يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

باستخدام مستقبلات الموسومة pHluorin لمراقبة التحت خلوية التعريب والاتجار

8.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55466

⸱

مارس 16, 2017

 ,  , 
1Department of Chemistry, University of Kentucky, 2Department of Biomedical Sciences, Marshall University

في هذه المقالة

ملخص

وسم المجال خارج الخلية من بروتين الغشاء مع fluorophore حساسة درجة الحموضة، superecliptic pHluorin (سبتمبر)، ويتيح توطين التحت خلوية، والتعبير، والاتجار يحدد لاحقا. البروتينات التصوير سبتمبر وصفت مع الانعكاس الكلي الداخلي مضان المجهر (TIRFM) تمكن الكمي لمستويات البروتين في الطرفية ER والبلازما الغشاء.

الملخص

فهم غشاء الاتجار البروتين، والتجمع، والتعبير يتطلب المنهج الذي يفرق بين المقيمين في العضيات داخل الخلايا وتلك المترجمة على غشاء البلازما. القياسات التقليدية القائمة على مضان تفتقر إلى القدرة على تمييز البروتينات غشاء المقيمين في العضيات المختلفة. قطع منهجيات حافة تتجاوز الطرق التقليدية التي اقتران fluorophores الحساسة درجة الحموضة مع مجموع المجهر التأمل الداخلي مضان (TIRFM). TIRF الإضاءة يثير عينة تصل إلى ما يقرب من 150 نانومتر من واجهة الزجاج العينة، مما يخفض الخلفية، مما يزيد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء، وتعزيز القرار. حجم الإثارة في TIRFM يشمل غشاء البلازما والعضيات المجاورة مثل ER الطرفية. Superecliptic pHluorin (سبتمبر) هو نسخة حساس درجة الحموضة من GFP. وراثيا ترميز سبتمبر في المجال خارج الخلية من البروتين غشاء من الفائدة المواقف وfluorophore علىالجانب اللمعية من لائحة وفي المنطقة خارج الخلية للخلية. سبتمبر هو فلوري عند الرقم الهيدروجيني أكبر من 6، لكنها لا تزال في حالة الخروج على قيم الرقم الهيدروجيني أقل. لذلك، مستقبلات ذات الكلمات الدلالية مع سبتمبر يتألق عند إقامتهم في الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا) أو على الإدراج في غشاء البلازما (بعد الظهر)، ولكن ليس عندما يقتصر على الحويصلة الاتجار أو غيرها من العضيات مثل جولجي. الرقم الهيدروجيني خارج الخلية يمكن تعديلها لإملاء مضان من المستقبلات على غشاء البلازما. الفرق في مضان بين الصور TIRF في الرقم الهيدروجيني خارج الخلية محايدة والحمضية لنفس الخلية يتطابق مع العدد النسبي للالمستقبلات على غشاء البلازما. هذا يسمح للقياس في وقت واحد من مستقبلات المقيمين داخل الخلايا وغشاء البلازما. كما يمكن قياس الأحداث حويصلة واحدة الإدراج عند الرقم الهيدروجيني خارج الخلية محايدة، الموافق منخفضة حويصلة الاتجار درجة الحموضة الصمامات مع غشاء البلازما والانتقال إلى دولة الفلورسنت. هذا versatilيمكن استغلالها تقنية ه لدراسة الترجمة، والتعبير، والاتجار بها بروتينات الغشاء.

المقدمة

وقد تم ربط التغيرات في التعبير مستقبلات والتوزيع والتجميع لمجموعة واسعة من الأمراض، بما في ذلك مرض الزهايمر ومرض باركنسون، والتليف الكيسي، وإدمان المخدرات 1، 2، 3، 4، 5. على سبيل المثال، النيكوتين وغيرها بروابط النيكوتين يؤثر على الاتجار مستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية (nAChRs) مما يؤدي إلى تغيرات في الاتجار والتعبير، وupregulation 1، 2، 5، 6، 7، 8، 9، 10. النيكوتين يزيد من العدد الإجمالي للnAChRs تجميعها داخل الخلية، ويزيد الاتجار نحو غشاء البلازما، وهود يغير تجميع مفارز لصالح نسخة حساسية عالية لبعض أنواع فرعية. حل تغييرات واضحة في الاتجار، والتجمع، والتعبير عن مستقبلات في نموذج مرض توفر تفاصيل الآلية الحاسمة التي لا غنى عنها لتحديد أهداف المخدرات. شأن هذا النهج المثالي تفرق بسرعة بين مستقبلات الخلايا وتلك المترجمة على غشاء البلازما. هذا هو تحديا من نوع خاص في الحالات التي يكون فيها أغلبية من بروتين معين يتواجد داخل الخلية، كما هو الحال مع nAChRs. منذ يتم ترجمة معظم nAChRs إلى الشبكة الإندوبلازمية، والقياسات التقليدية تفتقر إلى الدقة المكانية والزمانية اللازمة لتحديد التغيرات التعريب والاتجار على طول مسار إفرازية. وقد أجريت في المقام الأول الاتجار مستقبلات والتعبير دراسات nAChRs باستخدام جين مشع ملزم 11، المقايسات biotinylation 12، الغربي النشاف 13، أو مناعي techniq UES 12. هذه تعتمد على خصوصية ربط جزيء مراسل أو تثبيت الخلايا وتفتقر إلى القدرة على التمييز بين وقت واحد مقيم غشاء البلازما ومستقبلات الخلايا. لذلك، اعتمدت الدراسات التجمع القناة الايونية والحويصلة ديناميات إلى حد كبير على الإنتاجية المنخفضة تقنيات الكهربية 14.

التحليل المكاني والزماني متفوقة ممكن مع التقدم في المجهر مضان. المشفرة وراثيا جزيئات المراسل، مثل البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ومشتقاته، والقضاء على القضايا ملزمة غير محددة وزيادة حساسية 15. والبديل حساسة درجة الحموضة من GFP، والمعروفة باسم pHluorin superecliptic (سبتمبر)، ويمكن استخدامها لاستغلال الخلافات الرقم الهيدروجيني المتأصلة بين المقصورات داخل الخلية لتحديد توطين 5، 7، 8،المرجع "> 9، 16، 17، 18. تتفلور سبتمبر عندما كان الرقم الهيدروجيني أعلى من 6، لكنها لا تزال في حالة إيقاف في انخفاض الرقم الهيدروجيني. لذلك، تم الكشف عن مستقبلات ذات الكلمات الدلالية مع سبتمبر من جانبهم اللمعية عندما الحالي في الشبكة الإندوبلازمية ( ER) أو على الإدراج في غشاء البلازما (بعد الظهر)، ولكن ليس عندما يقتصر على الحويصلة الاتجار. التلاعب في الرقم الهيدروجيني خارج الخلية على اتصال مع المستقبلات على غشاء البلازما وبالتالي يغير مضان، وبالتالي الكشف عن هذه المستقبلات. إذا كان نفس الخلية والتقط بالتتابع في كل من الرقم الهيدروجيني خارج الخلية محايدة ومن ثم الرقم الهيدروجيني أقل من 6، ويعزى الفرق بين الصور إلى المستقبلات الموجودة على غشاء البلازما. هذا يسمح للقياس في وقت واحد من بين الخلايا (ER الطرفية) ومستقبلات البلازما غشاء مقيم 5، 7، 8 و 9. ويمكن أيضا أن تحل الأحداث حويصلة واحدة الإدراج عند الرقم الهيدروجيني خارج الخلية محايدة. مرة واحدة الصمامات منخفضة حويصلة الاتجار درجة الحموضة مع غشاء البلازما، يتعرض الجانب اللمعية من الحويصلة إلى حل خارج الخلية محايد، مما تسبب في انتقال الكشف عن موجة من مضان 7، 18، 19، 20. سبتمبر تمكن من قياس مستقبلات مترجمة إلى غشاء البلازما والشبكة الإندوبلازمية الطرفية، ويوفر وسيلة لقياس الاتجار من المستقبلات بين هذه المناطق التحت خلوية 5 و 7 و 18.

لتحقيق دقة أعلى في الغشاء البلازمي، وتصوير مستقبلات مع سبتمبر المشفرة وراثيا على مجموع المجهر التأمل الداخلي تنوير (TIRFM). هذه الطريقة بشكل خاصمفيدة إذا يتم ترجمة معظم المستقبلات المناطق داخل الخلايا، منذ TIRFM يزيد من وضوح غشاء البلازما. كما يتيح TIRFM القرار ديناميات الاتجار الحويصلات واحدة تحمل مستقبلات المسمى سبتمبر عليها الإدراج في PM. يحدث الانعكاس الكلي الداخلي في واجهة المواد مع مؤشرات الانكسار مختلفة، مثل بين خلية وغطاء زجاجي الانزلاق 21، 22. تتفلور سبتمبر عندما المشع مع 488 نانومتر الإثارة، الموجه لتحقيق الانعكاس الكلي الداخلي في واجهة من الحل الزجاج والخلية. وهذا ينتج موجة زائل التي تخترق ما يقرب من 150 نانومتر في العينة، فقط fluorophores مثيرة داخل هذا المجلد. تم الكشف فقط سبتمبر تحتوي على مستقبلات في بيئة درجة الحموضة محايدة ضمن هذا النطاق من الإثارة، مماثلة لتلك الموجودة على الغشاء البلازمي أو الشبكة الإندوبلازمية الطرفية. منذ الكشف محدودة ريتم تخفيض س الإثارة من موجة زائل، مضان الخلفية من منطقة داخل الخلايا وإشارة إلى نسبة الضوضاء يتم زيادة 21 و 22. وبالإضافة إلى ذلك، منذ الإشعاع لا تخترق الجزء الأكبر من الخلايا، والتقليل photodamage الذي يتيح تصوير الخلايا الحية على مدار الساعة. ونتيجة لذلك، TIRFM مقرونا المشفرة وراثيا يوفر سبتمبر عالية الدقة والحساسية اللازمة لقياس التحت خلوية التعريب والاتجار ديناميات مستقبلات غشاء على طول مسار إفرازية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. خلية الثقافة وترنسفكأيشن

  1. الحفاظ على الماوس العصبية 2A (N2a) الخلايا في وسائل الاعلام النمو.
    1. جعل 500 مل وسائط النمو N2a من 200 مل المتوسطة النسر Dulbecco و(DMEM) مع ارتفاع نسبة الجلوكوز، 250 مل قللت وسائل الاعلام المصل 50 مل الجنين المصل البقري (FBS)، و 5 مل البنسلين / الستربتومايسين (100X).
    2. الحفاظ على الخلايا في قارورة T75 عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    3. تقسيم الخلايا 1:15 عند الضرورة، أو في ما يقرب من 80-90٪ confluency. هذا هو عادة 2-3 مرات في الأسبوع.
  2. معطف 35 ملم الزجاج طبق أسفل مع بولي-D-ليسين.
    1. في مجلس الوزراء تدفق الصفحي السلامة الأحيائية، إضافة 200 ميكرولتر من 0.1 ميكروغرام / مل بولي-D-يسين على الزجاج المنطقة السفلى من العقيمة طبق 35 ملم.
    2. وضع الطبق في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    3. بعناية شطف الطبق مع ده 2 O 3-4 مرات.
    4. السماح للأطباق لتجف تماما لأكثر من 1 ساعة.
    5. STERILإيزي الأطباق باستخدام الأشعة فوق البنفسجية في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية إذا لزم الأمر.
  3. لوحة الخلايا N2a للتصوير TIRFM.
    1. إزالة وسائط النمو من الخلايا الملتصقة.
    2. فصل الخلايا من القارورة التي يحتضنها مع 1 مل 1X التربسين (+ EDTA) لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة.
    3. تعطيل التربسين بإضافة 9 مل وسائط النمو. مزيج سائل الإعلام، والتربسين، وخلايا منفصلة باستخدام ماصة.
    4. بصريا عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات وحساب حجم الصحيح لإضافة 90000 خلايا لكل الزجاج المطلي طبق السفلي بولي-D-يسين. مطلوب هذه الكثافة لترنسفكأيشن كفاءة واحد التصوير الخلية TIRF.
    5. إضافة 2 مل وسائط النمو إلى كل طبق زجاج القاع التي تحتوي على 90،000 الخلايا.
    6. احتضان الطبق عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 حاضنة لل16-24 ساعة.
  4. N2a ترنسفكأيشن
    1. الحصول على بناء البلازميد التي تحتوي على fluorophore سبتمبر أدرجتفي منطقة خارج الخلية من البروتين من الفائدة. تقنيات الاستنساخ القياسية مثل PCR التضخيم 5 يمكن استخدامها لتوليد بناء.
      ينبغي أن تدرج سبتمبر في منطقة خارج الخلية من البروتين غشاء بحيث تتواجد داخل تجويف اندوبلازمية شبكية أو الاتجار الحويصلات ويتعرض لحل خارج الخلية عندما على غشاء البلازما: ملاحظة. سبتمبر مشابه في الحجم إلى GFP واستراتيجيات الاستنساخ مماثلة يمكن استخدامها.
    2. استبدال وسائط النمو على الخلايا مطلي مع 1.5 مل سائل الاعلام المصل انخفاض (على سبيل المثال، غروب MEM)، ما يقرب من 30 دقيقة قبل إضافة كاشف ترنسفكأيشن.
      ملاحظة: لدراسة التغيرات المخدرات التي يسببها في المستقبلات، ويمكن أن يضاف إلى التركيز المناسب من المخدرات في وقت ترنسفكأيشن.
    3. إضافة 500 نانوغرام لكل البلازميد المطلوب بناء على 250 ميكرولتر تقليص وسائل الاعلام المصل (أنبوب 1).
    4. إضافة 2 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن إلى أنبوب ج منفصلةontaining 250 ميكرولتر من تخفيض وسائل الاعلام المصل. احتضان أنبوب 2 في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ينبغي أن يكون الأمثل نسبة كاشف ترنسفكأيشن إلى البلازميد الحمض النووي للتعبير عن كل بروتين من الفائدة.
    5. الجمع بين أنابيب 1 و 2 لجعل محلول يحتوي على 500 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن ومزيج البلازميد. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 25 دقيقة.
    6. إضافة 500 مزيج ترنسفكأيشن ميكرولتر خلايا ما قبل مطلي لإجمالي حجم 2 مل لكل طبق.
    7. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 24 ساعة.
    8. بعد 24 ساعة، وإزالة مزيج ترنسفكأيشن وشطف الخلايا مع نمو وسائل الإعلام ثم إضافة 2 مل من وسائط النمو إلى كل طبق.
      ملاحظة: إذا تم إضافة المخدرات في وقت ترنسفكأيشن، يمكن أن تتجدد مرة أخرى في هذه الخطوة.
    9. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة لمدة 24 ساعة.
    10. خلايا صورة 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

2. يعيش التصوير خلية من إجمالي فيانعكاس ternal الإسفار المجهري (TIRFM)

  1. مجموعة التصوير حتى
    1. أداء التصوير مع مضان المجهر انشاء مقلوب مع مرحلة المسح كما هو مبين في الشكل 1. وهذا يتطلب المواءمة بين مصدر ليزر DPSS 488 نانومتر، السائر المحركات لضبط 488 نانومتر شعاع الموقف، والفتحة العددية عالية (1.49 NA) 60X أو 100X الهدف غمر النفط.
    2. تمرير شعاع الليزر من خلال إثارة المرشح المناسب (ممر الموجة 488/10 نانومتر). محاذاة شعاع الليزر الاستقطاب من خلال الألياف طريقة واحدة متصلة قاذفة محمولة ذات المحركات السائر. في وضع epifluorescence، يتركز شعاع الإثارة في منتصف الفتحة الخلفية للهدف.
    3. لتحقيق TIRF، استخدام السيارات السائر لترجمة تركيز شعاع الليزر عبر الفتحة الخلفية للعدسة الهدف حتى يتم الوصول إلى الزاوية الحرجة ولم يعد ينتقل شعاع من خلال عينة وبدلا من ذلك ينعكس تماما قبالة الزجاج سلل واجهة.
    4. التقاط الصور باستخدام EMCCD (512 × 512 بكسل) التي تسيطر عليها مع برامج التصوير (مثل Metamorph) مع مرشح الانبعاثات المناسبة التي تقام في مسار الانبعاثات (525/50 نانومتر).
  2. إعداد الحل التصوير
    1. إعداد 200 مل حل خارج الخلية (ECS) عن طريق خلط 150 مم كلوريد الصوديوم، 4 ملي بوكل، 2 مم MgCl 2، 2 مم CaCl 2 و 10 ملي HEPES و 10 ملي الجلوكوز في ده 2 الحلول O. المالية من كلوريد الصوديوم، بوكل، MgCl 2، وCaCl 2 يمكن أن تكون معدة مسبقا وجنبا إلى جنب مع HEPES الطازجة والسكر في يوم من التصوير.
    2. ضبط درجة الحموضة من محلول يحتوي على 100 مل ECS إلى 7.4 درجة الحموضة. ضبط 100 مل المتبقية من ECS إلى الرقم الهيدروجيني من 5.4. شطف الخلايا transfected مع 2 مل من ECS (7.4 درجة الحموضة).
    3. إضافة 2 مل من ECS (7.4 درجة الحموضة) إلى الخلايا transfected قبل التصوير.
  3. تصوير الخلايا الحية في TIRF
    1. تشغيل النظام بأكمله، منها:ز 488 الليزر نانومتر، وكاميرا، مرحلة الترجمة، وبرنامج التصوير. تركيز شعاع epifluorescence وضبط قوة إلى ما يقرب من 1 ميغاواط في الهدف 60X.
    2. تصب الزيت على الهدف ووضع طبق من الخلايا transfected على مرحلة الترجمة. تأمين طبق في مكانها باستخدام يتصاعد المرحلة لضمان عدم تحرك فيما يتعلق المرحلة حتى الخلايا يمكن تصوير عدة مرات.
    3. في وضع epifluorescence، والتركيز المجهر وتحديد الفلورسنت، وخلايا transfected. سيبقى خلايا ركزت عبر عدة طائرات التركيز. تحديد موقع واحد الخلايا المعزولة على المضي قدما في TIRF.
    4. في برنامج التصوير، وضبط الوقت التعرض إلى 200 مللي ثانية وتحسين كثافة مضان من خلال تحديد الربح EM.
    5. الانتقال شعاع الليزر إلى TIRF بترجمة شعاع عبر الهدف بطريقة متدرجة باستخدام محرك السائر. مع اقتراب الزاوية الحرجة، فإن شعاع واضح تترجم عبر حافة الطبق حتى يتقارب في الالنقطة (ه) من الانعكاس الكلي الداخلي على متن الطائرة العينة.
    6. تحقق من أن الخلايا هي في وضع TIRF عن طريق ضبط مقبض التركيز. في TIRF، طائرة واحدة فقط من الخلايا يمكن أن تركز (أي حوالي 150 نانومتر من واجهة الزجاج)، مما ينتج عنه صورة محددة للغاية مع ارتفاع القرار من غشاء البلازما.
  4. التصوير سبتمبر لتحديد توطين التحت خلوية
    1. تحديد موقع صحية، transfected، الخلايا واحد في الطائرة التصوير.
    2. الحصول على صورة مركزة من الخلايا في درجة الحموضة 7.4. وصفت سبتمبر المستقبلات على غشاء البلازما والشبكة الإندوبلازمية يجب أن تكون مرئية.
    3. منع بسرعة شعاع الليزر من الوصول إلى عينة لمنع photobleaching من.
    4. حفظ المواقف مرحلة المقابلة لكل خلية باستخدام المجهر برامج التصوير قادرة على تسجيل المواقع س ص متعددة.
    5. كرر الخطوات 2.4.1-2.4.4 لمدة 20-30 خلايا في طبق أثناء استخدام البرنامج لتسجيل موقف من كل خلية.
    6. بالعربيةثالثا يتم جمع كل الصور الخلية في درجة الحموضة 7.4، يدويا إزالة حل ECS درجة الحموضة 7.4 باستخدام ماصة. لا تلمس طبق لأن ذلك قد نقل مواقف مرحلة حفظها.
    7. بعناية إضافة 2 مل من درجة الحموضة 5.4 ECS إلى الطبق وانتظر 10 دقيقة. خلال هذا الوقت، حفظ الصور المكتسبة سابقا.
    8. تحت مجموعة مماثلة من الظروف المستخدمة في جمع الصور في الرقم الهيدروجيني 7.4، نقل مرحلة لكل موقف حفظها والحصول على صورة من نفس الخلية في درجة الحموضة 5.4. ينبغي أن ننظر خلايا أقل تحديدا لأن كل مضان الكشف هو مصدرها من الشبكة الإندوبلازمية تقتصر سبتمبر المسمى مستقبلات. حفظ الصور خلية الرقم الهيدروجيني 5.4.
  5. أحداث حويصلة الإدراج واحدة التصوير في الخلايا الحية
    1. استبدال وسائل الاعلام نمو الخلايا transfected مع 2 مل 7.4 درجة الحموضة ECS، أو مع L-15 وسائل الإعلام ليبوفيتش. درجة الحموضة وسائل الإعلام ليبوفيتش L-15 هي CO 2 مستقلة، مما يسمح التصوير لتأخذ مكان على مدى فترة طويلة من الزمن إذا لزم الأمر.
    2. PLACالبريد طبق من خلايا transfected على مسرح المجهر. تأمين والتركيز خلية واحدة في TIRF التالية الخطوة 2.3 أعلاه.
    3. إذا كانت مجهزة، تعيين ضبط تلقائي للصورة حتى لا ينجرف التركيز خلال الفترة من التصوير.
    4. تسجيل سلسلة من 1000 الإطارات، والتقاط الصور بشكل مستمر في معدل الإطار من 200 مللي ثانية. ورشقات نارية من مضان تكون واضحة خلال هذه الفترة، أي ما يعادل انخفاض الحويصلات الاتجار درجة الحموضة الصمامات مع غشاء البلازما، وفضح سبتمبر إلى الرقم الهيدروجيني خارج الخلية 7.4.
    5. حدد خلية واحدة أخرى وكرر الخطوة أعلاه. إعادة ضبط تلقائي للصورة إذا لزم الأمر.

تحليل 3. معالجة الصور والبيانات

  1. تحليل سبتمبر مضان لتحديد توطين التحت خلوية
    1. فتح الصور الخلية باستخدام برمجيات تحليل الصور مثل Metamorph أو يماغيج (http://imagej.nih.gov/ij/). طرح الخلفية من كل من 5.4 درجة الحموضة ودرجة الحموضة 7.4 الصور باستخدام الإعداد شعرة معاوية.
    2. استخدام عتبة تستند كثافة لقياس مضان من خلية واحدة. يدويا تحديد المنطقة ذات الاهتمام حول الخلية في درجة الحموضة 7.4 صورة.
    3. قياس مساحة الخلية، يعني شدة، وكثافة متكاملة باستخدام البرنامج المساعد في ImageJ أو باستخدام المدمج في وظيفة "القياس" تحت علامة التبويب تحليل.
    4. كرر الخطوات 3.1.1-3.1.3 لنفس الخلية في درجة الحموضة 5.4، وتعديل بعناية عتبة أساس كثافة والمنطقة ذات الاهتمام بنفس الطريقة.
    5. بعد الحصول على كثافة متكاملة للصور خلية في كل من 7.4 درجة الحموضة و 5.4، وحساب غشاء البلازما متكاملة كثافة عن طريق طرح قيمة الرقم الهيدروجيني 5.4 من 7.4 درجة الحموضة قيمة. الفرق يتوافق مع مستقبلات عدد النسبية على غشاء البلازما داخل المنطقة TIRF الإثارة.
    6. كإجراء والاتجار، وحساب النسبة المئوية النسبية من سبتمبر وصفت المستقبلات الموجودة على غشاء البلازما مقارنة المستقبلات المتبقية مرئية في excitati TIRFعلى وحدة التخزين من خلال تقسيم غشاء البلازما كثافة متكاملة من إجمالي الكثافة متكاملة في درجة الحموضة 7.4 مضروبة في 100.
  2. تحليل الأحداث الإدراج حويصلة واحدة
    1. فتح سلسلة من 1000 صور المشاجرة باستخدام برمجيات تحليل الصور. طرح الخلفية من جميع الأطر باستخدام الإعداد شعرة معاوية.
    2. ضبط توازن اللون للتسجيل لتحقيق أقصى قدر من المناطق الشديدة الموافق حويصلة الأحداث الإدراج. عد رشقات نارية من مضان تدوم لفترة أطول من 3 إطارات (> 600 ميللي ثانية) يدويا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

سبتمبر إدراجها في مستقبلات يسمح الكشف المباشر لتلك المستقبلات في الخلايا الحية. إلى جانب TIRFM، وهذا يسمح للتقييم مستويات التعبير النسبية على غشاء البلازما وتوزيع مستقبلات داخل المواقع التحت خلوية في منطقة TIRF الإثارة. ويمكن أيضا أن تحل الأحداث الاتجار حويصلة واحدة.

مستويات التعبير النسبية لمستقبلات المسمى سبتمبر على البلازما غشاء

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

حساسية درجة الحموضة من سبتمبر تمكن مستقبلات المقيمين على غشاء البلازما لتمييزها عن مستقبلات الخلايا في الشبكة الإندوبلازمية، ويمكن استخدامه لحل أحداث الإدراج من مستقبلات تحمل الحويصلات 5، 7، 8، 9، 18، 19، 20 . العديد من التقنيات بما في ذلك biotinylati...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى أصحاب البلاغ تضارب في المصالح للإعلان.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل المعهد الوطني لتعاطي المخدرات T32 DA 016176 ، والمعهد الوطني لتعاطي المخدرات DA 038817 ، والمعهد الوطني لتعاطي المخدرات DA 040047.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي >كاشف / مادة < / قوي >
قوارير ثقافة الخلية مع غطاء مرشح ، معقم ، Greiner Bio One ، 75 سم 2< / sup>VWR82050-856
أطباق بتري ذات قاع زجاجي مقاس 35 مم ، معقمةCell E & GGBD00002-200
Poly-D-lysinevwr215017510
Dulbecco Modified Eagle Medium &lrm ؛ (DMEM) ، ارتفاع نسبة الجلوكوزفيشر العلمية11-965-084   ؛
Opti-MEM I مصل منخفض متوسطجيبكو / فيشر سيانتيفيك31-985-088
مصل الأبقار الجنيني ، معتمد ، من أصل أمريكي ، قياسي (مفلتر معقم)   ؛Gibco / Fisher Scientific16-000-044
إنزيم TrypLE Express (1x) ، بدون فينول أحمرفيشر Scientific12604-021
محلول البنسلين والستربتومايسينVWR45000-652
Leibovitz's L-15 متوسط ، بدون فينول أحمرGibco / Fisher Scientific21083027اختياري
ليبوفيكتامينفيشر Scientific11668030امزج بلطف لا تقم بدوامة
كلوريد الصوديومفيشر ScientificBP358-1
كلوريد البوتاسيومفيشر ScientificP217-10
كلوريد المغنيسيومفيشر ScientificBP214-500
كلوريد الكالسيومفيشر ScientificC79-500
هيبسفيشر ScientificBP310-500
D-Glucoseفيشر ساينتفيكD16-1
زيت الغمر الموضوعي أوليمبوسنوع F
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
OlympusIX81
Camera AndoriXon Ultra 897
60X ، 1.49 هدف غمر الزيت NAأوليمبوسAPON 60XOTIRF
المرحلة الآليةالسابقةIXPROXY
مشغل بمحركات (محرك متدرج)ThorlabsZST213
MetaMorph (أو برنامج تصوير آخر)Metamorph
488 نانومتر ليزرMarket Tech
أليافأحادية الوضعمرايا ThorlabsSM450
ThorlabsBB1-E01
ثنائي اللون 488 نانومتر LPSemrockDi02-R488-25x36
مرشح ممر النطاق الترددي ، 488 نانومترSemrockLL01-488-12.5
مرشح ممر النطاق الترددي ، 525/50SemrockFF03-525 / 50-25
Microscope

المراجع

  1. Lester, H. A., et al. Nicotine is a selective pharmacological chaperone of acetylcholine receptor number and stoichiometry. Implications for drug discovery. AAPS J. 11 (1), 167-177 (2009).
  2. Henderson, B. J., Lester, H. A. Inside-out neuropharmacology of nicotinic drugs. Neuropharmacology. 96 (Pt B), 178-193 (2015).
  3. Banerjee, C., et al. Cellular expression of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor protein in the temporal cortex in Alzheimer's and Parkinson's disease--a stereological approach. Neurobiol Dis. 7 (6 Pt B), 666-672 (2000).
  4. Ikonomovic, M. D., Wecker, L., Abrahamson, E. E., et al. Cortical α7 nicotinic acetylcholine receptor and β-amyloid levels in early alzheimer disease. Arch Neurol. 66 (5), 646-651 (2009).
  5. Richards, C. I., et al. Trafficking of α4* Nicotinic Receptors Revealed by Superecliptic Phluorin. J Biol Chem. 286 (36), 31241-31249 (2011).
  6. Kuryatov, A., Luo, J., Cooper, J., Lindstrom, J. Nicotine acts as a pharmacological chaperone to up-regulate human a4b2 acetylcholine receptors. Mol Pharmacol. 68 (6), 1839-1851 (2005).
  7. Fox, A. M., Moonschi, F. H., Richards, C. I. The nicotine metabolite, cotinine, alters the assembly and trafficking of a subset of nicotinic acetylcholine receptors. J Biol Chem. 290 (40), 24403-24412 (2015).
  8. Henderson, B. J., et al. Nicotine exploits a COPI-mediated process for chaperone-mediated up-regulation of its receptors. J Gen Physiol. 143 (1), 51-66 (2014).
  9. Henderson, B. J., et al. Menthol Alone Upregulates Midbrain nAChRs, Alters nAChR Subtype Stoichiometry, Alters Dopamine Neuron Firing Frequency, and Prevents Nicotine Reward. J Neurosci. 36 (10), 2957-2974 (2016).
  10. Ameen, N., Silvis, M., Bradbury, N. Endocytic trafficking of CFTR in health and disease. J. Cyst. Fibros. 6 (1), 1-14 (2007).
  11. Pauly, J. R., Marks, M. J., Robinson, S. F., van de Kamp, J. L., Collins, A. C. Chronic nicotine and mecamylamine treatment increase brain nicotinic receptor binding without changing alpha 4 or beta 2 mRNA levels. J Pharmacol Exp Ther. 278 (1), 361-369 (1996).
  12. Govind, A. P., Walsh, H., Green, W. N. Nicotine-induced upregulation of native neuronal nicotinic receptors is caused by multiple mechanisms. J Neurosci. 32 (6), 2227-2238 (2012).
  13. Mazzo, F., et al. Nicotine-modulated subunit stoichiometry affects stability and trafficking of alpha3beta4 nicotinic receptor. J Neurosci. 33 (30), 12316-12328 (2013).
  14. Moroni, M., Zwart, R., Sher, E., Cassels, B. K., Bermudez, I. α4β2 nicotinic receptors with high and low acetylcholine sensitivity: pharmacology, stoichiometry, and sensitivity to long-term exposure to nicotine. Mol Pharmacol. 70 (2), 755-768 (2006).
  15. Tsien, R. Y. The green fluorescent protein. Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).
  16. Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  17. Fox-Loe, A. M., Dwoskin, L. P., Richards, C. I. Neuromethods: Nicotinic Acetylcholine Receptor Technologies. Ming, L. 117, Humana Press. (2016).
  18. Khiroug, S. S., et al. Dynamic visualization of membrane-inserted fraction of pHluorin-tagged channels using repetitive acidification technique. BMC Neurosci. 10 (141), (2009).
  19. Araki, Y., Lin, D. T., Huganir, R. L. Plasma membrane insertion of the AMPA receptor GluA2 subunit is regulated by NSF binding and Q/R editing of the ion pore. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (24), 11080-11085 (2010).
  20. Yudowski, G. A., et al. Real-time imaging of discrete exocytic events mediating surface delivery of AMPA receptors. J Neurosci. 27 (41), 11112-11121 (2007).
  21. Mattheyses, A. L., Simon, S. M., Rappoport, J. Z. Imaging with total internal reflection fluorescence microscopy for the cell biologist. J Cell Sci. 123, 3621-3628 (2010).
  22. Axelrod, D. Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy. Methods Cell Biol. 89, 169-221 (2008).
  23. Paroutis, P., Touret, N., Grinstein, S. The pH of the secretory pathway: measurement, determinants, and regulation. Physiol (Bethesda). 19, 207-215 (2004).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نقل بروتينات الغشاءفلورة الانعكاس الداخلي الكليمجهر TIRFضبط الأس الهيدروجيني خارج الخليةمستقبلات الغشاء البلازميالشبكة الإندوبلازميةإدراج حويصلة واحدةطريقة التصوير الفلوري
باستخدام مستقبلات الموسومة pHluorin لمراقبة التحت خلوية التعريب والاتجار
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.