باستخدام مستقبلات الموسومة pHluorin لمراقبة التحت خلوية التعريب والاتجار

Ashley M. Fox-Loe; Brandon J. Henderson; Christopher I. Richards

doi:10.3791/55466

يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

باستخدام مستقبلات الموسومة pHluorin لمراقبة التحت خلوية التعريب والاتجار

8.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55466

⸱

مارس 16, 2017

Ashley M. Fox-Loe¹ , Brandon J. Henderson² , Christopher I. Richards¹

¹Department of Chemistry, University of Kentucky, ²Department of Biomedical Sciences, Marshall University

في هذه المقالة

ملخص

وسم المجال خارج الخلية من بروتين الغشاء مع fluorophore حساسة درجة الحموضة، superecliptic pHluorin (سبتمبر)، ويتيح توطين التحت خلوية، والتعبير، والاتجار يحدد لاحقا. البروتينات التصوير سبتمبر وصفت مع الانعكاس الكلي الداخلي مضان المجهر (TIRFM) تمكن الكمي لمستويات البروتين في الطرفية ER والبلازما الغشاء.

الملخص

فهم غشاء الاتجار البروتين، والتجمع، والتعبير يتطلب المنهج الذي يفرق بين المقيمين في العضيات داخل الخلايا وتلك المترجمة على غشاء البلازما. القياسات التقليدية القائمة على مضان تفتقر إلى القدرة على تمييز البروتينات غشاء المقيمين في العضيات المختلفة. قطع منهجيات حافة تتجاوز الطرق التقليدية التي اقتران fluorophores الحساسة درجة الحموضة مع مجموع المجهر التأمل الداخلي مضان (TIRFM). TIRF الإضاءة يثير عينة تصل إلى ما يقرب من 150 نانومتر من واجهة الزجاج العينة، مما يخفض الخلفية، مما يزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء، وتعزيز القرار. حجم الإثارة في TIRFM يشمل غشاء البلازما والعضيات المجاورة مثل ER الطرفية. Superecliptic pHluorin (سبتمبر) هو نسخة حساس درجة الحموضة من GFP. وراثيا ترميز سبتمبر في المجال خارج الخلية من البروتين غشاء من الفائدة المواقف وfluorophore علىالجانب اللمعية من لائحة وفي المنطقة خارج الخلية للخلية. سبتمبر هو فلوري عند الرقم الهيدروجيني أكبر من 6، لكنها لا تزال في حالة الخروج على قيم الرقم الهيدروجيني أقل. لذلك، مستقبلات ذات الكلمات الدلالية مع سبتمبر يتألق عند إقامتهم في الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا) أو على الإدراج في غشاء البلازما (بعد الظهر)، ولكن ليس عندما يقتصر على الحويصلة الاتجار أو غيرها من العضيات مثل جولجي. الرقم الهيدروجيني خارج الخلية يمكن تعديلها لإملاء مضان من المستقبلات على غشاء البلازما. الفرق في مضان بين الصور TIRF في الرقم الهيدروجيني خارج الخلية محايدة والحمضية لنفس الخلية يتطابق مع العدد النسبي للالمستقبلات على غشاء البلازما. هذا يسمح للقياس في وقت واحد من مستقبلات المقيمين داخل الخلايا وغشاء البلازما. كما يمكن قياس الأحداث حويصلة واحدة الإدراج عند الرقم الهيدروجيني خارج الخلية محايدة، الموافق منخفضة حويصلة الاتجار درجة الحموضة الصمامات مع غشاء البلازما والانتقال إلى دولة الفلورسنت. هذا versatilيمكن استغلالها تقنية ه لدراسة الترجمة، والتعبير، والاتجار بها بروتينات الغشاء.

المقدمة

وقد تم ربط التغيرات في التعبير مستقبلات والتوزيع والتجميع لمجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك مرض الزهايمر ومرض باركنسون، والتليف الكيسي، وإدمان المخدرات ^{^1،} ^{^2،} ^{^3،} ^{^4،} ^5. على سبيل المثال، النيكوتين وغيرها بروابط النيكوتين يؤثر على الاتجار مستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية (nAChRs) مما يؤدي إلى تغيرات في الاتجار والتعبير، وupregulation ^{^1،} ^{^2،} ^{^5،}