
BitplaneIMARIS Ver. 8.3
سلالة الماوس المعدلة وراثياستيفن جونغ وآخرون.CD11c.DTR
wt سلالة الماوسEnvigoBalb / c Ola Hsd J
وحدة الليزر LaVisionBiotec
MVPLAPO 2XC عدسة
جهاز قالب معالجة وتحليل الصور ثلاثية الأبعاد موضوعية

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
  2. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
  3. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
  4. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705(2007).
  5. Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), pdb top78 (2010).
  6. Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
  7. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  8. Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
  9. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
  10. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  11. Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207(2013).
  12. Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
  15. Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
  16. Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
  17. Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
  18. Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
  19. Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
  20. Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
  21. Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
  22. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
  23. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
  24. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  25. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  26. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  27. Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
  28. Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
  29. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  30. Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , in press (2016).
  31. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  32. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  33. Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014(2005).
  34. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  35. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  36. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650(2015).
  37. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  38. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  39. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  40. Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
  41. Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
  42. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

CD45

مقالات ذات صلة