Method Article

بروتوكولات لتصور الستيرويدي المنشأ أجهزة وهيئات التفاعلية مع المناعية في ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة

DOI:

10.3791/55519

⸱

April 14th, 2017

 ,  ,  , 
1Graduate School of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba, 2Life Science Center of Tsukuba Advanced Research Alliance, University of Tsukuba, 3Faculty of Life and Environmental Sciences, University of Tsukuba

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تصف بروتوكول للتشريح، التثبيت، والمناعية من أجهزة الستيرويدي المنشأ في يرقات ذبابة الفاكهة والكبار الإناث لدراسة الستيرويد الحيوي الهرمونات وآلية التنظيمية. بالإضافة إلى أجهزة الستيرويدي المنشأ، ونحن تصور تعصيب أجهزة الستيرويدي المنشأ وكذلك الخلايا المستهدفة الستيرويدي المنشأ مثل الخلايا الجذعية سلالة الجرثومية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الكائنات متعددة الخلايا، وهبت مجموعة صغيرة من الخلايا مع وظيفة متخصصة في نشاطها الحيوي، الأمر الذي أدى إلى استجابة نظامية للنمو والتكاثر. في الحشرات واليرقات الغدة prothoracic (PG) والكبار الإناث اللعب المبيض أدوار أساسية في biosynthesizing هرمونات الستيرويد الرئيسية دعا ecdysteroids. معصب هذه الأجهزة ecdysteroidogenic من الجهاز العصبي، والتي يتم من خلالها تؤثر على توقيت الحيوي عن طريق الاشارات البيئية. نحن هنا وصف بروتوكول لتصور أجهزة ecdysteroidogenic والأجهزة التفاعلية في اليرقات والكبار من ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة، والتي توفر نظام نموذج مناسب لدراسة هرمون الستيرويد الحيوي والآلية التنظيمية لها. تشريح ماهرا يسمح لنا للحفاظ على مناصب أجهزة ecdysteroidogenic وأعضائهم التفاعلية بما في ذلك الدماغ، الحبل العصبي البطني، والأنسجة الأخرى. المناعية معntibodies ضد الإنزيمات ecdysteroidogenic، جنبا إلى جنب مع البروتينات مضان المعدلة وراثيا يقودها المروجين الأنسجة محددة، وتتوفر لتسمية الخلايا ecdysteroidogenic. وعلاوة على ذلك، فإن innervations الأجهزة ecdysteroidogenic يمكن أيضا أن يكون المسمى من قبل الأجسام المضادة محددة أو مجموعة من السائقين GAL4 في أنواع مختلفة من الخلايا العصبية. ولذلك، فإن أجهزة ecdysteroidogenic وصلاتهم العصبية يمكن تصور في وقت واحد من قبل المناعية والتقنيات المعدلة وراثيا. وأخيرا، نحن تصف كيفية تصور الخلايا الجذعية سلالة الجرثومية، التي انتشار الأسلحة النووية وصيانة تسيطر عليها ecdysteroids. هذه الطريقة تساهم في فهم شامل من الستيرويد الحيوي الهرمونات وآلية تنظيمية العصبية لها.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في الكائنات متعددة الخلايا، وهبت مجموعة من الخلايا مع وظيفة متخصصة في نشاطها الحيوي الذي لا غنى عنه للجسم كله. لإنجاز مهامهم، كل النسيج أو العضو يعبر عن سلسلة من الجينات ذات الصلة بمهامهم والتواصل مع الأنسجة الأخرى لتنظيم أنشطتها في سياق التنمية. لتوصيف هذه الوظائف الخلوية المتخصصة والتفاعل بين الأجهزة، ونحن بحاجة إلى تحديد مجموعة من الخلايا جنبا إلى جنب مع إبقائهم أنواع أخرى من الخلايا سليمة في العمارة متعددة الخلايا.

وأحد الأمثلة على هذه الأجهزة المتخصصة هو عضو الستيرويدي المنشأ، حيث تتوسط العديد من الإنزيمات السكروز الخطوات التحويل من الكولسترول لهرمونات الستيرويد نشطة 1. وأعرب معظم هذه الجينات انزيم تحديدا في أجهزة الستيرويدي المنشأ، ويتم تنظيم المسار الحيوي بإحكام من قبل العديد من مؤثرات الخارجية من خلال المدخلات الخلطية والمدخلات العصبية. ذات مرةتفرز توليفها، هرمونات الستيرويد في الدملمف وتستهدف العديد من الأنسجة والأعضاء لتنظيم التعبير عن مجموعة متنوعة من الجينات 2. ولذلك، فإن عمل هرمون منشط يؤدي الى استجابة نظامية للحفاظ على التوازن والنمو والتكاثر.

للتحقيق في وظائف الستيرويد هرمون الحيوي والإجراءات عديد المظاهر من هرمونات الستيرويد، ذبابة الفاكهة يمكن استخدامها كنظام نموذج مناسب. خلال مراحل اليرقات والحشرات هرمون منشط، ecdysteroid، وbiosynthesized في جهاز الغدد الصماء المتخصصة تسمى الغدة prothoracic (PG) 3. في PG، عدة إنزيمات ecdysteroidogenic تحفز على وجه التحديد الخطوات تحويل متعددة من الكولسترول إلى إكديسون، التي تسيطر على طرح الريش والتحول في المراحل التنموية المناسبة 4. لذلك، وينظم تغيير ديناميكية في عيار ecdysteroidمن قبل العديد من مسارات الإشارات في استجابة لمنبهات البيئية. من ناحية أخرى، في مرحلة البلوغ، ecdysteroid يلعب أدوار أساسية في علم وظائف الأعضاء، بما في ذلك الاستنساخ، والنوم، والذاكرة، وعمر 5 و 6 و 7 و 8. ومن المعروف أن ecdysteroid وbiosynthesized بنشاط في المبيض، وتنظيم تطور مراحل تكوين البويضات 6، 7، 8، 9، 10، 11. مؤخرا قمنا ذكرت أن عدد الخلايا الجذعية سلالة الجرثومية (GSCs) يتأثر ecdysteroid والجنس إشارة الببتيد ردا على التزاوج المحفزات 12.

أدوات قوية من D. البطن الوراثة وبيولوجيا الخلايا، بما في ذلك معلومات الجينوم مشروحة بشكل جيد، الجينات ثنائيوقد مكنت أنظمة التعبير، وتقنيات رني المعدلة وراثيا، لنا لتحديد الجينات الضرورية لecdysteroid الحيوي في PG والمبيض 13 و 14 و 15. وبمجرد تحديد الجينات ecdysteroidogenic، وتنظيم النسخي من هذه الجينات وتعريب الديناميكية للمنتجات الجين يمكن فحص في التركيب الحيوي المسار 16. لهذا الغرض، الكمي للعكس النسخ-PCR، وتجرى RNA التهجين في الموقع، وتحليل immunohistological. ويشمل تطبيق هذه التقنيات مهمة صعبة. تشريح مفصل من PG أو المبيض. على وجه الخصوص، PG من ذبابة الفاكهة هو أصغر نسبيا من تلك الحشرات الأخرى (مثل دودة القز ويطير ضربة)، لذلك يحتاج إلى ممارسة مهارة حيوية من ذبابة الفاكهة تشريح لأخذ العينات. وعلاوة على ذلك، تحصل كل من أجهزة ecdysteroidogenic تعصيبالصورة من الجهاز العصبي المركزي (CNS) 17، 18، 19، 20. وهكذا، على التحليلات التشريحية دقيقة، يجب أن تبقى أجهزة ecdysteroidogenic سليمة مع الجهاز العصبي المركزي وغيرها من الأجهزة، وليس لعرقلة صلاتهم العصبية.

هنا نقدم بروتوكولات للتشريح والتصور من أجهزة الستيرويدي المنشأ في D. البطن. تعلم تقنية تشريح هو نقطة الانطلاق الرئيسية لهذه التجارب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للمرء أن تسمية بنجاح أجهزة الستيرويدي المنشأ وكذلك أعضائهم تفاعلية مع العديد من الأجسام المضادة وخطوط السائق GAL4. الاستفادة من هذه التقنيات، والمواد، وعلم الوراثة، ويمكن للمرء أن دراسة آليات شاملة من الستيرويد هرمون الحيوي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يتم عرض المخطط العام للبروتوكولات في الشكل 1.

1. تشريح اليرقات حلقة الغدة (RG)

ملاحظة: في D. البطن، الذي ينتمي إلى ذوات الجناحين cyclorrhaphous، وPG هو داخل الغدد الصماء جهاز مركب يسمى حلقة غدة (RG، الشكل 2D). وبما أنه من غير مجد أن PG يتم فصل جراحيا من أنواع أخرى من الخلايا (مناقشته لاحقا)، والهدف العملي هو عزل وسليمة، RG التالفة عن طريق تشريح.

  1. إعداد اليرقات في المراحل التنموية المناسبة
    ملاحظة: لمزامنة مراحل تطور D. البطن اليرقات، فمن الضروري جمع البيض ضمن إطار ضيق الوقت وجمع اليرقات في الأوقات المناسبة.
    1. وجمع البيض لمدة 2 ساعة على لوحة أجار العنب عصير عند 25 درجة مئوية.
    2. جمع حديثا تحاك 1 شارع الطور اليرقات تحت المجهر تشريح مع ملقط ونقلها إلى قارورة صغيرة تحتوي على المهروسة القياسية الخميرة / الذرة الغذاء الطاير.
      ملاحظة: يتم تمثيل سن اليرقات "بعد ساعات على وضع البيض (حائل)"، "بعد ساعات من فتحه (ههه)"، أو "ساعة بعد L3 انسلاخ (hAL3E)".
    3. في نقطة زمنية مناسبة، وجمع اليرقات نظموا مع حلقة من البلاستيك القابل للتصرف لتجنب الإصابة غير مرغوب فيها. لتقليل الفارق في التقدم التنموي من اليرقات طور مرحلي 3 الثالثة، وجمع يرقات العمر 2 الثانية في 70 حائل (48 ههه) والسماح لهم تساقط في فترات ح 2. ثم، وجمع اليرقات طور مرحلي 3 الثالثة في غضون 2 ساعة بعد انسلاخ L3. هذا الإجراء يعطي 0-2 hAL3E اليرقات.
    4. نقل اليرقات نظموا إلى طبق مليئة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
    5. شطف اليرقات مع PBS لإزالة المواد الغذائية المتبقية من الجسم.
  2. تشريح الخشنة من اليرقات تحتتشريح المجهر
    1. عقد ربط فم اليرقة مع ملقط. قطع الجسم اليرقات في الثلث الأمامي من طول الجسم باستخدام المقص الصغير.
    2. عقد نهاية قطع من الجسم اليرقات الأمامي مع زوج واحد من الملقط. استخدام زوج آخر من ملقط، ودفع بلطف غيض من اتجه نحو داخل الجسم. هذا الإجراء يحول الجسم اليرقات الداخل الى الخارج.
      ملاحظة: يمكن تخطي هذه الخطوة لتشريح 1 شارع الطور اليرقات.
    3. كرر الخطوات 1.2.1-1.2.2 مع يرقات إضافية لمدة 5-10 دقائق.
      ملاحظة: يجب أن يكون عدد اليرقات يساوي أو أقل من 20 لتوفير الوقت للتشريح.
  3. تشريح شرائح اليرقات
    ملاحظة: هذه الطريقة تسمح الحفاظ على موقف الأنسجة لتبقى سليمة.
    1. ترك اليرقات في الماء فقط لمدة 1 ساعة. ويجمد اليرقات بسبب الاختناق.
    2. وضع الجانب الظهري يرقة في قطرة من برنامج تلفزيوني على المغلفة السيليكونطبق، مع ما يصل الجانب الظهري.
      ملاحظة: الجانب الظهري ديه 2 أنابيب القصبة الهوائية تشغيل طوليا.
    3. تحت المجهر تشريح، إدراج دبوس الحشرات في تلميح الأمامي لليرقة باستخدام ملقط. تمتد الجسم اليرقات إلى الجانب الخلفي ووضع دبوس الثاني إلى الطرف الخلفي من يرقة.
      ملاحظة: بالإضافة إلى دبابيس الحشرات، إبرة مصنوعة من أسلاك التنجستن يمكن أن يكون مفيدا 21. إبرة يمكن أن تكون جزءا لا يتجزأ في طرف ماصة من خلال التسخين لاستخدامها بوصفها إبرة تشريح.
    4. تحت المجهر تشريح، وجعل شق صغير بالقرب من الذيل مع مقص الجزئي. من شق، وقطع بشرة الظهرية طوليا على طول خط الوسط الظهرية نحو الرأس. يجب الحرص على عدم تلف الأنسجة تحت بشرة.
    5. تمتد بشرة bodywall على كل جانب ومكان 4 دبابيس في كل ركن من أركان bodywall تشريح.
    6. إزالة جزء من الأمامية الدهون في الجسم مع ملقط، لفضح الدماغ RG جomplex تتعرض على السطح. إزالة زوج من الغدد اللعابية، إذا لزم الأمر.
  4. تثبيت وتلوين الأنسجة مع المناعية
    1. وضع الثلث الأمامي من الهيئات اليرقات (الخطوة 1.2.2) في microtube 1.5 مل مليئة 500 ميكرولتر الحل الإصلاح (4٪ امتصاص العرق في PBS). إصلاح أقل من 20 عينة في وقت واحد، وإلا PBS تعلق على عينات ثابتة قد تتسبب في التخفيف من غير المواتية تثبيتي. لتشريح شرائح، وإزالة قطرة من برنامج تلفزيوني ثم قم بإضافة قطرة من حل الإصلاح.
      ملاحظة: للحصول على حل الإصلاح، إما 3.7٪ الفورمالديهايد أو 4٪ امتصاص العرق ويمكن استخدام.
    2. احتضان الأنسجة تشريح في حل الإصلاح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو بدلا من ذلك لمدة 2 ساعة عند 4 درجات مئوية.
    3. استبدال حل الإصلاح مع 500 ميكرولتر PBS وبسرعة شطف العينات 3 مرات. غسل العينات مع 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT (PBS + 0.3٪ octylphenol ethoxylate) لمدة 15 دقيقة على الكرسي الهزاز في RT. لتشريح شرائح، وإزالة المسامير الحشرات ونقل العينات إلى 1.5 مل microtube.
      ملاحظة: للحصول على زيادة نفاذية الأجسام المضادة في الأنسجة، ويتم التعامل مع العينات مع 500 ميكرولتر 2.0٪ PBT لمدة 1-2 ساعة على الكرسي الهزاز في RT.
    4. استبدال PBT مع 500 ميكرولتر عرقلة الحل (2٪ ألبومين المصل البقري في PBT). احتضان هذه العينات لمدة 1.5 ساعة على الكرسي الهزاز في RT.
    5. استبدال حل حجب مع 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الأولية، أي الأجسام المضادة المخفف في عرقلة الحل.
    6. احتضان هذه العينات بين عشية وضحاها على الكرسي الهزاز في 4 درجات مئوية.
    7. استبدال حل الأجسام المضادة الأولية مع 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT وبسرعة شطف عينات 5 مرات. غسل العينات 3 مرات مع 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT لمدة 15 دقيقة كل يوم الروك في RT.
    8. استبدال 0.3٪ PBT مع 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الثانوية (الأجسام المضادة صبغ مترافق المخفف في عرقلة الحل). لتلطيخ النووي، 0.5 ميكرولتر 4، 6 diamidino-(دابي، / 0.1 ملغ مل حل الأسهم) يضاف 2-phenylindole إلى 50 ميكرولتر حل. احتضان هذه العينات على الكرسي الهزاز لمدة 2 ساعة عند RT أو بدلا من ذلك في 4 درجات مئوية خلال الليل.
      ملاحظة: حافظ على عينات في الظلام.
    9. استبدال حل الأجسام المضادة مع 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT وشطف 5 مرات. غسل العينات 3 مرات مع 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT لمدة 15 دقيقة لكل منهما في RT.
  5. تشريح غرامة من مجمع الدماغ RG التي تحتوي على PG وتصاعد
    1. استخدام الماصة المتاح لنقل العينات immunostained إلى صحن مليء 0.3٪ PBT.
      ملاحظة: لتجنب الفقاعات غير مريح أثناء تشريح والتركيب، يمكن استبدال 0.3٪ PBT مع برنامج تلفزيوني.
    2. تشريح تحت المجهر، مع الاستمرار على بشرة أو الفم ربط مع زوج واحد من الملقط. باستخدام إبرة 27 G تعلق على حقنة 1 مل ك "سكين"، وقطع رأس الأمامي من المريء والعين أقراص لإزالة مجمع القرص الدماغ RG-العين من بشرة الجسم.
    3. سيبامعدل المريء والأمعاء من مجمع القرص الدماغ RG-العين مع ملقط. منذ المريء يمر من خلال الدماغ فوق الحبل العصبي البطني (VNC)، سحب الأمعاء إلى الجانب الخلفي.
      ملاحظة: لإزالة أقراص تخيلي إضافية من العينات، وقطع الاتصالات بين الدماغ، وأقراص العين، وأقراص الساق بسكين الإبرة.
    4. كرر الخطوات 1.5.1-1.5.4 لعينات أخرى.
      ملاحظة: لمنع الحطام الأنسجة من الالتصاق للعينات، ونقل كل عينة الانتهاء إلى طبق نظيف مختلفة مليئة 0.3٪ PBT أو برنامج تلفزيوني.
    5. نقل العينات إلى مركز شريحة زجاجية نظيفة مع micropipette.
      ملاحظة: للحصول على الثانية 2 أو 3 طور مرحلي الثالثة اليرقات، ويجب أن يتم اقتطاعها نهاية تلميح micropipette بشفرة حلاقة.
    6. تحت المجهر تشريح، محاذاة عينات فردية مع الجانب الظهري امرهم باستخدام ملقط.
      ملاحظة: يقع RG على الجانب الظهري من الدماغ (الشكل 2A). هذا التوافق تسهل مواصفات العينات الفردية أثناء التصوير.
    7. إمالة شريحة زجاجية وتمحو الكثير من فائض PBT وقت ممكن. وضعت قطرة من كاشف متزايدة على جانب من الشريحة. ضع حافة الانزلاق غطاء من الجانب الآخر من الانخفاض، ووضع انزلاق الغطاء على عينات ببطء مع ملقط.
      ملاحظة: هذا الإجراء يمنع عينات من التحرك خارج انزلاق الغطاء.
    8. تخزين العينات في 4 درجات مئوية. الحفاظ على العينات في الظلام.

2. تشريح المبيض في الإناث الكبار

  1. إعداد الإناث البالغات
    1. تغذية أنثى الذباب مع الطعام ذبابة الخميرة / الذرة القياسي لمدة 3-4 أيام لتسمين حتى المبيض. الحفاظ على درجة حرارة 25 درجة مئوية.
  2. تشريح المبيض البالغات
    1. تخدير أنثى الذباب مع غاز CO 2 وقطعت رؤوسهم.
    2. نقل جثث يطير إلى طبق 3 سممليئة PBS.
    3. تحت المجهر تشريح، عقد القفص الصدري على الجانب الظهري باستخدام ملقط. فهم A5 جزء البطن أو A6 مع ملقط الأخرى وقشر بعيدا عن بشرة البطن نحو الجانب الخلفي. تمحو بشرة لزجة من غيض من الملقط.
    4. قرصة إلى قناة البيض واخراج المبيض من الجسم.
    5. تمشيط ونشر نصائح من المبيض مع ملقط.
      ملاحظة: هذه العملية تحسن كفاءة المناعية.
  3. تشريح الدماغ البالغات، VNC والأعضاء التناسلية.
    ملاحظة: يسمح هذا الأسلوب تعصيب من المبيض إلى أن تبقى على حالها.
    1. تخدير أنثى الذباب مع غاز CO 2 ونقلها إلى طبق المغلفة السيليكون مليئة PBS.
    2. تحت المجهر تشريح، عقد خرطوم وقشر بعيدا بشرة الرأس لفضح الدماغ مع ملقط. إزالة القصبة الهوائية التي تعلق على الدماغ.
      ملاحظة: المخن هو بنية بيضاء ومدورة. الدماغ يتصل VNC في الصدر.
    3. عقد القفص الصدري على الجانب الظهري وقطع الأرجل والأجنحة مع زوج واحد من الملقط. استخدام زوج آخر من الملقط، قشر بعيدا الصدر بطني بشرة من الأسس التي قامت عليها الساقين. مرة واحدة يتعرض VNC، وإزالة إهاب الظهرية المتبقية والعضلات التي تعلق على VNC باستخدام ملقط. يجب الحرص على عدم الإضرار اتصال بين الدماغ وVNC.
    4. استخدام ملقط لقشر بعيدا بشرة البطن وفضح المبيض والأجهزة التفاعلية الخاصة بما في ذلك الخلايا العصبية، والمحاصيل، والأمعاء، قناة البيض، والرحم، والغدة ثانوي.
    5. إزالة الأنسجة المتبقية بما في ذلك القصبة الهوائية والدهون في الجسم باستخدام ملقط.
  4. تثبيت وتلوين الأنسجة مع المناعية
    1. نقل ما يقرب من 8-10 أزواج من المبيض إلى microtube 1.5 مل مليئة 250 ميكرولتر الحل الإصلاح (4٪ paraformaldehyde في برنامج تلفزيوني)، واحتضان العينات لمدة 30 دقيقة في RT.
    2. استبدال حل الإصلاح مع 500 ميكرولتر PBS وبسرعة شطف العينات 3 مرات.
    3. غسل العينات 2 مرات مع 500 ميكرولتر 0.1٪ PBT لمدة 5 دقائق كل في RT.
    4. استبدال PBT مع 50 ميكرولتر عرقلة الحل. احتضان هذه العينات لمدة 1 ساعة على الكرسي الهزاز في RT.
    5. استبدال حل حجب مع 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الأولية.
    6. احتضان هذه العينات بين عشية وضحاها على الكرسي الهزاز في 4 درجات مئوية.
    7. استبدال حل الأجسام المضادة الأولية مع 500 ميكرولتر 0.1٪ PBT. غسل العينات 3 مرات مع 500 ميكرولتر 0.1٪ PBT لمدة 15 دقيقة كل يوم الروك في RT.
    8. استبدال 0.1٪ PBT مع 50 ميكرولتر حل الأجسام المضادة الثانوية. لتلطيخ النووي، إضافة 0.5 ميكرولتر دابي إلى 50 ميكرولتر الحل. احتضان هذه العينات لمدة 2 ساعة على الكرسي الهزاز في RT.
    9. استبدال حل الأجسام المضادة الثانوية مع 500 ميكرولتر 0.1٪ PBT. غسل العينات 3 مرات مع 500 ميكرولتر 0.1٪ PBT لمدة 15 دقيقة كل يوم الروك في RT.
      ملاحظة: يمكن أن يتم إجراء الغسيل في 4 درجات مئوية خلال الليل. الحفاظ على العينات في الظلام.
  5. تركيب عينات على الشرائح الزجاجية
    1. نقل العينات إلى شريحة زجاجية مع 0.1٪ PBT باستخدام micropipette.
      ملاحظة: لتجنب الفقاعات غير مريح أثناء تشريح والتركيب، يمكن استبدال 0.1٪ PBT مع برنامج تلفزيوني.
    2. لالمبيض، فصل سلاسل من ovarioles عن بعضها البعض مع ملقط تشريح تحت المجهر. لا تجرح نصائح من ovarioles تحتوي على germaria. للمجمع الجهاز الدماغ VNC الإنجاب، وإزالة إهاب المتبقية وترتيب الوضع على شريحة زجاجية.
    3. تمحو الكثير من فائض PBT وقت ممكن وضعت قطرة من كاشف تصاعد في وسط العينات. ضع زلة غطاء باستخدام ملقط ببطء.
    4. تخزين العينات في 4 درجات مئوية. الحفاظ على العينات في الظلام.
"> 3. التصوير الضوئي مع مجهر متحد البؤر الليزر

  1. مراقبة العينات تحت المجهر وجلب أجهزة الستيرويدي المنشأ في مجال الرؤية. مرة واحدة يتم إصلاح الرأي، تبديل نظام التصوير لوضع الحصول على الصور.
    ملاحظة: يتم استخدام العدسات الهدف 10-20X للحصول على صور للمجمع الدماغ RG أو المبيض كله. بدلا من ذلك، يتم استخدام 40-63X العدسات الهدف (الماء أو غمر النفط) لتصور توطين التحت خلوية من البروتينات في GSCs أو innervations العصبية من PG والمبيض.
  2. إعداد المعلمات الحصول على الصور على البرنامج المرفق. حدد مجموعة من مضان (مثل GFP وRFP). قبل إجراء مسح سريع، وضبط قوة الليزر، وحساسية للكشف عن (ربح / الأوفست)، وحجم الثقب.
    ملاحظة: للحصول على الصور في ذات جودة عالية، ينبغي أن يكون الأمثل قوة المسح بالليزر وحساسية كاشف (كسب) لكل عينة. لتلخيص الشكلمن الأنسجة، وتنتقل عن طريق الضوء صورة يمكن اتخاذها بالإضافة إلى صورة الفلورسنت.
  3. خذ مداخن Z من الصور. أثناء فحص سريع متواصل، تحريك الطائرة التنسيق مع محرك تركيز المجهر وتعيين موضع البداية ونهاية الموقف. يتم ضبط عدد من شرائح والمسافة الفاصلة بين شرائح وفقا لذلك.
  4. تحديد سرعة المسح الضوئي، وطريقة المسح الضوئي، ووضع المسح الضوئي ثنائي الاتجاه.
  5. "ابدأ بمسح حقيقية" للالحصول على الصور.
  6. حفظ الصورة مع تنسيق البرامج المرفقة.
    ملاحظة: ملفات الصور الأصلية تحتوي على معلومات من المعلمات الحصول على الصور والمقاييس. صور المصدرة يمكن معالجتها باستخدام برامج معالجة الصور على الكمبيوتر 22.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كنا البروتوكولات المذكورة أعلاه لتصور أجهزة الستيرويدي المنشأ والأجهزة التفاعلية في D. اليرقات البطن والكبار الإناث. يتم عرض الخطة الشاملة للبروتوكولات في الشكل 1.

وRG، بما في ذلك PG (الشكل 2D)، هي أصغر حجما وأكثر شفافية من الدماغ، ويقع في الجانب الأمامي الظهري من الدماغ (الشكل 2A-C و3A-E). لتسمية الخلايا PG، عدة مجموعات قد ولدت أنواع مختلفة من الأجسام المضادة ضد الإنزي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

درسنا الحيوي ecdysteroid وآلية تنظيمية في D. البطن، وضعت بروتوكولا للتشريح والمناعية. يتأثر توقيت الحيوي ecdysteroid بواسطة منبهات البيئية من خلال المدخلات العصبية 33، ولذلك فمن الضروري الحفاظ على تعصيب الأجهزة ecdysteroidogenic جنبا إلى جنب مع الدماغ، VNC، والأنسجة الأخرى أثناء تشريح.

كما هو موضح أعلاه، D. البطن PG يشكل RG معقدة الغدد الصماء الجهاز مع allata المجاميع (CA...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لم يعلن عن تضارب المصالح.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر ريكو كايس وTomotsune Ameku حصول على الدعم الفني من أجل هذا العمل. ونحن ممتنون أيضا للكي إيتو، أولغا أليكسينكو، أكيكو كوتو، ماسايوكي ميورا، مركز الأوراق المالية بلومينغتون ذبابة الفاكهة، مركز اسهم كيوتو (DGRC)، وبنك دراسات الإنمائية هجين للأسهم والكواشف. وأيد هذا العمل عن طريق منح ل YSN من JSPS KAKENHI غرانت عدد 16K20945، ومؤسسة نايتو، وجائزة البحث العلمي اينو. ومنحة لRN من MEXT KAKENHI غرانت عدد 16H04792.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<مجموعة > بيض قوية< / طبق ثقافة الأنسجة القوي >
(55 مم)AS ONE1-8549-02  ؛ لكوب جمع أطباق أجار عصير العنب
الخميرة HIKARI KAGAKU
الخميرة الشرقية الجافة ، طوكيو
100٪ عصيرالعنب Welch Food Inc.
<يرقات قوية > تربية < / قوارير قوية >
صغيرة (12 مل ، 40 مرة ؛ 23.5 مم ، PS)SARSTEDT58.487
حلقة يمكن التخلصمنها AS ONE6-488-01
طبابقياسي   ؛ ال recepi لنا على الموقع الإلكتروني لمركز بلوينغتون للأوراق المالية.
<قوي > تشريح < / تشريح قوي >
مجهركارل زايسستيمي 2000-C
LeicaS8 AP0
طبق زراعة الأنسجة (35 × 10 مم ، غير معالج)IWAKI1000-035
SylgardTORAYcoarting silicon داخل الأطباق
إبرة Terumo (27 جم ، 0.40 × 19 مم) TERUMONN-2719S"سكين" لقطع
ملقط الأنسجة ، Inox ، # 5Dumont ، سويسرا
دبوس حشرات (قطره 0.18 مم)ماركة Shigaلمقص
تشريح شرائح الشرائحNATSUME SEISAKUSHO CO LTD.   ؛MB-50-10<
قوي>تثبيت< / قوي >
عالي النقاء ماءميرك ميليبور
فوسفات مخزن محلول ملحي (PBS)
الفورمالديهايدناكالاي tesque16222-65
ParaformaldehydeNacalai tesque02890-45
Triton-X100Nacalai tesque35501-15
أنابيب دقيقة (1.5 مل)INA OPTIKACF-0150
Incubation< / قوي> كخلاط
واحد سويست TM-300 (هزاز)كواحدTM-300هزاز
مصل البقر الألبومينSIGMA9048-46-8
<قوي > جسم مضاد أساسي < قوي>قوي
مضاد ل Sro (خنزير غينيا) ، 1: 1000
مضاد ل GFP (أرنب) ، 1: 1000مجسات جزيئيةA6455Shimada-Niwa و Niwa ، 2014
anti-GFP (ماوس mAb ، GF200) ، 1: 100Nakarai tesque04363-66
anti-5HT (أرنب) ، 1: 500SIGMAS5545
مضاد ل Hts 1B1 (فأر) دراساتالتنموية بنك الورم الهجين (DSHB)1B1
مضاد ل DE-cadherin (فأر) ، 1:20DSHBDCAD2
مضاد ل nc82 (فأر) ، 1:50DSHBnc82
<قوي > جسم مضاد ثانوي < / قوي >
الماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، Alexa Fluor 488 مترافقتقنيات الحياةA-11008
الجسم المضاد الثانوي للماعز المضاد للفأر IgG (H + L) ، Alexa Fluor 488 ConjugateLife TechnologiesA-11001
الماعز المضاد للفئران IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، Alexa Fluor 546 ConjugateLife TechnologiesA-11081
الماعز المضاد لخنزير غينيا IgG (H + L) الجسم المضاد الثانوي ، Alexa Fluor 555 المترافقLife TechnologiesA-21435
Alexa Fluor 546 القضيبين المترافقبالصبغة Life التقنياتA-22283
< قوية > تصاعد الكواشف < / قوي >
مايكرو شريحة الزجاجماتسونامي الزجاج المحدودةSS7213
غطاء مجهر مربع زجاجماتسونامي الزجاج الصناعي المحدودةكاشف C218181
FluorSave (كاشف متصاعد) ماصةنقل 345789Calbiochem
1 مل (قطارة يمكن التخلص منها)WATSON5660-222-1S
<قوي > تصوير < / قوي >
LSM700 نظام مجهر المسح الضوئي بالليزرCarl Zeissمقلوب Axio Observer. Z1 SP اليسار
< قوي > معالجة الصور < / قوي >
LSM700 ZENكارل زايسإنها واجهة مستخدم خاصة تعتمد على نظام التشغيل Microsoft Windows7 64 بت
ImageJ
< strong > Fly stocks < / strong >
w ؛ GMR45C06-GAL4  من مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة. (# 46260)
UAS– الحزب الجمهوري الخاص. UAS– mCD8 :: هدايا GFPمن K. Ito ، جامعة طوكيو.
ث [1118]
ث ؛ phantom-GAL4 # 22 / UAS-turboRFP
ث ؛ UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4انظر في المرجع 29 ، Alekseyenko ، O. V ، Lee ، C. & amp كرافيتز ، إي إيه (2010)
ث ؛ UAS-mCD8::GFP  من مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة. (# 32188)
yw;; nSyb-GAL4  من مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة. (# 51941)
معجون تشريح مجهر

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Miller, W. L., Auchus, R. J. The Molecular Biology, Biochemistry, and Physiology of Human Steroidogenesis and Its Disorders. Endocr. Rev. 32 (1), 81-151 (2011).
  2. Rousseau, G. G. Fifty years ago: The quest for steroid hormone receptors. Mol. Cell. Endocrinol. 375 (1), 10-13 (2013).
  3. Gilbert, L. I., Rybczynski, R., Warren, J. T. Control and biochemical nature of the ecdysteroidogenic pathway. Annu. Rev. Entomol. 47, 883-916 (2002).
  4. Niwa, R., Niwa, Y. S. Enzymes for ecdysteroid biosynthesis: their biological functions in insects and beyond. Biosci. Biotechnol. Biochem. 78 (8), 1283-1292 (2014).
  5. Kozlova, T., Thummel, C. S. Steroid regulation of postembryonic development and reproduction in drosophila. Trends Endocrinol. Metab. 11 (7), 276-280 (2000).
  6. Ishimoto, H., Kitamoto, T. Beyond molting-roles of the steroid molting hormone ecdysone in regulation of memory and sleep in adult Drosophila. Fly. 5 (3), 215-220 (2011).
  7. Ishimoto, H., Sakai, T., Kitamoto, T. Ecdysone signaling regulates the formation of long-term courtship memory in adult Drosophila melanogaster. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 106 (15), 6381-6386 (2009).
  8. Simon, A. F., Shih, C., Mack, A., Benzer, S. Steroid control of longevity in Drosophila melanogaster. Science. 299 (5611), 1407-1410 (2003).
  9. Buszczak, M., Freeman, M. R., Carlson, J. R., Bender, M., Cooley, L., Segraves, W. a Ecdysone response genes govern egg chamber development during mid-oogenesis in Drosophila. Development. 126 (20), 4581-4589 (1999).
  10. Carney, G. E., Bender, M. The drosophila ecdysone receptor (EcR) gene is required maternally for normal oogenesis. Genetics. 154 (3), 1203-1211 (2000).
  11. Uryu, O., Ameku, T., Niwa, R. Recent progress in understanding the role of ecdysteroids in adult insects: Germline development and circadian clock in the fruit fly Drosophila melanogaster. Zoological Lett. 1, 32(2015).
  12. Ameku, T., Niwa, R. Mating-Induced Increase in Germline Stem Cells via the Neuroendocrine System in Female Drosophila. PLOS Genet. 12 (6), e1006123(2016).
  13. Danielsen, E. T., et al. A Drosophila Genome-Wide Screen Identifies Regulators of Steroid Hormone Production and Developmental Timing. Dev. Cell. 37 (6), 558-570 (2016).
  14. Ou, Q., Zeng, J., Yamanaka, N., Brakken-Thal, C., O'Connor, M. B., King-Jones, K. The Insect Prothoracic Gland as a Model for Steroid Hormone Biosynthesis and Regulation. Cell Rep. , (2016).
  15. Yamanaka, N., Rewitz, K. F., O'Connor, M. B. Ecdysone control of developmental transitions: lessons from Drosophila research. Annu. Rev. Entomol. 58, 497-516 (2013).
  16. Niwa, Y. S., Niwa, R. Transcriptional regulation of insect steroid hormone biosynthesis and its role in controlling timing of molting and metamorphosis. Dev. Growth Differ. 58, 94-105 (2015).
  17. Monastirioti, M. Distinct octopamine cell population residing in the CNS abdominal ganglion controls ovulation in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 264 (1), 38-49 (2003).
  18. Siegmund, T., Korge, G. Innervation of the ring gland of Drosophila melanogaster. J. Comp. Neurol. 431 (4), 481-491 (2001).
  19. McBrayer, Z., et al. Prothoracicotropic Hormone Regulates Developmental Timing and Body Size in Drosophila. Dev. Cell. 13 (6), 857-871 (1979).
  20. Shimada-Niwa, Y., Niwa, R. Serotonergic neurons respond to nutrients and regulate the timing of steroid hormone biosynthesis in Drosophila. Nat. Commun. 5, 5778(2014).
  21. Brady, J. A simple technique for making very fine, durable dissecting needles by sharpening tungsten wire electrolytically. Bull World Health Organ. 32 (1), 143-144 (1965).
  22. Abramoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics Int. 11 (7), 36-42 (2004).
  23. Ohhara, Y., et al. Autocrine regulation of ecdysone synthesis by β3-octopamine receptor in the prothoracic gland is essential for Drosophila metamorphosis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 112 (5), 1452-1457 (2015).
  24. Gibbens, Y. Y., Warren, J. T., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. Neuroendocrine regulation of Drosophila metamorphosis requires TGFbeta/Activin signaling. Development. 138 (13), 2693-2703 (2011).
  25. Parvy, J. P., et al. A role for βFTZ-F1 in regulating ecdysteroid titers during post-embryonic development in Drosophila melanogaster. Dev. Biol. 282 (1), 84-94 (2005).
  26. Parvy, J. -P., et al. Forward and feedback regulation of cyclic steroid production in Drosophila melanogaster. Development. 141 (20), 3955-3965 (2014).
  27. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
  28. Rewitz, K. F., Yamanaka, N., Gilbert, L. I., O'Connor, M. B. The Insect Neuropeptide PTTH Activates Receptor Tyrosine Kinase Torso to Initiate Metamorphosis. Science. 326 (5958), 1403-1405 (2009).
  29. Li, H. -H., et al. A GAL4 driver resource for developmental and behavioral studies on the larval CNS of Drosophila. Cell Rep. 8 (3), 897-908 (2014).
  30. Alekseyenko, O. V., Lee, C., Kravitz, E. A. Targeted manipulation of serotonergic neurotransmission affects the escalation of aggression in adult male Drosophila melanogaster. PLOS One. 5 (5), e10806(2010).
  31. Domanitskaya, E., Anllo, L., Schüpbach, T. Phantom, a cytochrome P450 enzyme essential for ecdysone biosynthesis, plays a critical role in the control of border cell migration in in Drosophila. Dev. Biol. 386 (2), 408-418 (2014).
  32. Song, X., Zhu, C. -H., Doan, C., Xie, T. Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches. Science. 296 (5574), 1855-1857 (2002).
  33. Niwa, Y. S., Niwa, R. Neural control of steroid hormone biosynthesis during development in the fruit fly Drosophila melanogaster. Genes Genet. Syst. 89 (1), 27-34 (2014).
  34. Yoshiyama-Yanagawa, T., et al. The conserved Rieske oxygenase DAF-36/Neverland is a novel cholesterol-metabolizing enzyme. J. Biol. Chem. 286 (29), 25756-25762 (2011).
  35. Niwa, R., et al. Non-molting glossy/shroud encodes a short-chain dehydrogenase/reductase that functions in the "Black Box" of the ecdysteroid biosynthesis pathway. Development. 137 (12), 1991-1999 (2010).
  36. Komura-Kawa, T., et al. The Drosophila Zinc Finger Transcription Factor Ouija Board Controls Ecdysteroid Biosynthesis through Specific Regulation of spookier. PLOS Genet. 11 (12), e1005712(2015).
  37. Yamanaka, N., Marqués, G., O'Connor, M. B. Vesicle-Mediated Steroid Hormone Secretion in Drosophila melanogaster. Cell. 163 (4), 907-919 (2015).
  38. Riemensperger, T., Pech, U., Dipt, S., Fiala, A. Optical calcium imaging in the nervous system of Drosophila melanogaster. BBA-Gen. Subjects. 1820 (8), 1169-1178 (2012).
  39. Owald, D., Lin, S., Waddell, S. Light, heat, action: neural control of fruit fly behavior. Phil. T. Roy. Soc. B. 370 (1677), 20140211(2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Drosophila MelanogasterSteroidogenic OrgansImmunostaining ProtocolLarval DissectionOvary VisualizationBrain Ring GlandEcdysteroid BiosynthesisGermline Stem CellsNeuronal InnervationFluorescent Labeling

Related Articles