مقالة منهجية

طريقة بسيطة لتحديد الحركات التي تنظم تعدد القدرات الجذعية للخلايا الجذعية من خلال فحص المانع عالي الإنتاجية

DOI:

10.3791/55515

⸱

مايو 12, 2017

 ,  , 
1The MRC Protein Phosphorylation and Ubiquitylation Unit, School of Life Sciences, University of Dundee, 2Department of Cancer Biology, Dana-Farber Cancer Institute, 3Department of Biological Chemistry and Molecular Pharmacology, Harvard Medical School

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكول الكمي وقابلة للتنفيذ لأداء شاشات جزيئات صغيرة المستهدفة للمنظمين كيناز للتحول متعدد القدرات السذاجة تستعد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية الجنينية (إيسس) يمكن تجديد الذات أو التفريق في جميع أنواع الخلايا، وهي ظاهرة تعرف باسم تعدد القدرات. وقد وصفت دول متعددة القدرات، وصفت بأنها "ساذجة" و "مستعدة" تعدد القدرات. إن الآليات التي تتحكم في الانتقال الساذج غير مفهومة. على وجه الخصوص، ونحن لا تزال غير مدركين جيدا عن كينازات البروتين التي تحدد الدول المحفزة السذاجة وتستعد، على الرغم من زيادة توافر مركبات أداة ذات جودة عالية للتحقيق وظيفة كيناز. هنا، نحن تصف منصة قابلة للإنجاز المستهدفة شاشات جزيء صغير للمنظمين كيناز للتحول متعدد القدرات السذاجة تستعد في المجالس الاقتصادية والاجتماعية الماوس. يستخدم هذا النهج ظروف زراعة الخلايا البسيطة والكواشف القياسية والمواد والمعدات للكشف والتحقق من مثبطات كيناز مع آثار غير مقدر حتى الآن على تعدد القدرات. نناقش التطبيقات المحتملة لهذه التكنولوجيا، بما في ذلك فحص جزيء صغير آخرمجموعات مثل مثبطات كيناز المتطورة على نحو متزايد والمكتبات الناشئة من المركبات أداة جينية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية الجنينية (إيسس) لديها القدرة على التجديد الذاتي أو التفريق في أي نوع من الخلايا في الجسم الكبار، وهي ظاهرة تعرف باسم تعدد القدرات 1 . وتشير الدلائل الأخيرة إلى وجود دول متعددة القدرات تنمويا، يطلق عليها "تعدد السذاجة" و "المفترضة". تمثل المجالس الاقتصادية والاجتماعية الساذجة حالة من التطور مماثلة لتلك الموجودة في الجنين قبل الزرع 3 . وعلى النقيض من ذلك، تستعد المجالس الاقتصادية والاجتماعية المحفزة المتعددة القدرات للخروج من تعدد القدرات والتمييز في الأنساب الجنينية المتخصصة 4 ، 5 .

وتتميز الدول المحفزة الساذجة والمستعدة بشبكات تنظيمية جينية متميزة. يتميز تعدد القدرات السذاجة بالتعبير عن عوامل النسخ متعددة القدرات الرئيسية مثل عوامل النسخ النانوج، مثل كروبل (كلفس)، Rex1 2 و إسرب 6. في المجالس الاقتصادية والاجتماعية الماوس (ميسس)، يتميز تعدد القدرات تستعد بتقليص التعبير عن علامات ساذجة والتوقيع التعبير الجيني المحدد الذي يتضمن دي نوفو الحمض النووي ميثيل ترانسفيراس Dnmt3b 7 . في الجسم الحي ، تستعد متعدد القدرات بعد زرع الخلايا الجذعية إبيبلاست (إبيسس) 4 ، 5 بالإضافة إلى التعبير عن علامة إبيبلاست Fgf5 وعلامات النسب فتيلة مثل براشيوري 8 .

تقدم ميسس نموذجا قابل للسحب لتحقيق الآليات التي تتحكم في التحولات متعددة السذاجة مستعدة في المختبر . عندما مثقف في سرطان الدم عامل مثبط (ليف) ومصل البقري الجنين (فبس)، ميسس تمر الانتقال الديناميكي بين الدول المحفزة السذاجة وتستعد 9 ، 10 . ليف-جاك-Stat3 وظائف الإشارات لتعزيز شبكة تنظيمية الجينات ساذجة 11 ، في حين أن التشوير الأوتوقراطي عبر عامل نمو الخلايا الليفية 4 (Fgf4) Erk1 / 2 مسار يدفع الانتقال إلى الدولة معدة 12 . ومع ذلك، لا يزال من الصعب إجراء تقييم منهجي لدور الكينازات البروتينية في تحديد حالات متعددة القدرات.

هنا، وصفنا منصة كمية وقابلة للتطوير من خلالها لأداء شاشات جزيئات صغيرة المستهدفة للمنظمين كيناز للتحول المحفزة السذاجة تستعد. نحن نستخدم ظروف ثقافة ميسك بسيطة والكواشف القياسية والمواد والمعدات للكشف والتحقق من مثبطات كيناز مع القدرة غير المقدرة حتى الآن لتحقيق الاستقرار في تعدد القدرات الساذجة. وعلاوة على ذلك، نناقش التطبيقات المحتملة المحتملة لهذه التكنولوجيا، بما في ذلك لفحص مجموعات جزيئات صغيرة أخرى مثل المكتبات المانع الناشئة التي تستهدف المنظمين جينية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تجميع جزيء صغير مكتبات كيناز مثبط

  1. جمع مكتبات المانع من مجموعات مثبطات كيناز يمكن الوصول إليها للجمهور، على سبيل المثال مكتبة التوقيعات الخلوية القائمة على الشبكة المتكاملة (لينكس) من كلية الطب بجامعة هارفارد، وهي مجموعة مستهدفة من 228 مثبطات كيناز قوية وانتقائية (http://lincs.hms.harvard.edu) ، ومجموعة مثبطات كيناز البروتين (ييس)، ومجموعة مجمع 376 تجميعها من قبل الباحثين الصناعيين (https://www.ebi.ac.uk/chembldb/extra/PKIS) 13 . بدلا من ذلك، تجميع مجموعة من مثبطات كيناز مفصل من المركبات المتاحة تجاريا.
    ملاحظة: في مختبرنا، قمنا بتجميع مجموعة من 72 مثبطات كيناز أداة قوية وانتقائية تغطي 51 كيناز الهدف الأساسي، وكلها متاحة من مصادر تجارية.
  2. تجميع مثبطات كيناز في لوحات 96-جيدا لأفضل معالجة عالية الإنتاجية في تركيزات متعددة (استخدام 1، 0.1 أند 0.01 مم). تضمين في كل بئر التحكم لوحة تحتوي على دمسو فقط ومثبطات التحكم المرجعي PD173074 (فغفري) و روكسوليتينيب (جاكي)، والتي هي معروفة لتعزيز الدول المحفزة السذاجة وتستعد على التوالي. إضافة تعليق توضيحي في جدول بيانات أو برامج مشابهة.

2. الظروف والثقافة ميسك لإعداد الشاشة

  1. إعداد 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 10 سم الأطباق بإضافة 5 مل من 0.1٪ (ث / ت) الجيلاتين إلى 10 سم لوحات واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. نضح الجيلاتين والسماح لوحة جافة لمدة 2 دقيقة.
  2. ثقافة أي خط مسك القياسية عند 37 درجة مئوية 5٪ كو 2 على 0.1٪ أطباق الجيلاتين المغلفة 10 سم في وسائل الإعلام مسك القياسية (انظر جدول المواد ) التي تحتوي على 100 نانوغرام / مل غست-ليف، 10٪ مصل العجل الجنين و 5٪ مصل المغلوب إستبدال. استبدال وسائل الإعلام كل يوم و ميسس مرور في حوالي 80٪ كونفلنسي كل يوم ثان في التخفيف من 1: 5-1: 10.
  3. لتمرير ميسس، نضح وسائل الإعلام وغسل مع 5 مل سf الفوسفات مخزنة المالحة (بس) لكل لوحة.
  4. إضافة 1 مل التربسين إدتا (0.05٪ التربسين، 0.02٪ إدتا) في لوحة من ميسس واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  5. ريسوسبيند تريبسينيزد الخلايا في 4 مل من وسائل الإعلام ميسك وأجهزة الطرد المركزي في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
  6. ريسوسبيند تماما بيليه الخلية في 5 مل من وسائل الإعلام ميسك، بيبتينغ صعودا وهبوطا لتوليد تعليق خلية واحدة.
  7. عد الخلايا من خلال الجمع بين تعليق خلية 10 ميكرولتر و 10 ميكرولتر من تريبان الأزرق (0.4٪). وضع في غرفة عد الخلايا أو استخدام عدادة الكريات والضوء المجهر.
  8. البذور 3 × 10 3 ميسس إلى 0.1٪ الجيلاتين المغلفة 96 لوحات جيدا، الحجم النهائي 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام، وذلك باستخدام ماصة الأقنية.
  9. تطبيق مثبطات كيناز عند 1: 100 التخفيف (1 ميكرولتر المضاف إضافة إلى 100 ميكرولتر وسائل الإعلام) باستخدام ماصة متعددة القنوات. وسائل الإعلام ماصة بلطف لخلط المانع وتعليق الخلية، ثم السماح للخلايا لتسوية في غطاء الأنسجة الأنسجة لمدة 1 ساعة لضمان المساواة في توزيع أكروسس سطح الطلاء. خلايا الثقافة لمدة 48 ساعة دون تغيير وسائل الإعلام.
    ملاحظة: لوحات الأسهم من 1 / 0.1 / 0.01 ملم سيعطي تركيز مثبط النهائي من 10/1 / 0.1 ميكرومتر على التوالي. نوصي بدء الشاشة في تركيز النهائي من 1 ميكرومتر لضمان تثبيط فعال من كيناسس الهدف الأساسي في حين تقليل الآثار خارج الهدف.

3. كيناز المانع فحص التحليل

  1. غسل 96 لوحات ميسك جيدا في 200 برنامج تلفزيوني ميكرولتر باستخدام الشافطة متعددة القنوات والماصات.
  2. جعل مقتطفات الخلية في 150 ميكرولتر من العازلة تحلل (20 ملي تريس درجة الحموضة 7.4، 150 ملي كلوريد الصوديوم، 1 ملي إدتا، 1٪ نب-40 (V / V)، 0.5٪ ديوكسيكولات الصوديوم (ث / ت)، 10 ملي β- الجلسيروفوسفهات ، 10 ملي بيروفوسفات الصوديوم، 1 ملي نف، 2 ملي نا 3 فو 4 ، بروتيس كاملة المانع أقراص كوكتيل).
  3. توضيح مقتطفات بواسطة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 30 دقيقة في V- القاع 96 لوحات جيدا.
  4. شل 100 ميكرولتر من سوبرناتانتس على نيتروسيل غشاء لولوس باستخدام 96-جيدا فراغ نقطة وصمة عار مشعب.
  5. تجفيف الغشاء، وصمة عار مع 40 مل من بونسيو S لضمان نقل ثابت.
  6. غسل الغشاء مع تبست وكتلة في تبست / 3٪ (ث / ت) الحليب.
  7. احتضان في الأجسام المضادة نانوغ و Dnmt3b في التخفيف من 1: 1000 (ت / ت) في تبست / 3٪ (ث / ت) مسحوق الحليب بين عشية وضحاها.
  8. غسل الأغشية في 3 × 10 دقيقة في تبست واحتضان في 30 مل من الأجسام المضادة الثانوية في التخفيف من 1: 10،000 (ت / ت) في تبست / 3٪ (ث / ت) الحليب.
  9. تطوير باستخدام نظام التصوير إمونوبلوتينغ الرقمية.
    ملاحظة: إذا كان ذلك ممكنا، استخدام الكمي مضان إمونوبلوتينغ للكشف عن نانوغ و Dnmt3b. ومع ذلك، فإن إشارة الخلفية ل Dnmt3b بواسطة إمونوبلوتينغ مضان عالية جدا. ولذلك، يتم استخدام 800 نانومتر مضان المضادة للأرنب (نانوغ) ومكافحة الفأر-هرب (Dnmt3b) الأجسام المضادة الثانوية.

4. تحليل البيانات الشاشة والتحقق من صحة مثبطات كما بونا فيد المنظمين القدرات

> ملاحظة: هذه خطوة حاسمة لضمان أن يتم تحديد فقط المحولات متعددة القدرات حسن النية. من الضروري أن مثبطات الفرز على أساس كل من نانوغ: نسبة Dnmt3b والإشارة العامة، لضمان أن مثبطات كيناز التي تؤثر سلبا على البقاء ميسك لم يتم اختيار لمزيد من التحليل.

  1. تحديد إشارة النانوغ و Dnmt3b باستخدام برنامج تحليل إمونوبلوتينغ، واستيراد القيم في جدول بيانات أو برامج مماثلة. حساب نانوغ: نسبة Dnmt3b لجميع العينات مقارنة السيطرة دمسو. أيضا، تحديد مجموع نانوغ و Dnmt3b إشارة للتأكد من أن مثبطات كيناز لا تؤثر على نانوغ: نسبة Dnmt3b عن طريق تغيير قابلية ميسك.
  2. استخدام نسب نانوغ: Dnmt3b لتحديد مثبطات التي تعزز تعدد القدرات الساذجة (نانوغ: نسبة Dnmt3b أعلى من السيطرة) والاستعداد متعدد القدرات (نانوغ: Dnmt3b نسبة أقل من السيطرة). تعيين قطع في 2x الانحراف عن قيم السيطرة، وتصفية مثبطات كيناز التي تنتج إشارة نانوغ + Dnmt3b الكلي أقل من ذلك50٪ من قيمة السيطرة دمسو لتوليد قائمة ثقة عالية من مثبطات كيناز التي تستقر السذاجة (نانوغ عالية: نسبة Dnmt3b) وتستعد (منخفضة نانوغ: Dnmt3b نسبة) الدول متعددة القدرات.
  3. التحقق من مثبطات كيناز عن طريق البذر ميسس في 2 × 10 5 خلايا لكل 6 جيدا في وسائل الإعلام 2 مل، وإضافة مثبطات كيناز في 1 ميكرومتر لمدة 48 ساعة، دون تغيير وسائل الإعلام.
  4. ليس ميسس في تحلل العازلة وتحليل نانوغ و Dnmt3b التعبير عن طريق إمونوبلوتينغ سدز-بادج التقليدية.
  5. مزيد من التحقق من صحة الزيارات التي كتبها سدز-بادج إمونوبلوتينغ لسخاء تعدد القدرات علامات Klf2 و Klf4، و Oct4 لضمان الحفاظ على تعدد القدرات بعد 48 ساعة العلاج المانع.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

باستخدام الإجراء المعروض هنا ( الشكل 1 )، ونحن الشاشة مكتبة لينكس من 228 مثبطات كيناز قوية وانتقائية لتحديد تلك التي تعدل تعدد القدرات ميسك. يتم إعداد المكتبة في تركيز 0.1 ملم لتخفيف 1: 100 وتركيز الفرز النهائي من 1 ميكرومتر في ميسس. 48 ساعة في وقت لاحق، تم تحليل ميسس ومستخلصات أعدت لتحليل نقطة طمس الكمي من نانوغ والتعبير Dnmt3b ( الشكل 2 ، أعلى). النتائج من تركيزات الفرز الأخرى ليست ممثلة هنا للإيجاز. نانوغ: يتم تحديد نسبة Dnmt3b لكل مثبط كيناز والمركبات في المرتبة و 2 X قطع قبالة تطبيقها ( الشكل 2 ، أسفل). تراكب إشارة نانوغ و Dnmt3b النسبية بالنسبة للسيطرة على مرتبة المانع وتخضع لقطع 0.5X، للسماح ترياجينغ من مثبطات التي تظهر سمية ميسك كبيرة. حدد مثبطات كيناز التي استقرار ستا السذاجةتي التحقق من صحة باستخدام التقليدية نانوغ / Dnmt3b إمونوبلوتينغ ( الشكل 3 ). تم عرض أهداف كيناز الأولية لهذه المثبطات في الجدول 1 . نحن أيضا إثبات انطباق هذه الشاشة لتحديد مثبطات التي استقرار الحالة معدة 14 .

figure-results-1
الشكل 1: سير العمل لفحص مثبطات الكيناز التي تعدل الانتقال السذاجة. تم علاج ميسك مع 228 المركب كيناز مكتبة المانع في تركيز النهائي من 1 ميكرومتر. تم تحضير الليسيتات ونقلها إلى أغشية النيتروسليلوز للتحليل المناعي للنقطة، وتم تحديد مستويات نانوغ و Dnmt3b (الشكل مقتبس من ويليامز وآخرون 14 ). الرجاء انقر هنا لعرض آل نسخة أرجر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تحليل شاشة تعدد القدرات السذاجة تستعد وتحديد المانع. (توب) ريبريزنتاتيف نانوغ و Dnmt3b الصور المناعية للنقط. (القاع) تم تحديد قيم النانوغ و Dnmt3b لكل مثبط كيناز بالنسبة إلى السيطرة دمسو، ونانوغ: Dnmt3b النسب ومجموع النسبية نانوغ + Dnmt3b إشارة تحديد ومثبطات في المرتبة بالمقارنة مع السيطرة دمسو. تم العثور على مثبطات لتغيير نانوغ: نسبة Dnmt3b وراء عتبة 2 أضعاف فوق أو تحت السيطرة دمسو باعتبارها محركات من تعدد القدرات ساذجة أو مستعدة. تم تعيين عتبة 2X تحت السيطرة دمسو إلى مثبطات الفرز التي تضر بقاء ميسك. يتم تمييز مثبطات مختارة لمزيد من التحقق من صحة. (الشكل مقتبس من ويليامز وآخرون 14 ).s / ftp_upload / 55515 / 55515fig2large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: التحقق من صحة المركبات المختارة المحددة. تم التعامل مع ميسس إما 1 ميكرومتر AZD4547 (مثبط فغفر انتقائية) أو مثبطات المشار إليها التي تم تحديدها من الشاشة في الشكل 2. نانوغ: Dnmt3b المستويات التي يحددها سدز-بادج القياسية وتحليل إمونوبلوت. القيم العددية لنانوغ النسبية: Dnmt3b و نانوغ + Dnmt3b مبينة في الجدول أدناه، والمثبطات التي تثبت الحالة المحفزة الساذجة التي تم إبرازها باللون الأخضر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مركب الأهداف الأساسية أهداف أخرى
AV-951 VEGFR
HG-6-64-01 عبل، براف، ريت، CSF1R، إغفر، EPHA8، فغفر، FLT3، كيت، لوك، MAP4K1، p38b، موسك، بدغفر، TAOK3، TNNI3K
WH-4-023 LCK SRC
R406 SYK
GW-572016 HER2 EGFR
KIN001-244 PDK1
WZ-4-145 CSF1R، DDR1، إغفر، TIE1، PDGFR2
WZ-7043 CSF1R، DDR1، فغفر و TAO1
GW786034 VEGFR1 VEGFR2، VEGFR3 &# 160؛
AZD-1480 JAK2

الجدول 1: مركبات ضرب مختارة وهدفها الأساسي (ق).

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهنا نبرهن على منهجية يمكن الوصول إليها على نطاق واسع للتحقيق في دور مسارات إشارات كيناز في تنظيم الانتقال المتعدد القدرات الساذج. هذا يعالج سؤالا رئيسيا في مجال إيسك. على الرغم من أن الجينوميات الإنتاجية العالية والنهج ترانسكريبتوميكس تستخدم بشكل روتيني لتحديد المنظمين النسخي الرئيسية من الدول المحفزة السذاجة والمعدية، وقد أثبتت توضيح شبكات الإشارات متعددة القدرات أن يكون تحديا. ونحن نقدم الآن استراتيجية مرنة تستخدم مثبطات كيميائية لتحديد الكينازات التي تتحكم في التحول متعدد القدرات الساذج في ميسس. هذا يعتمد على معدات بسيطة، الكواشف والمواد التي تتوفر لمعظم المختبرات التي تدرس الإشارات الخلية و إيسك البيولوجيا. من الأمور الحاسمة لنجاح هذا المنبر هو تطوير لدينا مقايسة قوية لتحديد الانتقال بين الدول المحفزة السذاجة وتستعد. إنشاء هذا الفحص يتطلب تعديلات تكرارية كبيرة ل بلات الخليةالكثافة، وقت حضانة المانع وظروف إمونوبلوتينغ.

نهج جزيء صغير تكتسب الجر للاستخدام الرشيد في تطبيقات إيسك العلاجية 15 ، 16 . وتتمثل القوة الرئيسية لفحص الجزيئات الصغيرة في تصميم مركبات الأدوات و / أو تعديلها من أجل امتصاص الخلايا الخلوية الفعال. كفاءة ترنسفكأيشن لا يحد، واستخدام أنظمة التوصيل الخطرة مثل لنتيفيروس ليست ضرورية. وعلاوة على ذلك، مثبطات كثيرا ما تمنع العديد من الأشكال الإسوية داخل عائلة كيناز (على سبيل المثال Fgfr1-4، Jak1-3)، الذي يتغلب على التكرار الوظيفي الذي يعوق تقنيات التدخل الجينية / الجينومية مثل رناي و كريسبر / Cas9. وكلما أصبحت مركبات الأدوات الأكثر فعالية وانتقائية متاحة من البرامج الأكاديمية واكتشاف الأدوية الصيدلانية، سيتم دفع الكينازات المفهومة وغير المفهومة إلى مقدمة البحوث الاقتصادية والاجتماعية والثقافية. لذلك نقترح أن هذا عاليةسوف تفحص نهج فرز الخام فتح آفاق جديدة للبحث في الشبكات التنظيمية الأساسية إيسك.

أحد القيود البسيطة لهذه التكنولوجيا هو أن حتى أقوى ومثبطات جزيئات صغيرة انتقائية إشراك وتمنع العديد من كيناسس غير ذات صلة في الجسم الحي . ومع ذلك، على نحو متزايد شاملة كيناز بيانات المانع التنميط يسمح أهداف وظيفية من مثبطات كيناز التي يمكن التعرف عليها بسهولة (http://lincs.hms.harvard.edu/kinomescan؛ http://www.kinase-screen.mrc.ac.uk/kinase -inhibitors). وأخيرا، من حيث المبدأ لدينا منصة يمكن تطبيقها على استجواب أي جزيء صغير جمع و / أو فحص الخلوي التي هي ذات جودة عالية الأجسام المضادة إمونوبلوتينغ المتاحة. وهذا سوف يسمح بدراسة نظم تنظيمية متعددة في تنظيم تعدد القدرات وتسهيل تحديد مثبطات الجزيئات الصغيرة التي تعدل العمليات الخلوية المتنوعة. على وجه التحديد، ونحن نتصور أن تطبيق مجموعات جزيء صغيرة الناشئة مثل إبيجينتحقيقات تيك التي يجري تطويرها من قبل اتحاد الجينوميات الهيكلية (http://www.thesgc.org/chemical-probes/epigenetics) لديه القدرة على كشف المزيد من منظمي جديدة للتحولات متعددة القدرات.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح ناشئ عن هذه الدراسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويدعم كاسو من قبل مجلس البحوث الطبية طلبة الدكتوراه. ويدعم غمف جزئيا من قبل مجلس البحوث الطبية جائزة المحقق الجديد (مر / N000609 / 1) ومنحة البحوث تينوفوس اسكتلندا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
mESC media
CCE mESCsATCCATCC  SCRC-1023
DMEM MediaGibco11965092
L-GlutamineGibco25030081النهائي: 2 ملي مولار
البنسلين / الستربتومايسينجيبكو15140122النهائي: 50 وحدة / مل
2-mercaptoethanolSigmaM6250النهائي: 0.1 ملي
عامل مثبط لسرطان الدم (اندماج ضريبة السلع والخدمات)كواشف وخدماتنهائي: 100 نانوغرام / مل
مثبط لسرطان الدمPMC9484 النهائي100 نانوغرام / مل
أحماض أمينية غير أساسيةجيبكو11140050النهائي: 0.1 ملي
الصوديومجيبكو11360070النهائي: 1 ملي مولار
مصل بديل بالضربة القاضيةInvitrogen10828-028النهائي: 5٪
مصل فيشر الأبقار الجنين10703464النهائي: 10٪
<قوي>الاسم<قوي>الشركة رقم الكتالوجتعليقات
TC materials
Trypsin-EDTA (0.05٪), الفينول الأحمرThermo25300054 
الجيلاتين من جلد الخنازيرSigma1890
Nunc MicroWell 96-Well MicroplatesThermo156545
DPBS ، بدون كالسيوم ، خال من المغنيسيومGibco14190136
V-bottom 96 ألواح بئرGreiner Bio-one651261
Name< / strong>Company< / strong>< قوي> رقم الكتالوج< قوي><قوي>تعليقات
Lysis Buffer
Tris bufferVWR103157P
كلوريد الصوديومVWR97061
EDTASigmaE4884
1٪ NP-40Sigma9016-45-9
الصوديوم ديوكسيكولاتسيجماD6750-100g
& beta - جليسيروفاتSigmaG9422
بيروفوسفات الصوديومSigma13472-36-1
فلوريد الصوديومسيجما450022
الصوديوم أورثوفاناداتسيجما450243
روش أقراص كوكتيل مثبطات البروتياز الكاملة SigmaCO-RO
strong>NameCompany Catalog NumberComments
Chemicals
TweenSigmaP1379-1L
Marvel
Name< / قوي >< قوي > شركة < / قوي >< قوي > رقم الكتالوج < / strong > التعليقات < / strong >
Western Blotting < / strong >
Protran BA 85 Nitrocellulose 0.45 & micor ؛ M  حجم المسام (20 سم × 20 سم أوراق) (25 ورقة) GE10401191
Ponceau SSigmaP7170-1L
Name< / strong>Company< / strong> Catalog Number< / strong>Comments
Laboratory Equipment
Minifold I نظامGE10447850
ChemiDoc imagerBioRad1708280 
LiCor Odyssey ImagerLiCor
NameCompany Catalog NumberComments
Antibodies
Anti-NanogReprocellRCAB001P
Anti-Dnmt3bImgenexIMG-184A
IRDye 800CW الحمار المضاد للأرانبLicor926-32213
تقنية إشارات الخلاياالمضادة للماوس HRP7076S
Anti-Klf2Millipore09-820
Anti-Klf4R & أنظمة DAF3158
Anti-Oct4سانتا كروزSC-5279
MRC-PPU عامل : بيروفات المحدد <

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292 (5819), 154-156 (1981).
  2. Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4 (6), 487-492 (2009).
  3. Boroviak, T., et al. Lineage-Specific Profiling Delineates the Emergence and Progression of Naive Pluripotency in Mammalian Embryogenesis. Developmental Cell. 35 (3), 366-382 (2015).
  4. Tesar, P. J., et al. New cell lines from mouse epiblast share defining features with human embryonic stem cells. Nature. 448 (7150), 196-199 (2007).
  5. Brons, I. G. M., et al. Derivation of pluripotent epiblast stem cells from mammalian embryos. Nature. 448 (7150), 191-195 (2007).
  6. Festuccia, N., et al. Esrrb is a direct Nanog target gene that can substitute for Nanog function in pluripotent cells. Cell Stem Cell. 11 (4), 477-490 (2012).
  7. Ficz, G., et al. FGF signaling inhibition in ESCs drives rapid genome-wide demethylation to the epigenetic ground state of pluripotency. Cell Stem Cell. 13 (3), 351-359 (2013).
  8. Guo, G., et al. Klf4 reverts developmentally programmed restriction of ground state pluripotency. Development. 136 (7), 1063-1069 (2009).
  9. Chambers, I., et al. Nanog safeguards pluripotency and mediates germline development. Nature. 450 (7173), 1230-1234 (2007).
  10. Findlay, G. M., et al. Interaction domains of Sos1/Grb2 are finely tuned for cooperative control of embryonic stem cell fate. Cell. 152 (5), 1008-1020 (2013).
  11. Niwa, H., Burdon, T., Chambers, I., Smith, A. Self-renewal of pluripotent embryonic stem cells is mediated via activation of STAT3. Genes Dev. 12 (13), 2048-2060 (1998).
  12. Kunath, T., et al. FGF stimulation of the Erk1/2 signalling cascade triggers transition of pluripotent embryonic stem cells from self-renewal to lineage commitment. Development. 134 (16), 2895-2902 (2007).
  13. Elkins, J. M., et al. Comprehensive characterization of the Published Kinase Inhibitor Set. Nature Biotechnology. 34 (1), 95-103 (2016).
  14. Williams, C. A. C., et al. Erk5 Is a Key Regulator of Naive-Primed Transition and Embryonic Stem Cell Identity. Cell Reports. 16 (7), 1820-1828 (2016).
  15. Cao, N., et al. Conversion of human fibroblasts into functional cardiomyocytes by small molecules. Science. 352 (6290), (2016).
  16. Zhang, M., et al. Pharmacological reprogramming of fibroblasts into neural stem cells by signaling-directed transcriptional activation. Cell Stem Cell. 18 (5), 653-667 (2016).

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Embryonic Stem CellsKinase Inhibitor ScreeningPluripotency RegulationNaive Primed TransitionHigh throughput ScreeningWestern Blot AnalysisCell Culture ProtocolNanog Dnmt3b AssayMouse ESC LinesSmall Molecule Libraries

مقالات ذات صلة