يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الرئة ماوس شرائح لتصور لايف الخلايا الجذعية الرئوي قطع الدقة

17.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55465

⸱

أبريل 5, 2017

 ,  ,  , 
1Immunity, Inflammation, and Disease Laboratory, Division of Intramural Research, National Institute of Environmental Health Sciences, NIH

في هذه المقالة

ملخص

نحن تصف طريقة لتوليد قطع الدقة الرئة شرائح (PCLS) والمناعية لهم لتصور توطين مختلف أنواع الخلايا المناعية في الرئة. ويمكن تمديد بروتوكول لدينا تصور موقع وظيفة العديد من أنواع مختلفة من الخلايا في إطار مجموعة من الشروط.

الملخص

استنشاق المواد المسببة للحساسية والجراثيم يثير عدة تغييرات في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا المناعية في الرئة. التدفق الخلوي هو أسلوب قوية للتحليل الكمي للبروتينات سطح الخلية في الخلايا المناعية، لكنه لا يقدم أي معلومات عن التوطين والهجرة أنماط من هذه الخلايا داخل الرئة. وبالمثل، المقايسات الكيميائي يمكن أن يؤديها لدراسة إمكانية الخلايا على الاستجابة للعوامل الكيميائي في المختبر، ولكن هذه المقايسات لا تتكاثر في بيئة معقدة في الرئة سليمة. وعلى النقيض من هذه التقنيات المذكورة أعلاه، وموقع من أنواع الخلايا الفردية داخل الرئة يمكن تصور بسهولة عن طريق توليد خفض الدقة والرئة شرائح (PCLS)، تلطيخ لهم المتاحة تجاريا الأجسام المضادة، الموسومة fluorescently، وتصور المقاطع بواسطة المجهر متحد البؤر. PCLS يمكن أن تستخدم في كل من يعيش وأنسجة الرئة ثابتة، ويمكن للشرائح تشمل مناطق كبيرة مثل شريحة من الفص كامل. وقد استخدمنا هذا البروتوكول لتصور بنجاح مكان وجود مجموعة واسعة من أنواع الخلايا في الرئة، بما في ذلك أنواع متميزة من الخلايا الجذعية، الضامة، العدلات، وخلايا T والخلايا B، وكذلك خلايا هيكلية مثل اللمفاوية، البطانية، و الخلايا الظهارية. القدرة على تصور التفاعلات الخلوية، مثل تلك التي بين الخلايا الجذعية وخلايا T، في العيش، وأنسجة الرئة ثلاثية الأبعاد، يمكن أن تكشف عن كيفية تحرك الخلايا داخل الرئة وتتفاعل مع بعضها البعض في حالة مستقرة وخلال الالتهاب. وهكذا، عندما تستخدم بالاقتران مع إجراءات أخرى، مثل التدفق الخلوي وPCR الكمي، PCLS يمكن أن تسهم في فهم شامل من الأحداث الخلوية التي تكمن وراء أمراض الحساسية والتهابات الرئة.

المقدمة

عقب استنشاق من المحفزات الموالية للالتهابات مثل lipopolysaccharide في (LPS)، وهناك حركة منسقة من الخلايا المناعية إلى داخل، ومن الرئة. على سبيل المثال، يتم تجنيد العدلات بسرعة في لحمة الرئة والشعب الهوائية. وبالإضافة إلى ذلك، بعض مستضد الخلايا المهنية المعروفة باسم الخلايا الجذعية التقليدية (جان تنمية المجتمعات المحلية) تخضع لنمط الهجرة معقدة نسبيا 1 و 2. ويمكن تحديد جان تنمية المجتمعات المحلية باستخدام التدفق الخلوي، ومقرها في جزء منها على العرض الخاصة بها من علامة السطح، CD11c و. فرعية متميزة من البلدان النامية يمكن تمييزها عن طريق التعبير عن سطح التفاضلية للCD103 وCD11b 3. على الحصول على مستضد استنشاق بعض جان تنمية المجتمعات المحلية الخروج من الرئة وتهاجر من خلال الأوعية الليمفاوية إلى استنزاف الرئة الغدد الليمفاوية (LNS) حيث أنها تقدم الببتيدات لمستضد محددة الخلايا T 4. هذا حدث في وقت مبكر حاسما في بدء ص المناعة التكيفيةesponses. لأسباب غير معروفة، ولكن، ليس كل جان تنمية المجتمعات المحلية التي تحصل على مستضدات استنشاق ترك الرئة، وتبقى العديد من هذه الخلايا في هذا الجهاز لعدة أشهر 5، 6. هذه الملاحظة يمكن تفسيرها جزئيا من أصل التنموي من هذه الخلايا لالوحيدات المستمدة CD11c و+ خلايا تفتقر إلى مستقبلات chemokine، CCR7، غير قادرين على الهجرة إلى LNS الإقليمية 7 و 8. ويبدو من المرجح أن إمكانيات هجرة جان تنمية المجتمعات المحلية ويتحدد أيضا، على الأقل جزئيا، من خلال وضع تشريحي في غضون الرئة. ومع ذلك، لا تتميز بشكل كامل التعريب الدقيق لهذه مجموعات مختلفة من جان تنمية المجتمعات المحلية في الرئة. معرفة محسنة لتوطين الخلايا المناعية في الرئة، والجزيئات التي توجه إليها، وهناك حاجة لفهم أفضل لكيفية عمل نظام المناعة في الرئة يصبح تفعيلها.

PCLS يجري يتزايدتستخدم لاي كنهج خارج الحي لتصور المواقع الخلوية وخلية خلية التفاعلات، مع الحفاظ على السلامة الهيكلية للبنية الرئة 9، 10. وقد استخدمت PCLS لدراسة الرئتين لكثير من الأنواع، بما في ذلك الفئران والأبقار والقرود والأغنام والخيول، والبشر (11). والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أن ما يقرب من 20 شرائح يمكن إعداد من الفص واحد من الرئة الماوس، مما يقلل من عدد الحيوانات اللازمة لإجراء التجارب الفردية. تقريبا جميع أنواع الخلايا المناعية، بما في ذلك البلدان النامية، الضامة، العدلات، والخلايا T، موجودة في PCLS والحفاظ على هياكلها العادية.

يمكن أن تستخدم أيضا لدراسة PCLS إشارات الكالسيوم وانقباض الخلايا الهوائية والعضلات الملساء بعد العلاج مع أستيل 12 أو 13 ميثاكولين. في هذا النهج، سوى جزء صغير من الرئة هوalyzed مجهريا، ولكن ذكرت إحدى الدراسات أن قياسات انكماش الهوائية في PCLS تختلف حوالي 10٪ فقط من شريحة إلى شريحة، وهذه الفرق هي مماثلة لتلك التي شوهدت باستخدام اختبارات وظائف الرئة في الحيوانات سليمة 14. وقد استخدم باحثون آخرون PCLS كنهج خارج الحي لدراسة التغيرات في التعبير خلوى وسطح الخلية علامات بعد الحضانة مع LPS 15. كما استخدمت PCLS في نموذج المجراة سابقا من تضيق الأوعية الرئوية نقص الأوكسجين في الشرايين الصغيرة داخل عنيبية. تقع هذه السفن في جزء من الرئة التي لا يمكن الوصول إليها باستخدام إجراءات أخرى، بما في ذلك تسجيلات من شرائح الشريانية تشريح أو تحليل السفن تحت الجنبة 16. وقد استخدمت مختبرنا في المقام الأول PCLS لتصور توطين الخلايا المناعية في أنسجة الرئة يعيش في حالة مستقرة وبعد في الجسم الحي تحفيز التهابات. الإجراءات وضعنا لذلك هي على النحو التالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تمت الموافقة على إجراءات حيوانات التجارب وصفها في هذه الورقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوانات معهد علوم الصحة البيئية (IACUC).

1. إعداد الرئة

  1. الفئران منزل ما بين 6 و 12 أسابيع من العمر في ظروف معينة خالية من مسببات الأمراض وفقا للمبادئ التوجيهية التي قدمتها لجان رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي.
    ملاحظة: يمكن تصوير الفئران أن يكون إما ساذجا، أو معاملة، اعتمادا على المصالح الخاصة لكل الباحث. هنا، نحن تصف توطين الخلايا المناعية في الفئران ساذجة وفي الفئران التي عولجت مع 100 ميكروغرام ألبومين البيض (OVA) و 0.1 ميكروغرام lipopolysaccharide في (LPS)، وذلك باستخدام الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) كوسيلة في حجم ما مجموعه 50 ميكرولتر. لغرس oropharyngeally OVA / LPS في الشعب الهوائية، وتخدير الحيوانات مع استنشاق الأيزوفلورين وعلقت عموديا أسنانهم مع الشريط المطاطي. وقد أدرك اللسان بلطف مع ملقط وعقد لجانب واحد لمنع البلع، و 50 & #181؛ L من الحل OVA / LPS المودعة في الجزء الخلفي من تجويف الفم كما هو موضح سابقا (17).
  2. الموت ببطء الفأر مع حقن داخل الصفاق من بنتوباربيتال الصوديوم (100 ملغ / كلغ)، ويعلقون الحيوان إلى قاعدة البوليسترين.
  3. فتح تجويف البطن مع مقص عن طريق قطع الجلد والغشاء البريتوني من منتصف البطن حتى الفك. سحب الأمعاء جانبا مع ملقط أو حافة مملة من مقص، وقص الوريد الأجوف السفلي لاستنزاف الدم بعيدا عن الرئتين. ثقب الحجاب الحاجز مع طرف حاد من مقص للسماح توسيع القفص الصدري، والحرص على عدم قطع الرئتين.
  4. الغدد اللعابية واضحة وغيرها من الأنسجة بعيدا عن القصبة الهوائية عن طريق الاستيلاء على الأنسجة وجرها بعيدا عن القصبة الهوائية الأساسية مع ملقط يدويا. إجراء شق صغير في القصبة الهوائية على الجانب الأمامي من سمكا عصابة من الغضروف باستخدام ملقط غرامة أو مقص، والحرص على عدم قطع كل وسيلة على الرغم من أن هيئة تنظيم الاتصالاتشيا. فإن شق تكون كبيرة بما يكفي للسماح للإبرة 20 G بالمرور.
  5. الشريحة 1.5 بوصة، و 20 G إبرة على قسم من أنابيب البولي ايثيلين، وترك حوالي 1 سم من الأنابيب بعد نهاية الإبرة. قطع الأنابيب في زاوية ما يقرب من 45 درجة إلى شطبة النهاية، إرفاق الإبرة إلى حقنة 1 مل، وتحميل حقنة عن طريق رسم 0.8 مل من الحارة (40 درجة مئوية) 2٪ نقطة انصهار منخفضة الاغاروز حتى من خلال إبرة.
  6. ضع نهاية الأنبوب في شق القصبة الهوائية وحقن ببطء الاغاروز إلى الرئتين. دون تحريك إبرة أو حقنة، الشريط المحقنة إلى قاعدة البوليسترين لضمان تبقى الإبرة في القصبة الهوائية.
    ملاحظة: بعد الحقن، والرئتين تكون أكبر وتضخم في الصدر. الفص الأيمن توسيع أولا، ثم الفص الأيسر. إذا توسع فص واحد فقط، وقد تم إدخال الإبرة بعمق (الماضي القصبات الهوائية)، وسيكون من الضروري أن تخلعها قليلا قبل المتابعة. هذا الجزء منيحتاج الإجراء الذي يتعين القيام به بسرعة نسبيا، قبل أن يبدأ الاغاروز لترسيخ.
  7. ضع الماوس، مع قاعدة والمحاقن لا يزال إدراجها في القصبة الهوائية، في غرفة باردة أو الثلاجة لمدة 10 دقيقة على الأقل. إذا لزم الأمر، والحيوان يمكن أن تبقى هناك لمدة تصل إلى عدة ساعات، حتى لو الشروع في الهجرة الخلية الصورة بواسطة المجهر الفيديو.
  8. وبمجرد أن الفأر هو بارد، استئصال بعناية الرئتين في تضخيم الاغاروز باستخدام مقص، ووضعها في طبق 3 سم مع الجليد PBS الباردة. الحفاظ على الجليد.
  9. اختيار الفص المطلوب للتشريح الأنسجة (على سبيل المثال، والحق الفص العلوي). تأكد من أن الجزء الداخلي من الرئة (حيث يصل إلى القصبة الهوائية) وجهه لأسفل في الطبق.
    ملاحظة: الفص استخدامها وسوف توجهها على المكبس تحديد حجم السفن والخطوط الجوية التي من شأنها أن تكون واضحة. التوجه هو موضح هنا مثالية لرؤية الخطوط الجوية الكبيرة، وحمة. الفئران لها واحد الفص الأيسر كبير وأربعة فصوص صغيرة على اليمين. إلى عن علىالتصوير PCLS بعد إدخال المواد المسببة للحساسية في الرئتين عبر فموي بلعومي أو طموح الأنف، هو مقطوع عادة الفص العلوي الأيمن، في جزء منه لأنه هو حجم مناسب، ولكن أيضا بسبب عوامل استنشاق تفريق موحد داخلها. ومع ذلك، فصوص الأخرى، وخاصة الفص الأيسر، ويمكن أيضا أن تدرس. عند المقارنة بين سلالات الماوس أو العلاج، من المهم أن يقارن نفسه الفص.

2. الرئة التقطيع

ملاحظة: تأكد شرائح باستخدام تقطيع الآلي، والمعادن تبريد كتلة، الغواص والمحاقن المعدنية، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

  1. وضع قطرة صغيرة من جميع الأغراض، لا تديرها هلام superglue على المكبس ونشر الغراء في حركة دائرية، مع الحرص على عدم السماح للالغراء تلمس الجانبين من الحقنة المعدنية. إذا الغراء اللمسات الجانبين من الحقنة، وسوف الغراء حقنة والغطاس معا.
  2. فورا بعد تغطية الغطاس مع الغراء، فهم بلطفالفص رفعه مع ملقط مع الجانب القصبة الهوائية أسفل، ربت على منديل ورقي لإزالة السائل الزائد، وبعناية وضعه على رأس المكبس. تقليم قبالة أي نوع من الأنسجة إضافية تتجاوز حافة المكبس.
  3. تحرك المكبس إلى أسفل بحيث الجانبين من الحقنة المعدنية تتحرك صعودا وأكثر من الأنسجة، وخلق تماما مع الرئة لصقها في الجزء السفلي، أي أكثر من عدة سنتيمترات عميقة. الشريط حول الجزء السفلي من حقنة معدنية لعقد هذا الموقف في المكان.
  4. بعناية صب 2٪ منخفضة ذوبان الاغاروز في 40 ° C في البئر بحيث أنها تغطي فقط الجزء العلوي من الفص.
  5. تحيط حقنة معدنية مع كتلة تقشعر لها الأبدان الجليد الباردة وتبريد الفص والاغاروز 1 - 2 دقيقة.
    ملاحظة: التبريد وقت أقصر من الاغاروز المحيطة الأنسجة يمكن أن يؤدي إلى تفكك الاغاروز تشريح، والتي قد تؤدي إلى خفض PCLS بشكل غير متساو خلال.
  6. تحميل حقنة العينة في تقطيع اللحم الآلي وملء خزان العازلة مع الجليد الباردة PBS. محاذاة خطوة محرك السيارات مع حقنة العينة وإزالة قطعة من الشريط من الجزء السفلي. بدوره التحول إلى موقف سريع إلى الأمام (FF) حتى محرك السيارات الخطوة مجرد تلامس الجزء الخلفي من المكبس.
  7. محاذاة شفرة جديدة مع حقنة العينة. مجموعة سمك الأنسجة، المستمر / شريحة واحدة، التذبذب والسرعة في تقطيع اللحم. على سبيل المثال، سمك الأنسجة: 150 ميكرون، القطع المستمر (تابع)، التذبذب: 9، وسرعة: 3 - بداية 4. برس. يجب أن يتم تعديلها للمواصفات تقطيع الآلية المحددة الإعدادات أعلاه.
  8. باستخدام ملعقة رقيقة أو الفرشاة، وجمع PCLS في وقت واحد حيث أنها تقع في خزان العازلة ووضعها في لوحة 24-جيدا تحتوي على الجليد الباردة PBS.
    ملاحظة: من المهم للحفاظ على شرائح من أجل الحفاظ على التناسق بين التجارب. على الرغم من كل الرئة تختلف حسب العمر والجنس والوزن، وشريحة ال 10، على سبيل المثال، عادة ينتج الحجم بالمثل الهوائية.
ove_title "> 3. الضد تلطيخ

  1. تصميم لوحة من الأجسام المضادة الموسومة fluorescently استنادا إلى نوع من الخلايا في المصالح، مع الأخذ بعين الاعتبار احتمال التداخل الطيفي الفلورسنت وقدرات الكشف المجهر.
    ملاحظة: وكمثال على ذلك، لجنة للكشف فرعية DC هي على النحو التالي: CD11c و/ ألفا X إنتغرين - BrilliantViolet (BV) 605 (الإثارة: 405 نانومتر، ذروة الانبعاثات: 605 نانومتر)، CD324 / E-كادهيرين - اليكسا 488 (AF488 ) (الإثارة: 488 نانومتر، والانبعاثات الذروة: 519 نانومتر)، CD88 / C5Ra1 - فيكوإيريترين (PE) (الإثارة: 561 نانومتر، والانبعاثات الذروة: 578 نانومتر)، CD103 / ألفا E إنتغرين - Allophycocyanin (APC) (الإثارة: 633 نانومتر ، والانبعاثات الذروة: 660 نانومتر). مضان أدوات المشاهد الطيفية (انظر قائمة المواد) هي مفيدة لتصميم اللوحات.
  2. تقديم كوكتيل الأجسام المضادة التي تحتوي على الأجسام المضادة المطلوبة.
    1. للتصوير PCLS ثابت، إضافة 800 ميكرولتر عازلة تلطيخ، و 100 ميكرولتر فك بلوكر، 50 ميكرولتر مصل الفأر العادي، و 50 ميكرولتر العادي الفئران المصل إلى 1.5 مل microcentrifuأنبوب gation لإجمالي حجم 1 مل. لتصوير الخلايا الحية، استخدم 800 ميكرولتر المتوسطة يبوفيتش (1X) تحتوي على 10٪ FBS (يبوفيتش 10) بدلا من العازلة تلطيخ.
    2. إضافة أجسام مضادة لضبط التركيز النهائي المطلوب من كل الأجسام المضادة. نقل الحل الضد إلى طبق 3 سم، ونضع في الظلام حتى جاهزة للاستخدام.
      ملاحظة: تركيزات النهائي في حاجة إلى أن يكون الأمثل لكل الأجسام المضادة الفردية (عادة 1-5 ميكروغرام / مل).
  3. اختيار PCLS بمساحة التشريحية للاهتمام، مثل الخطوط الجوية الكبيرة أو محيط الرئة، ووضع في طبق 3 سم، ويحتوي على 1 مل من محلول الأجسام المضادة.
  4. PCLS وصمة عار في الظلام، على الجليد، هزاز ببطء لمدة 30 أو 60 دقيقة.
  5. للتصوير PCLS ثابت، انتقل إلى القسم 4. لتصوير الخلايا الحية، انتقل إلى القسم 5.

4. ساكنة التصوير من PCLS

  1. بعد 60 دقيقة حضانة PCLS مع الأجسام المضادة، وإزالة حل الأجسام المضادة من الطبق وشطف ركان شرائح مرتين مع 1 مل الجليد PBS الباردة.
  2. ماصة 50 ميكرولتر PBS على 3 سم جولة طبق من الزجاج السفلي. باستخدام ملعقة أو الفرشاة، ونقل PCLS الملون إلى الانخفاض، والتلاعب بلطف شريحة حتى أنها مسطحة، وانتشرت. إزالة برنامج تلفزيوني مع ماصة. شريحة يجب الاستلقاء قدر الإمكان. تحتاج إلى أن يؤديها بسرعة لتجنب photobleaching من الإجراءات المذكورة أعلاه.
  3. وضع 1 قطرة من درجة حرارة الغرفة المتوسطة المتزايدة على شريحة وإسقاط بلطف ساترة الزجاج في بئر من لوحة. الحفاظ PCLS في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى ساعة قبل التصوير.
  4. عند عرض تحت المجهر متحد البؤر، واستخدام الهدف 20X (انظر قائمة المواد). استخدام أداة "بلاط" لتحديد مكان وبمناسبة حواف النسيج في الإعداد "بدن محدب". هذا وسوف تساعد على تقليل وقت الفحص البلاط.
  5. أثناء إعداد مجموعة ض المكدس، تحقق في مجالات متعددة من شريحة، وخصوصا على طول الحواف، أن نطاقات مجموعةهي مناسبة.
    ملاحظة: إن المدى ض المرجح أن تحتاج إلى أن تكون أكبر من سمك الأنسجة نفسها لأنه من الصعب جدا الحصول على الأنسجة لوضع مسطح تماما. على سبيل المثال، مع PCLS سميكة 150 ميكرون، وسوف تحتاج مجموعة ض المكدس المرجح أن يتم تعيين إلى 200-250 ميكرون لاستيعاب المطبات والمنحنيات في شريحة. اعتمادا على مجموعة ض المكدس وحجم الأنسجة، وكل فحص الرئة الكامل يستغرق ما بين 7-12 ساعة مع هدف 20X. كل الرئة هي فريدة من نوعها ويجب تعديلها إعدادات كل تجربة.

5. يعيش التصوير خلية من PCLS

  1. بعد 30 دقيقة حضانة PCLS مع الأجسام المضادة، وإزالة حل الأجسام المضادة من الطبق وشطف شرائح مرتين مع 1 مل الباردة يبوفيتش 10.
  2. ماصة الطازجة 50 ميكرولتر يبوفيتش 10 إلى فتحة واحدة من ساترة غرف (8 فتحات). استخدام ملعقة لنقل PCLS إلى المتوسطة، والتلاعب برفق حتى شريحة مسطحة، وانتشرت. الإجراءات المذكورة أعلاهتحتاج إلى أن يؤديها بسرعة لتجنب photobleaching من.
  3. إزالة المتوسطة 50 ميكرولتر باستخدام ماصة. شريحة وأن الاستلقاء قدر الإمكان.
    ملاحظة: فمن المقبول إذا انقلبت حواف شريحة عموديا على جدار الغرفة. وعلاوة على ذلك، إن وجدت، على وزن البلاتين معدن يمكن أن تستخدم لترسيخ شريحة قبل الانتقال إلى الخطوة التالية. انظر قائمة المواد المرفقة لمثال واحد من سلك البلاتين التي يمكن قص وعازمة في الأوزان الصغيرة.
  4. في 4 ° C الغرفة الباردة، مزيج 100 ميكرولتر من النمو انخفاض عامل، الفينول مجانا الحمراء المصفوفة خارج الخلية مع 100 ميكرولتر يبوفيتش 10. استخدام نصائح ماصة precooled لهذا، أو أن المصفوفة خارج الخلية يصلب في الطرف.
    ملاحظة: هذه النسبة من المصفوفة والمتوسطة (1: 1) بإنشاء هلام كثيفة بما فيه الكفاية لعقد PCLS أسفل في ظروف الأنسجة الثقافة.
  5. ماصة بلطف مصفوفة لخلط، وماصة بعناية على رأس PCLS، والتأكد من أن الجل يذهب على رأس لونانوغرام شريحة، وأن شريحة لا تطفو على أعلى من هلام. هلام يجب أن تعمل بمثابة الوزن، وترسيخ PCLS أسفل على الجزء السفلي من لوحة.
  6. نقل بعناية ساترة غرف ل37 ° C حاضنة والسماح للمصفوفة ترسيخ ب ~ 5 دقائق.
  7. نقل ساترة تشامبيريد كامل على مرحلة ما قبل تحسنت المجهر متحد البؤر. الحفاظ على غرفة في 37 ° C طوال التصوير. ليس مطلوبا CO 2 العرض خلال حضانة الخلية عند استخدام المتوسطة يبوفيتش.
  8. تعيين نطاق مجموعة ض المكدس والبلاط واستنادا إلى الفاصل الزمني المطلوب بين الإطارات. عند عرض تحت المجهر متحد البؤر، واستخدام الهدف 20X (انظر قائمة المواد). استخدام أداة "البلاط" للدلالة على المنطقة من الاهتمام في الأنسجة، وذلك باستخدام "شبكة محورها" إعداد (على سبيل المثال، وهو 2X2 تركز الشبكة).
  9. أثناء إعداد مجموعة ض المكدس، تحقق في مجالات متعددة من شريحة التي يتراوح مجموعة مناسبة.
    ملاحظة: ZRوانجى على الأرجح يساوي سمك الأنسجة. كل الرئة هي فريدة من نوعها ويجب تعديلها إعدادات كل تجربة. والبلاط 2X2 و 10 مداخن ض ينتج بصفة عامة ~ 1 إطار / 2 دقيقة. تأكد من تشغيل وظيفة التركيز التلقائي قبل بدء التجربة للحد س ص و z العائمة خلال فترة التصوير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لتحديد الموقع من مجموعتين فرعيتين DC، CD11b جان تنمية المجتمعات المحلية مرحبا وCD103 + جان تنمية المجتمعات المحلية، PCLS من C57BL / 6 الفئران قطعت وملطخة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة (MABS) محددة لCD11c و، CD88، CD103، وCD324 (E-كادهيرين). يتم عرض الأجسام المضادة للخلايا الظهارية CD324 صمة عار مجرى الهواء، وCD88 على الضامة والعدلات، ولكن ليس جان تنمية المجتمعات المحلية 8. وهذا ما سمح لنا أن نميز جان تن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وقد تم تطوير هذا البروتوكول هو موضح هنا أصلا لتصور مواقع اثنين من مجموعات فرعية من جان تنمية المجتمعات المحلية داخل الرئة. ومع ذلك، هذا البروتوكول يمكن تكييفه بسهولة لدراسة العديد من أنواع مختلفة من الخلايا، مع الحفاظ على سلامة الخلية والهندسة المعمارية ثلاثية الأبعاد في الرئة. الميزة الأخيرة هي ميزة هامة على أنظمة زراعة الخلايا ويسهل التعرف على أنواع الخلايا نادرة. ويعتمد هذا الأسلوب على توليد PCLS من الرئة، وتوليفة مناسبة من الأجسام المضادة للتعرف على أنواع معينة من الخلايا وتقل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح إلى إعلان.

شكر وتقدير

نشكر جيف تاكر، إريكا سكابيني، وأغنس جانوشازي لمساعدتهم مع المجهر، ليغون بيرو لإدارة لها من مستعمرة الماوس، وجون تشن ومايكل ساندرسون للمساعدة في تقطيع اللحم والأنسجة، ومايكل فيسلر وديريك كين لقراءة نقدية لل المخطوطة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل فرع جماعية من معهد علوم الصحة البيئية، NIH (ضياء ES102025-09)، والذي بدوره برعاية وزارة الصحة والخدمات الإنسانية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
C57BL / 6J الفئرانجاكسون مختبر000664
Prox1-TdTomato الفئران المعدلة وراثيا  مختبر جاكسون018128B6 ؛ 129S-Tg (Prox1-tdTomato) 12Nrud / J
OT-II OVA الخاص ب TCR x Nur77-GFP الفئران المعدلة وراثيامختبر جاكسون004194 ، 016617B6. Cg-Tg(TcraTcrb)425Cbn/J x C57BL / 6-Tg(Nr4a1-EGFP/cre)820Khog/J 
جاكسون للفئران بالضربة القاضية Rag1002216B6.129S7-Rag1tm1Mom< / sup> / J
Ovalbumin و Low Endo و PurifiedWorthington Biochemical CorporationLS003059
عديدات السكاريد الدهنية من شركة Escherichia coliSigma-Aldrich Co.L2630-25MG
أنابيب البولي إيثيلين (غير معقمة) 100 قدمBD أنظمة التشخيص4274210.86 مم القطر الداخلي ، 1.27 مم القطر
الخارجي GeneMate Sieve GQA Low Melt AgaroseBioExpressE-3112-125محلول 2٪ مذاب في PBS عند 70 درجة ؛ C وعقد عند 40 درجة مئوية.
Compresstome VF-300Precisionary Instruments، Inc.VF-300
مزدوجة الحواف غير القابل للصدأ شفرة الحلاقةعلوم المجهر الإلكتروني72000يمكن التخلص منها ؛ 250 / صندوق. يجب تغيير الشفرة لكل رئة.
Krazy Glue لجميع الأغراض جل فوريVWR500033-484متوفر بشكل شائع مقابل 3 دولارات / أنبوب في الصيدليات المحلية   ؛
Leibovitz's L-15 Medium ، بدون فينول أحمرThermoFisher Scientific21083027
مصل الفئران العادي (NRS) JacksonImmunoResearch Inc.012-000-120
مصل الفأر العادي (NMS) شركةJackson ImmunoResearch Inc.015-000-120
مصل الأبقار الجنيني (FBS)HycloneSH30071.03HI
Staining Bufferمصنوع في المنزلN / APBS مع 0.5٪ ألبومين مصل بقري ، 0.1٪ NaN3< / sub> ، درجة الحموضة 7.4
Fc Blocker (الأجسام المضادة المضادة ل CD16 / 32)Made in HouseN / Aالطافي لخط خلايا الورم الهجين المزروع 2.4G2
مضاد للفأر CD11b eFluor 450eBioscience48-0112-80مضاد للفأر CD11b eFluor 450 (استنساخ: M1 / 70) 
مضاد للفأر CD11c Brilliant Violet 605BioLegend101237Brilliant Violet 605 مضاد للفأر CD11c (استنساخ: M1 / 70)
مضاد للفأر CD11c PhycoerythrineBioscience12-0114-82PE مترافق مضاد للفأر CD11c CD11c (استنساخ: N418)
مضاد للفأر CD11c AllophycocyaninBD Phamingen550261للفأر CD11c 9 استنساخ: HL3)
مضاد للفأر CD88 PhycoerythrinBioLegend135806PE مضاد للفأر CD88 (استنساخ: 20/70)
مضاد للفأر CD103 AllophycocyanineBioscience17-1031-82مكافحة الفأر CD103 APC (استنساخ: 2E7)
مضاد للفأر CD90.2 / Thy1.2 eF450eBioscience48-0902-82مضاد للفأر CD90.2 eFluor 450 (استنساخ: 53-2.1) مضاد
للفأر CD172a / Sirp1a AllophycocyanineBioscience17-1721-82مضاد للفأر CD172a APC (استنساخ: P84)
مضاد للفأر CD324 Brilliant Violet 421BD Horizon564188BV421 ماوس مضاد للإي كاديرين (استنساخ: 5E8 المعروف أيضا باسم 5E8-G9-B4)
مضاد للفأر CD324 Alexa Fluor 488eBioscience53-3249-82Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 488 (استنساخ: DECMA-1) مضاد
للفأر CD324 Alexa Fluor 647eBioscience51-3249-82Anti-CD324 (E-Cadherin) Alexa Flour 647 (استنساخ: DECMA-1)
أطباق ميكروويل ذات قاع زجاجي 35 مم طبق بتري ، 14 مم ميكروويل ، رقم 1.5 غطاء زجاجيMatTek CorperationP35G-1.5-14-C
Nunc Lab-Tek غطاء زجاجيThermoFisher Scientific155411PK   ؛عبوة من 16
غطاء 15 مم ، رقم 1.5 سماكة الزجاجMatTek CorperationPCS-1.5-15
سلك البلاتين العاريWorld PrecisionInstruments PTP2010.020 بوصة (0.5 مم) قطر مقطعة إلى قطع بطول ~ 1 سم ومثنية على شكل "L"
إطالة الذهب المضاد للتلاشيThermoFisher ScientificP36934يحافظ على 4 درجات ؛ C ، دافئ إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
مصفوفة غشاء أساسي لعامل النمو Matrigel (GFR) ، خالية من الفينول الأحمر ، * خالية من LDEVCorning356231
Zeiss 880 مجهر المسح الضوئي بالليزر متعدد الفوتونCarl ZeissBlack إصدار برنامج 8.1 ، 2012 (Zeiss)
Plan-Apochromat 20X / 0.8 M27 يقرضكارل زايس420650-9901-000
مختبر مضاد قطعة Zen

المراجع

  1. Schneider, T., van Velzen, D., Moqbel, R., Issekutz, A. C. Kinetics and quantitation of eosinophil and neutrophil recruitment to allergic lung inflammation in a brown Norway rat model. Am J Respir Cell Mol Biol. 17 (6), 702-712 (1997).
  2. Vermaelen, K. Y., Carro-Muino, I., Lambrecht, B. N., Pauwels, R. A. Specific migratory dendritic cells rapidly transport antigen from the airways to the thoracic lymph nodes. J Exp Med. 193 (1), 51-60 (2001).
  3. Sung, S. S., et al. A major lung CD103 (alphaE)-beta7 integrin-positive epithelial dendritic cell population expressing Langerin and tight junction proteins. J Immunol. 176 (4), 2161-2172 (2006).
  4. Steinman, R. M. Lasker Basic Medical Research Award. Dendritic cells: versatile controllers of the immune system. Nat Med. 13 (10), 1155-1159 (2007).
  5. Jakubzick, C., et al. Lymph-migrating, tissue-derived dendritic cells are minor constituents within steady-state lymph nodes. J Exp Med. 205 (12), 2839-2850 (2008).
  6. Julia, V., et al. A restricted subset of dendritic cells captures airborne antigens and remains able to activate specific T cells long after antigen exposure. Immunity. 16 (2), 271-283 (2002).
  7. Nakano, H., et al. Migratory properties of pulmonary dendritic cells are determined by their developmental lineage. Mucosal Immunol. 6 (4), 678-691 (2013).
  8. Nakano, H., et al. Complement receptor C5aR1/CD88 and dipeptidyl peptidase-4/CD26 define distinct hematopoietic lineages of dendritic cells. J Immunol. 194 (8), 3808-3819 (2015).
  9. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulm Pharmacol Ther. 24 (5), 452-465 (2011).
  10. Liberati, T. A., Randle, M. R., Toth, L. A. In vitro lung slices: a powerful approach for assessment of lung pathophysiology. Expert Rev Mol Diagn. 10 (4), 501-508 (2010).
  11. Parrish, A. R., Gandolfi, A. J., Brendel, K. Precision-cut tissue slices: applications in pharmacology and toxicology. Life Sci. 57 (21), 1887-1901 (1995).
  12. Bergner, A., Sanderson, M. J. ATP stimulates Ca2+ oscillations and contraction in airway smooth muscle cells of mouse lung slices. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283 (6), L1271-L1279 (2002).
  13. Martin, C., Uhlig, S., Ullrich, V. Videomicroscopy of methacholine-induced contraction of individual airways in precision-cut lung slices. Eur Respir J. 9 (12), 2479-2487 (1996).
  14. Henjakovic, M., et al. Ex vivo testing of immune responses in precision-cut lung slices. Toxicol Appl Pharmacol. 231 (1), 68-76 (2008).
  15. Henjakovic, M., et al. Ex vivo lung function measurements in precision-cut lung slices (PCLS) from chemical allergen-sensitized mice represent a suitable alternative to in vivo studies. Toxicol Sci. 106 (2), 444-453 (2008).
  16. Paddenberg, R., et al. Hypoxic vasoconstriction of partial muscular intra-acinar pulmonary arteries in murine precision cut lung slices. Respir Res. 7, 93(2006).
  17. Wilson, R. H., et al. Allergic sensitization through the airway primes Th17-dependent neutrophilia and airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 180 (8), 720-730 (2009).
  18. Schlitzer, A., et al. Identification of cDC1- and cDC2-committed DC progenitors reveals early lineage priming at the common DC progenitor stage in the bone marrow. Nat Immunol. 16 (7), 718-728 (2015).
  19. Baluk, P., et al. Preferential lymphatic growth in bronchus-associated lymphoid tissue in sustained lung inflammation. Am J Pathol. 184 (5), 1577-1592 (2014).
  20. Jurisic, G., Iolyeva, M., Proulx, S. T., Halin, C., Detmar, M. Thymus cell antigen 1 (Thy1, CD90) is expressed by lymphatic vessels and mediates cell adhesion to lymphatic endothelium. Exp Cell Res. 316 (17), 2982-2992 (2010).
  21. Truman, L. A., et al. ProxTom lymphatic vessel reporter mice reveal Prox1 expression in the adrenal medulla, megakaryocytes, and platelets. Am J Pathol. 180 (4), 1715-1725 (2012).
  22. Wigle, J. T., Oliver, G. Prox1 function is required for the development of the murine lymphatic system. Cell. 98 (6), 769-778 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الرئة ماوس شرائح لتصور لايف الخلايا الجذعية الرئوي قطع الدقة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.