مقالة منهجية

الكشف عن تنشيط يجند G-إلى جانب البروتين مستقبلات التطبع التي كتبها متحد البؤر المجهري

DOI:

10.3791/55514

⸱

أبريل 9, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Engineering Research Center of Marine Facilities Aquaculture, Marine Science College, Zhejiang Ocean University, 2Institute of Biochemistry, College of Life Sciences, Zhejiang University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول كشف الفحص المجهري متحد البؤر من مستقبلات البروتين يقترن-G (GPCR) تدخيل في خلايا الثدييات. ويشمل الثقافة الأساسية الخلية، ترنسفكأيشن، وإجراء الفحص المجهري متحد البؤر، ويوفر وسيلة فعالة وللتفسير بسهولة للكشف عن توطين التحت خلوية واستيعاب GPCR-أعرب الانصهار.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الفحص المجهري بالليزر متحد البؤر (CLSM) هو تقنية تصوير بصري للتصوير عالي التباين. إنها طريقة قوية لتصور بروتينات الاندماج الفلوري ، مثل بروتين الفلورسنت الأخضر (GFP) ، لتحديد تعبيرها وتوطينها ووظيفتها. يعد التوطين الخلوي للبروتينات المستهدفة أمرا مهما لتحديد التوصيف والتحليلات الوظيفية. الاستيعاب هو أحد الآليات السائدة التي تتحكم في إشارات المستقبلات المقترنة ببروتين G (GPCR) لضمان الاستجابات الخلوية المناسبة للمنبهات. هنا ، نصف طريقة تجريبية للكشف عن التوطين تحت الخلوي واستيعاب GPCR في خلايا HEK293 باستخدام الفحص المجهري متحد البؤر. بالإضافة إلى ذلك ، توفر هذه التجربة بعض التفاصيل حول زراعة الخلايا والتعداد. هذا البروتوكول متوافق مع مجموعة متنوعة من علامات الفلورسنت المتاحة على نطاق واسع وينطبق على تصور التوطين الخلوي لغالبية البروتينات ، وكذلك استيعاب GPCR. يجب أن تمكن هذه التقنية الباحثين من التلاعب بكفاءة بالتعبير الجيني GPCR في خطوط خلايا الثدييات ويجب أن تسهل الدراسات حول توطين الخلايا الفرعية GPCR واستيعابها.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلايا تمتلك البضائع الآلات الاتجار لنقل مواد مثل بروابط، والكائنات الدقيقة، والمغذيات، والبروتينات في الغشاء الخلية للحصول على معلومات، والطاقة، وغيرها من الأغراض 1، 2 خارج الخلية. ومن الأهمية بمكان للالتوازن الخلوي، وظيفة الأنسجة، وبقاء الخلية بشكل عام. التعبير القائم على خلية من البروتينات الانصهار فلوري هو وسيلة قوية لدراسة توطين واستيعاب مستقبلات الغشاء، مثل G مستقبلات البروتين يقترن (GPCR)، في مسارات الإشارات 3.

وقد اكتسب التعبير عن البروتينات الانصهار ذات الكلمات الدلالية مع الأخضر بروتين فلوري (GFP) من فيكتوريا قنديل البحر Aequorea، جنبا إلى جنب مع تقنيات الكشف عن مضان المباشر، قبولا واسعا في استهداف بروتين البحوث 4، 5، 6. detecti القائم GFPعلى ديها ميزة تسمح للتصوير في الوقت الحقيقي من الخلايا الحية مع تجنب القطع الأثرية تثبيت 7. وقد تم بناؤها سلسلة من ناقلات الاستنساخ متعددة لتسهيل التعبير عن اندماج البروتين GFP في مختلف خلايا 8 و 9. متجه pEGFP-N1 هو متجه البلازميد تستخدم على نطاق واسع وتسويقها ترميز لتعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP)، والتي تم الأمثل من النوع البري GFP لأكثر إشراقا مضان والتعبير العالي في خلايا الثدييات. لمراقبة أعربت إشارة الفلورسنت من EGFP في خلايا الثدييات، ينبغي إجراء الفحص المجهري مضان مع الإثارة في 488 نانومتر، وانبعاث في 507 نانومتر، ويفضل مع المجهر متحد البؤر.

رصد توطين التحت خلوية واستيعاب بوساطة يجند مستقبلات هي تقنية مشتركة للتحقيق في نقل الإشارة وظيفة GPCRs 10 11. في معظم الحالات، واستيعاب يؤدي إلى الحساسية من GPCRs (تخفيف من الاستجابة التحفيز على الرغم من وجود منبهات) 12، 13. ويمكن إدراج المستقبلات المنضوية في يحلول والمتدهورة، أو أنها يمكن إعادة تدويرها مرة أخرى إلى سطح الخلية، وهذا يتوقف على طبيعة المستقبلات وخطوط الخلايا المستخدمة في التجارب.

مستقبلات هرمون موجهة الغدد التناسلية الافراج عن (GnRHRs) تنتمي إلى عائلة GPCR ولديها بنية البروتين GPCR نموذجي، مع محطة الأمينية خارج الخلية، محطة -COOH داخل الخلايا، وسبعة الغشاء (TM) 14 المجالات. وأفاد ترنسفكأيشن البلازميد المؤتلف صج GnRHR-EGFP (مع الجين GnRHR من Sepiella تفرضه اليابان) وكشف الفحص المجهري متحد البؤر من الموسومة EGFP صج GnRHR (معبرا في الخلايا HEK293) بريفيوخبيث، وتأسست مضان GFP كمراسلة للبروتين الغشاء فحوصات توطين 15. الآن، واستيعاب صج GnRHR، تفعيلها من خلال S. الجابونيكا بين الافراج عن هرمون موجهة الغدد التناسلية (SJ نره])، وقد تجلى في الأدب زمنية وتعتمد على الجرعة عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. خلية التحضير

  1. انتعاش خلية
    1. نقل الجنينية الكلى 293 (HEK293) الخلايا البشرية cryopreserved من خزان النتروجين السائل ل37 ° C حمام الماء ويهز مستمر 1 - 2 دقيقة.
    2. إضافة 10 مل من متوسط ​​النمو معايرتها (وسط المعدلة النسر Dulbecco وفي (DMEM)، و 10٪ الجنين المصل البقري (FBS)، و 1٪ البنسلين ستربتومايسين الحل) إلى 10 سم، وطبق ثقافة الخلية. إضافة بلطف الخلايا إذابة إلى وسط النمو معايرتها.
    3. احتضان الخلايا في 37 ° C CO 2 حاضنة تغلف المياه مع جو مرطب يحتوي على 95٪ الجوية و 5٪ CO 2 ل2-4 ساعة.
    4. بعد 2-4 ساعة، تأكد من أن يتم إرفاق الخلايا. استبدال المتوسطة النمو معايرتها والثقافة لمدة 24 آخر - 48 ساعة.
      ملاحظة: تغيير المتوسطة النمو معايرتها هو مفيد لأنه يزيل سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO) ويحمي الخلايا من التلف.
  2. <قوي> مرور خلية
    1. بعد 24 - 48 ساعة، وعندما نمت الخلايا لالتقاء القريب، تجاهل المتوسطة النمو معايرتها وغسل الخلايا مع 2 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). دوامة طبق بلطف.
    2. تجاهل PBS وإضافة 1 مل من التربسين-EDTA (المالحة، 0.25٪ التربسين، و 0.02٪ EDTA). لهضم تماما الخلايا، دوامة الطبق بعناية ونضح من الحل التربسين-EDTA. وضع الطبق في 37 ° C CO 2 حاضنة تغلف الماء لمدة 3 دقائق.
      ملاحظة: خلال هذه الفترة، وإعداد ثلاثة أطباق جديدة خلية ثقافة 10 سم وإضافة 10 مل من متوسط ​​النمو معايرتها لكل منهما.
    3. باستخدام المجهر الضوئي، تحديد ما إذا كان قد رفع الخلايا من الجزء السفلي من الطبق. إضافة 2 مل من متوسط ​​النمو معايرتها إلى الطبق. مزيج من قبل pipetting والماصة على الفور 0.6 مل من خلية إلى تعليق كل من الأطباق الجديدة. المزيج بلطف قبل pipetting وتسمح للخلايا لاحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.

2. خلية البذر

  1. بعد 24 - 48 ساعة، وعندما نمت الخلايا passaged إلى قرب التقاء، تجاهل المتوسطة النمو معايرتها وغسل الخلايا مع 2 مل من برنامج تلفزيوني. دوامة طبق بلطف.
  2. تجاهل PBS وإضافة 1 مل من التربسين-EDTA. لهضم تماما الخلايا، دوامة الطبق بعناية ونضح قبالة التربسين-EDTA. وضع الطبق في 37 ° C CO 2 حاضنة تغلف الماء لمدة 3 دقائق.
    ملاحظة: خلال هذه الفترة، وإعداد لوحة 6 جيدا بإضافة 2 مل من متوسط ​​النمو معايرتها إلى كل بئر.
  3. إضافة 1 مل من متوسط ​​النمو معايرتها إلى الطبق، إذا، تحت الملاحظة المجهرية، والخلايا قد رفع من قاع الطبق. مزيج من قبل pipetting وعلى الفور الماصة 0.1 مل من تعليق خلية (يتم ضبط حجم وفقا لكثافة نمو الخلايا) إلى كل بئر من إعداد لوحة 6 جيدا (خلايا أقل 6 جيدا لوحة مع 2 مل من متوسط ​​النمو معايرتها). المزيج بلطف قبل pipetting وتسمح للخلايالاحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.

3. خلية ترنسفكأيشن

  1. طريقة ترنسفكأيشن 1، مع التركيبات الحويصلية
    ملاحظة: يرجى الاطلاع على جدول المواد للترنسفكأيشن الكاشف 1.
    1. في اليوم التالي، وضمان أن الخلايا يجب أن يكون 85-95٪ متموجة.
    2. إضافة 3 ميكروغرام من البلازميد (500 نانوغرام / ميكرولتر) و 100 ميكرولتر من وسائل الاعلام المصل خفضت إلى أنبوب microcentrifuge العقيمة، وتخلط بلطف. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    3. إعداد 9 ميكرولتر من الكاشف 1 و 100 ميكرولتر من وسائل الاعلام المصل انخفاض في أنبوب microcentrifuge آخر، وتخلط بلطف. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. الجمع بين خليط البلازميد المخفف مع الكاشف المخفف 1 (إجمالي حجم = 215 ميكرولتر). المزيج بلطف واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. نضح المتوسطة من لوحة الخلايا مثقف، وإضافة 1.5 مل DMEM جديدة دون FBS.
    6. إضافة 215 ميكرولتر من الحمض النووي transfection كاشف المزيج على كل قطرة قطرة جيدا، وتخلط بلطف يحوم اللوحة.
    7. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 ل4-8 ساعة. استبدال DMEM جديدة مع 10٪ FBS.
    8. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 آخر - 48 ساعة قبل تشغيل أي التجارب.
  2. طريقة ترنسفكأيشن 2، مع صيغ الحويصلية
    ملاحظة: يرجى الاطلاع على جدول المواد للترنسفكأيشن الكاشف 2.
    1. إضافة 2 ميكروغرام من البلازميد (500 نانوغرام / ميكرولتر)، و 4 ميكرولتر من الكاشف 2، و 100 ميكرولتر تخفيض وسائل الاعلام المصل في أنبوب microcentrifuge العقيمة. المزيج بلطف واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. يضاف خليط ترنسفكأيشن إلى الخلايا بطريقة قطرة قطرة.
    3. بعد ترنسفكأيشن، واحتضان الخلايا لمدة 24 - 48 ساعة عند 37 ° C وCO 2 5٪، قبل تشغيل أي التجارب.

4. زراعة الخلايا على زلات تغطية

  1. إعادةنقل متوسطة النمو من ثقافة لوحة 6 جيدا.
  2. غسل أحادي الطبقة الخلية مع 1 مل من برنامج تلفزيوني بدون الكالسيوم والمغنيسيوم.
  3. إضافة 0.5 مل التربسين-EDTA. دوامة الطبق بعناية ونضح قبالة التربسين-EDTA. احتضان لوحة الثقافة لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. فترة حضانة الفعلي يختلف مع خط الخلية المستخدمة.
    ملاحظة: خلال هذه الفترة، وإعداد جديدة لوحة 12 جيدا وإضافة 15 مم غطاء معقم ينزلق إلى كل بئر. زلات تغطية المغلفة مع يسين، laminin، أو الكولاجين قد تحسن مرفق الخلية لخلايا HEK293 أن فصل بسهولة.
  4. عندما يتم فصل الخلايا، إضافة استعد قبل 1 مل متوسطة النمو الكامل إلى كل بئر. مزيج من قبل pipetting ونقل على الفور العدد المطلوب من الخلايا إلى صفيحة ال 12 جيدا مع زلات الغطاء. إضافة متوسطة النمو الكامل الطازجة إلى كل بئر لضبط الحجم الكلي ل1 مل
  5. احتضان الخلايا لمدة 16-24 ساعة عند 37 ° C وCO 2 5٪.
    ملاحظة: بعد 30 -60 دقيقة، والغالبية العظمى من الخلايا وانضمت إلى زلات غطاء العقيمة.

5. الكشف المجهري متحد البؤر

  1. توطين الخلوية
    1. بعد 16-24 ساعة، وعندما نمت الخلايا لالتقاء القريب على زلات غطاء العقيمة في لوحة ال 12 أيضا، إضافة التحقيق الغشاء، الجاذبة، إلى كل بئر، وإعطاء تركيز النهائي من 5 ميكرومتر. السماح للخلايا لاحتضان لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    2. بعد 30 دقيقة، وإزالة المتوسطة النمو معايرتها وغسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني الباردة (2-8 درجة مئوية).
    3. إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من محلول بارافورمالدهيد 4٪ (في PBS) إلى كل بئر. تستنهض الهمم بلطف لمدة 15 دقيقة.
      تحذير: امتصاص العرق بشكل معتدل السامة عن طريق ملامسة الجلد أو الاستنشاق، ويعين على أنه مسرطن بشري محتمل. المواد الكيميائية يستشيطون غضبا اغطية والأسوار التوازن تنفيس أو تدابير وقائية أخرى يجب أن يستعمل أثناء التعامل مع وزنها وامتصاص العرق.
    4. غسل الخلايا الثابتة مرتين في برنامج تلفزيوني. إضافة 200-300 ميكرولتر من دابي (4، 6 diamidino-2-phenylindole) حل (0.5 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    5. غسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. إزالة بعناية زلات غطاء من لوحة والفتيل قبالة الزائدة PBS. عكس على الشرائح المجهر محملة قطرة واحدة من متوسطة تركيب (50٪ ت / ت الجلسرين / الماء). إزالة المتوسطة المتزايدة الزائدة من الشرائح.
  2. استيعاب الخلوي
    1. بعد 16-24 ساعة، وعندما نمت الخلايا لالتقاء القريب على زلات غطاء العقيمة في لوحة ال 12 أيضا، وإزالة المتوسطة النمو معايرتها وإضافة جديدة، تحسنت DMEM المتوسطة (37 ° C). احتضان الخلايا لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    2. علاج الخلايا مع تركيزات مختلفة (0، 10 -12، 10 -9، و 10 -6 M) يجند لمدة 30 دقيقة وتعاملهم مع 10 -6 M يجند في أوقات مختلفة (0،10، 30، و 60 دقيقة).
    3. غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني الباردة (2-8 درجة مئوية). إصلاح الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من محلول بارافورمالدهيد 4٪ (في PBS) إلى كل بئر. تستنهض الهمم بلطف لمدة 15 دقيقة.
    4. غسل الخلايا مرتين في برنامج تلفزيوني. إزالة بعناية زلات غطاء من لوحة والفتيل قبالة الزائدة PBS. عكس على الشرائح المجهر محملة قطرة واحدة من متوسطة تركيب (50٪ ت / ت الجلسرين / الماء). إزالة المتوسطة المتزايدة الزائدة من الشرائح.
  3. المجهر متحد البؤر
    1. تشغيل الأجهزة المجهر متحد البؤر، بما في ذلك الطاقة مصباح الزئبق، المجهر PC، الماسح الضوئي، والليزر. تسجيل الدخول إلى حساب نظام التشغيل، وإطلاق البرنامج، والتحقق من التكوين واختيار الليزر. تشغيل وحدات مختلفة من نظام الفحص المجهري متحد البؤر في النظام وفقا للتعليمات.
    2. ضع الشرائح التي أعدت على المسرح المجهر. ضع العينة على العدسة الشيئية باستخدام وحدة تحكم المرحلة. إضافة قطرة واحدة من زيت الأرز علىإلى ساترة عند تحديد عدسة الغمر النفط. ضع زلات غطاء على الشرائح التي تواجه العدسة.
    3. العثور على خلايا الفائدة تحت المجهر الفلورسنت.
    4. التبديل إلى وضع المسح الضوئي. اختيار قوة الليزر والنطاق الطيفي للfluorophore الانبعاثات. التقاط صور ذات جودة عالية مبائر من شدة ضبط الليزر وغيرها من المعالم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 1 مثالا لنظام المجهر متحد البؤر. ويبين الشكل 2 التعبير عن pEGFP-N1 في الخلايا HEK293. تم الكشف عن إشارة GFP في السيتوبلازم والنواة. ويبين الشكل 3 توطين التحت خلوية من GnRHR من S. تفرضه اليابان في الخلايا HEK293، بما يتفق مع نتائجنا نشرت سابقا 15. البروتين الانصهار مع العلامة EGFP في C-محطة من سج GnRHR (SJ GnRHR-EGFP) ظهر الأخضر في هذه ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بروتوكول المعروضة هنا يوفر وسيلة فعالة وللتفسير بسهولة للكشف عن توطين التحت خلوية واستيعاب أعرب GPCR انصهار بروتين في الخلايا HEK293. هذه التقنية يمكن تكييفها بسهولة للعديد من جينات مختلفة وأنواع الخلايا، مثل لتوطين الخلوية واستيعاب مستقبلات corazonin من دودة القز في HEK293 وBMN خلايا 16.

التطبيق الناجح لهذا الاختبار قوي يعتمد على عدد قليل من العوامل الرئيسية. قبل كل شيء هو الصحة ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يود مؤلفو هذه الورقة أن يشكروا البروفيسور جيايان شيه على المساعدة الفنية واستخدام المعدات. تم دعم هذا العمل ماليا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (41406137).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خط خلية HEK293 
DMEM / ارتفاع الجلوكوزهيكلونSH30022.01نسبة عالية من الجلوكوز 4.0 ملي مولار L-glutamine
مصل بقري للجنين (FBS)PuFei1101-100
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)GenomGNM10010
Penicillin-StreptomycinGenomGNM15140
0.25٪ تريبسين و 0.02٪ EDTAGenomGNM25200
Opti-MEM (1x)GIBCO ، من Life Technologies31985-062مصل مخفضة
ليبوفاكتامين 2000 كاشف النفقةInvitrogen11668027Reagent 1
X-tremeGENE HP DNA TRANSFECTIONكاشف Roche6366236001كاشف 2
محلول تلطيخ DAPIBeyotimeC1006
DiIBeyotimeC1036
مضاد للتلاشي تصاعد متوسطBeyotimeP0126
بارافورمالديهايدSinopharm الكاشف الكيميائي المحدودة (SCRC)80096618
ثقافة الخلايا 100 ممCORNING430167
لوحة 6 آبار   ؛ExCell BioCS016-0092
لوحة 12 بئر  ExCell BioCS016-0093
غطاء زجاجيNEST801007
مجهر شرائحCitoglas10127105P-G
Thermo Scientific Forma CO2< / sub> حاضنةThermo3111
TCS SP5II مجهر متحد البؤر للمسح بالليزرLeica & nbsp ؛5100001311
وسائط

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Mellman, I. Endocytosis and molecular sorting. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 12, 575-625 (1996).
  2. Hausott, B., Klimaschewski, L. Membrane turnover and receptor trafficking in regenerating axons. Eur J Neuro. 43, 309-317 (2016).
  3. Kallal, L., Benovic, J. L. Using green fluorescent proteins to study G-protein-coupled receptor localization and trafficking. Trends Pharmacol Sci. 21, 175-180 (2000).
  4. Prasher, D. C., Eckenrode, V. K., Ward, W. W., Prendergast, F. G., Cormier, M. J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene. 111, 229-233 (1992).
  5. Spector, D. L., Goldman, R. D. Constructing and Expressing GFP Fusion Proteins. CSH protocols. 2006, (2006).
  6. Drew, D. E., von Heijne, G., Nordlund, P., de Gier, J. W. Green fluorescent protein as an indicator to monitor membrane protein overexpression in Escherichia coli. FEBS Lett. 507, 220-224 (2001).
  7. von Arnim, A. G., Deng, X. W., Stacey, M. G. Cloning vectors for the expression of green fluorescent protein fusion proteins in transgenic plants. Gene. 221, 35-43 (1998).
  8. Webb, C. D., Decatur, A., Teleman, A., Losick, R. Use of green fluorescent protein for visualization of cell-specific gene expression and subcellular protein localization during sporulation in Bacillus subtilis. J Bacteriol. 177, 5906-5911 (1995).
  9. Kain, S. R., et al. Green fluorescent protein as a reporter of gene expression and protein localization. BioTechniques. 19, 650-655 (1995).
  10. Fukunaga, S., Setoguchi, S., Hirasawa, A., Tsujimoto, G. Monitoring ligand-mediated internalization of G protein-coupled receptor as a novel pharmacological approach. Life Sci. 80, 17-23 (2006).
  11. Yang, J., et al. Agonist-Activated Bombyx Corazonin Receptor Is Internalized via an Arrestin-Dependent and Clathrin-Independent Pathway. Biochemistry. 55, 3874-3887 (2016).
  12. Kohout, T. A., Lefkowitz, R. J. Regulation of G protein-coupled receptor kinases and arrestins during receptor desensitization. Mol Pharmacol. 63, 9-18 (2003).
  13. Ferguson, S. S., et al. Role of beta-arrestin in mediating agonist-promoted G protein-coupled receptor internalization. Science. 271, 363-366 (1996).
  14. Stojilkovic, S. S., Reinhart, J., Catt, K. J. Gonadotropin-releasing hormone receptors: structure and signal transduction pathways. Endocr Rev. 15, 462-499 (1994).
  15. Yan, Y. J., et al. Identification and Expression Profile of the Gonadotropin-Releasing Hormone Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. , (2016).
  16. Yang, J., et al. Specific activation of the G protein-coupled receptor BNGR-A21 by the neuropeptide corazonin from the silkworm, Bombyx mori, dually couples to the G(q) and G(s) signaling cascades. J Biol Chem. 288, 11662-11675 (2013).
  17. Lu, Z. M., et al. Cloning, Characterization, and Expression Profile of Estrogen Receptor in Common Chinese Cuttlefish, Sepiella japonica. J Exp Zool A Ecol Genet Physiol. 325, 181-193 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HEK293

مقالات ذات صلة