مقالة منهجية

في المختبر التصوير والكمي لاستهداف الكفاءة المخدرات من النظائر نره Fluorescently إعتبر

DOI:

10.3791/55529

⸱

مارس 21, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1MTA-SE Pathobiochemistry Research Group, Semmelweis University, 2Department of Medical Chemistry, Molecular Biology and Pathobiochemistry, Semmelweis University, 3MTA-ELTE Research Group of Peptide Chemistry, Eötvös Loránd University

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وصفت بشكل انتقائي نيون نره-I،-II و-III المشتقات هي أدوات موثوقة لتتبع وقياس امتصاص الخلوية الخاصة بهم. هذه المخطوطة يقدم تجارب لتصور وقياس ومقارنة كفاءة امتصاص هذه تقارن نره في خطوط الخلايا المختلفة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظائرها نره هي الأنصاف تستهدف فعالة وقادرة على تقديم وكلاء المضادة للسرطان بشكل انتقائي في الخلايا السرطانية الخبيثة التي مستقبلات نره صريحة للغاية. ومع ذلك، فإن التحليل الكمي للامتصاص الخلوية نظائرها نره "وأنواع الخلايا التحقيق في أنظمة توصيل الدواء على أساس نره تقتصر حاليا. سبق عرضه، فلوري المسمى انتقائي نره الأول،-II و-III المشتقات نقدم الكشف العظيم، ولهم خصائص كيميائية مناسبة للتجارب متكررة وقوية. لقد وجدنا أيضا أن أساليب يصل إلى تاريخ المناسبة مع هذه نظائرها نره المسمى يمكن أن توفر معلومات جديدة حول أنظمة توصيل الدواء على أساس نره. هذه المخطوطة يقدم بعض التجارب بسيطة وسريعة فيما يتعلق امتصاص الخلوية من [D-ليز 6 (FITC)] - نره-I، [D-ليز 6 (FITC)] - نره-II و [ليز 8 (FITC)] - [نره] -III على EBC-1 (الرئة)، وBxPC-3 (البنكرياس) وعلى ديترويت-562- (البلعوم) ر الخبيثخلايا umor. بالتوازي مع هذه تقارن نره-FITC، تم فحص مستوى سطح الخلية من المستقبلات نره-I أيضا على هذه الخطوط الخلية قبل وبعد العلاج نره من قبل متحد البؤر المجهر الليزر. وكميا امتصاص الخلوي للتقارن نره-FITC بواسطة مضان تنشيط الخلايا الفرز. في هذه التجارب لوحظ اختلافات بسيطة بين نظائرها نره واختلافات كبيرة بين أنواع الخلايا. وترتبط الفوارق الكبيرة بين خطوط الخلايا مع مستوى متميز على سطح الخلايا مستقبلات نره-I. تحتوي على تجارب أدخلت أساليب عملية لتصور وقياس ومقارنة كفاءة امتصاص تقارن نره-FITC في وقت واحد، وبطريقة تعتمد على التركيز على مختلف الثقافات الخلايا الملتصقة. هذه النتائج يمكن التنبؤ تستهدف المخدرات كفاءة تقارن نره على ثقافة خلية معينة، وتوفر أساسا جيدا لمزيد من التجارب في فحص أنظمة توصيل الدواء على أساس نره.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبحت تستند نظم تسليم المخدرات المستهدفة الببتيد ويتطور بسرعة ومنطقة واعدة في علاج السرطان خلال السنوات القليلة الماضية 1 و 2. موجهة الغدد التناسلية البشرية نوع الإفراج عن مستقبلات هرمون الأول (نره-IR) يقع في المقام الأول في الغدة النخامية ولكن موجود أيضا في العديد من الأنسجة الأخرى التي هي المسؤولة عن الاستنساخ الذاتي 3. وأعرب عن نره الأشعة تحت الحمراء أيضا في عدد من الأنسجة السرطانية، ذات الصلة، أو لا علاقة لها الجهاز التناسلي 4، 5. التعبير عال من نره الأشعة تحت الحمراء في العديد من الخلايا السرطانية الخبيثة مقارنة مع الأنسجة السليمة يوفر فرصة للعلاج المستهدفة 5، 6.

العديد من الهرمون المطلق لموجهة الغدد التناسلية وقد تم تطوير (نره]) نظائرها في العقود القليلة الماضية، والتي يمكن أن تستخدم استهداف الأنصافو "> 7، 8، 9، وهذه الببتيدات هي قادرة على تقديم وكلاء المضادة للسرطان مع الانتقائية العالية في الخلايا السرطانية الخبيثة التي الإفراط في التعبير عن نره الأشعة تحت الحمراء 6. عدة نره مترافق الأدوية المضادة للورم مع ارتفاع الانتقائية وأفضل كفاءة من اللامقترن المقابلة وقد تم الإبلاغ عن خال من المخدرات 7، 8، 9.

وذكرت المنشورات السابقة عن الببتيدات نره ومستقبلاتها أن نره الأشعة تحت الحمراء يمكن أن تتحمل مختلف التشكلات التي لها الانتقائية مختلفة لنظائرها نره 10. وقد وهبت لاختلافا كبيرا نره-IR مسارات الإشارات المعقدة والمختلفة مع نشاط مختلف ضد بروابط الطبيعية والاصطناعية من 11. هذه الحقائق تجعل التحقيق في النظم القائمة نره-تحديا. من ناحية أخرى، ذ تمتلك إمكانات علاجية واعدة. العديد من التجارب مع الببتيدات نره رديولبلد كانت أعلنت في وقت سابق 12، 13، 14، 15، ولكن التجارب التي استخدمت fluorescently المسمى نظائرها نره لا تزال محدودة. في حين يقدم وسم المشعة حساسية عالية، ووضع العلامات الفلورية ديها العديد من المزايا الأخرى، على سبيل المثال تسهيل التعامل، والقدرة على مباين مع fluorophores مختلفة. ثلاثة نظائر نره المشتركة التي استخدمت بنجاح لتسليم المخدرات هي [D-ليز 6] -GnRH-I، [D-ليز 6] -GnRH-II ونره الثاني والثالث، ولكن فعالية هذه الببتيدات كما الأنصاف الاستهداف نادرا مقارنة 16، 17. من ناحية أخرى، والنتائج من تجارب منفصلة استخدمت فيها الخلايا السرطانية المختلفة ونظائرها نره متنوعة.

ntent "> وبناء على هذه الاعتبارات، ركزنا على الورم الاستهداف وإمكانية تسليم المخدرات من هذه الببتيدات نره، وبالتالي توليفها وتميزت [D-ليز 6 (FITC)] - نره-I، [D-ليز 6 (FITC )] - تقارن الببتيد نره الثالث 18 وصفت هذه نظائرها بشكل انتقائي مع FITC على سلسلة من الجانب اليس أو D-ليز (نسبة الببتيد FITC من 1 - [ليز 8 (FITC)] نره-II و: 1 في كل. وكانت فكرة المترافقة) أن وضع العلامات الفلورية انتقائية يمكن أن تقدم معلومات جديدة حول هذه الببتيدات، ويسمح لهم تتبع جيد وتقدير موثوق بها. هذه تقارن لها التعامل الآمن وكشف موثوق بها، مما يجعل من الاسهل لمقارنة الورم تستهدف كفاءتها، و فحص أنواع عديدة من الخلايا السرطانية الخبيثة، ونحن نأمل أن ما يصل إلى التجارب موعد مع هذه تقارن الببتيد يمكن أن تسهم في تطور سرطان رواية تستهدف تقارن نره من المخدرات، وتساعد على تحديد القطران العلاجي الجديديحصل أيضا.

يوضح هذا المخطوط بعض التجارب استنساخه بشكل جيد وسريع مع تقارن نره-FITC. التعبير سطح الخلية من نره-R هو شرط حاسمة من حول امتصاص نره، وبالتالي فإننا التحقيق في وقت واحد على مستوى سطح الخلية من نره الأشعة تحت الحمراء على خطوط الخلايا التي تم اختبارها. نحن تصور تقارن نره الأشعة تحت الحمراء ونره-FITC التي كتبها متحد البؤر المسح الضوئي ليزر المجهري (CLSM) وكمية امتصاص الخلوي للتقارن نره-FITC باستخدام مضان تنشيط الخلايا الفرز (FACS).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الثقافات الخلية والكواشف

  1. الحفاظ على الثقافات خلية في المتوسط ​​أوصت الشركة المصنعة، على أن تستكمل مع 10٪ (ت / ت) الجنين مصل بقري والمضادات الحيوية (وتسمى المتوسطة كاملة). حافظ على قارورة خلية زراعة في ترطيب، 5٪ CO 2 جو الحاضنة عند 37 درجة مئوية. اتبع انتشار وconfluency من الخلايا عن طريق مجهر مقلوب (باستخدام 10X الهدف النقيض المرحلة).
  2. عندما تصل الخلايا confluency المناسب، وإزالة المتوسطة، وغسل ثقافة 2-3 مع مل، الفوسفات معقمة المالحة (PBS). إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 0.5 مل، معقم 0.25٪ حل التربسين-EDTA لزراعة الخلايا واحتضان عند 37 درجة مئوية حتى الخلايا تنفصل (حوالي 10 دقيقة).
  3. تعليق الخلايا في 3-4 مل المتوسطة كاملة معقم لوقف التربسين ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي معقمة. الطرد المركزي الخلايا في 150 x ج لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). تجاهل طاف بعناية وتعليق عellet في 2-3 مل المتوسطة كاملة العقيمة.
  4. إخراج 100 ميكرولتر من تعليق خلية وتخلط مع 100 ميكرولتر 0.4٪ (م / V) التريبان حل الأزرق، وصمة عار على الخلايا الميتة. تحميل 10 ميكرولتر من هذا الخليط في عدادة الكريات وتحديد عدد خلايا قابلة للحياة من خلال مجهر مقلوب.
  5. تخفيف المبلغ المطلوب من تعليق خلية أعدت في الخطوة 1،3 حتي 10 مل مع المتوسطة كاملة العقيمة، التي تحتوي على 4 × 4 10 خلية / مل.
  6. إضافة 250 ميكرولتر من تعليق خلية (المعد في الخطوة 1.5) لكل بئر (10 4 خلية / جيد) في سبع آبار أول كوب أسفل 8 جيدا الشرائح المجهرية. استخدام هذه الشريحة في طريقة امتصاص نره.
  7. إضافة 250 ميكرولتر من تعليق خلية (المعد في الخطوة 1.5) لكل بئر (10 4 خلية / جيد) إلى خمسة آبار الثانية الشرائح المجهرية 8 جيدا. وسوف تستخدم هذه الشريحة في طريقة التعبير نره الأشعة تحت الحمراء.
  8. إضافة 1 مل من تعليق خلية (المعد في الخطوة 1.5) لكل بئر (4 × 10 4 خلية / جيد) إلى سبعة أهلا وسهلاليرة سورية من لوحة 12-جيدا. وسوف تستخدم هذه اللوحة في الأسلوب الكمي نره.
  9. السماح للخلايا التمسك على اثنين من الشرائح المجهرية ولوحة. احتضان لهم في ترطيب، 5٪ CO 2 جو الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
  10. بعد حضانة تحقق الخلايا عن طريق مجهر مقلوب (باستخدام 10X الهدف النقيض المرحلة). إذا كانت الخلايا السليمة وتولى، مع الاستمرار في الخطوات التالية.
  11. إعداد 10 ملي نره-FITC حل الأسهم في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) من كل من تقارن ثلاثة 18. (استخدم هذه التركيزات التخفيف: 16.43 ميكروغرام / ميكرولتر [D-ليز 6 (FITC)] - نره-I، 16.97 ميكروغرام / ميكرولتر [D-ليز 6 (FITC)] - نره-II و 16.47 ميكروغرام / ميكرولتر [ليز 8 ( FITC)] - نره-III) حافظ على هذه الحلول الأسهم في مكان مظلم في RT واستخدامها في غضون بضعة أسابيع.
  12. تمييع 1.7 ميكرولتر كل الحلول الأسهم ملم نره-FITC ثلاثة 10 في 1.7 مل المتوسطة كاملة. يهز هذه الحلول. (تساه هي 10 ميكرومتر نره-FITC علاج وسائل الإعلام.) تمييع 150 ميكرولتر كل من الثلاثة 10 ميكرومتر نره-FITC علاج المتوسطة في 1.35 مل المتوسطة كاملة. يهز هذه الحلول وكذلك (وهذه هي 1 ميكرومتر نره-FITC علاج المتوسطة).
    ملاحظة: جميع نره-FITC المحتوية على علاج المتوسطة يجب أن تكون محمية من الضوء وتستخدم ما يصل في غضون بضع ساعات.
  13. سخن ستة نره-FITC علاج المتوسطة (المعد في الخطوة 1.12) و 4 مل المتوسطة كاملة إلى 37 درجة مئوية.
  14. تمييع 3 ميكرولتر من 5 ملم حل مسبار فلوري (مباين النووية المذكورة في قائمة المواد) في 3 مل PBS إلى 5 ميكرومتر. يجب حماية هذا الحل من ضوء، ويبقيه في RT واستخدامه في غضون بضع ساعات.

2. متحد البؤر الليزر الضوئي المجهري (CLSM)

  1. نره طريقة امتصاص
    1. خذ الشريحة الأولى المجهرية التي أعدت في الخطوة 1.6 و ماصة من المتوسط ​​الكامل من كل واحد من سبعة أيضا. إضافة 250 ميكرولتر من ميدي الكامل مسخنأم في البئر الأول. استخدام هذا كوسيلة لمراقبة سلبية. إضافة 250 ميكرولتر من محمى نره-FITC علاج وسائل الإعلام (من 1.13) لكل من الآبار الستة المقبلة (3 آبار مع 1 ميكرومتر و 3 مع 10 ميكرومتر). احتضان الشريحة في ترطيب، 5٪ CO 2 جو الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات.
    2. ماصة من المتوسط ​​من كل بئر وغسل الخلايا مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. إضافة 250 ميكرولتر من محلول تحديد (10٪ محايد مخزنة الفورمالين) في كل بئر واحتضان الشريحة في RT، لمدة 10 دقيقة.
    3. ماصة من الحل تحديد من كل بئر وغسل الخلايا مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. إضافة 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تحتوي على 5 ميكرومتر حل التحقيق الفلورسنت المعد في الخطوة 1.14 في كل بئر واحتضان الشريحة في RT، لمدة 10 دقيقة.
    4. ماصة من الحل التحقيق الفلورسنت من كل جانب، وغسل الخلايا مرتين مع 250 ميكرولتر PBS بعناية. إضافة 3-4 قطرات من تصاعد المتوسط ​​في كل بئر، في نهاية المطاف. الحفاظ على الشرائح في الظلام في RT، حتى التصوير.
  2. نره-IR طريقة التعبير
    1. خذ الثانية الشرائح المجهرية 8 جيدا أعدت في الخطوة 1.7 و ماصة من المتوسط ​​الكامل من كل من الآبار الخمس.
    2. إضافة 250 ميكرولتر من المتوسط ​​كاملة مسخن في البئر الأول، استخدام هذا التحكم سلبية. إضافة 250 ميكرولتر من المتوسط ​​كاملة مسخن في البئر الثاني جدا، واستخدام هذا لدراسة التعبير نره الأشعة تحت الحمراء قبل العلاج نره.
    3. إضافة 250 ميكرولتر كل من مسخن 10 ميكرومتر نره-FITC وسائل الاعلام ثلاث علاج في الآبار الثلاث المقبلة. استخدام هذه الآبار ليمهد للمعالجة الخلايا مع تقارن نره-FITC قبل النظر في التعبير نره الأشعة تحت الحمراء. احتضان الشريحة في ترطيب، 5٪ CO 2 جو الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    4. ماصة من وسيلة علاج من كل من الآبار الثلاثة التي سيتم استخدامها لدراسة التعبير نره-IR بعد العلاج نره وغسل هذه الآبار مع 250 ميكرولتر من المتوسط ​​كاملة مسخن. إضافة 250ميكرولتر من مسخن المتوسطة كاملة إلى كل من الآبار الثلاثة. احتضان الشريحة في ترطيب، 5٪ CO 2 جو الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    5. ماصة من المتوسط ​​من كل من الآبار الخمس وغسل الخلايا مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. إضافة 250 ميكرولتر من تحديد الحل في كل بئر واحتضان الشريحة في RT، لمدة 10 دقيقة.
    6. ماصة من الحل تحديد من كل بئر وغسل الخلايا مع 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. إضافة 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على الزلال 5٪ المصل البقري (BSA) حل عرقلة في كل بئر واحتضان الشريحة في RT، لمدة 1 ساعة.
    7. تمييع 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية-نره الأشعة تحت الحمراء في برنامج تلفزيوني مل 1 (1: 100 نسبة). يبقيه في RT واستخدامه في غضون بضع ساعات.
    8. ماصة من حل حجب BSA من كل بئر باستثناء سيطرة سلبية (وأيضا لأول مرة). غسل الخلايا مع 250 ميكرولتر PBS (باستثناء السيطرة السلبية أيضا). إضافة 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على الأجسام المضادة الأولية نره-IR أعدت في الخطوة 2.2.7 إلى مجموعة شرق افريقياح جيدا (باستثناء المراقبة السلبية). احتضان الشريحة في RT، لمدة 1 ساعة، في مكان مظلم.
    9. تمييع 2.5 ميكرولتر من اليكسا 546 الضد الثانوية وصفت في 1.25 مل برنامج تلفزيوني (1: 500 نسبة).
      ملاحظة: هذا الحل يجب أن تكون محمية من الضوء، ويبقيه في RT واستخدامه في غضون بضع ساعات.
    10. ماصة الحلول من كل من الآبار الخمس وغسل الخلايا مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. إضافة 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي AF 546 الضد الثانوية المسمى أعدت في الخطوة 2.2.9 في كل بئر. احتضان الشريحة في RT، لمدة 1 ساعة في الظلام.
    11. ماصة من حل من كل بئر وغسل الخلايا مع 250 ميكرولتر برنامج تلفزيوني. إضافة 250 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تحتوي على 5 ميكرومتر حل التحقيق الفلورسنت المعد في الخطوة 1.14 في كل بئر واحتضان الشريحة لمدة 10 دقيقة، في RT.
    12. ماصة من الحل التحقيق الفلورسنت من كل بئر وغسل الخلايا مرتين مع 250 ميكرولتر PBS بعناية. إضافة 3-4 قطرات من وسائل الإعلام المتصاعدة في كل بئر، وبعد ذلك. الحفاظ على الشرائح في الظلامفي RT حتى التصوير المجهري.
  3. التصوير
    1. صورة الخلايا عن طريق متحد البؤر مقلوب المسح بالليزر المجهر (باستخدام 63X الهدف غمر النفط)
      1. استخدام موجات الإثارة / الانبعاثات التالية. تقارن نره: 488/514 نانومتر، اليكسا 546 المسمى الأجسام المضادة: 488/546 نانومتر (استخدام فقط للأسلوب التعبير نره-IR)، Draq5 الفلورسنت التحقيق: 633/680 نانومتر.
      2. إعداد معلمات التصوير باستخدام الخلايا السيطرة السلبية. استخدم هذه المعلمات لخلايا صورة المعالجة (الشكل 3). إعادة ضبط المعلمات التصوير على كل الشرائح المجهرية في بداية التحليل. لحن جيد وتصدير الصور مع البرامج المقدمة من قبل الشركة المصنعة إذا لزم الأمر.

3. تنشيط الإسفار الفرز الخلية (نظام مراقبة الأصول الميدانية)

  1. نره طريقة القياس الكمي
    1. تأخذ لوحة أعدت في الخطوة 1.8 و ماصة خارج المتوسطة كاملة من عصامالفصل من الآبار السبعة. إضافة 1 مل من المتوسط ​​الشامل مسخن في البئر الأول. استخدام هذا كوسيلة لمراقبة سلبية. إضافة 1 مل لكل من ستة مسخن علاج وسائل الإعلام (3 آبار مع 1 ميكرومتر و 3 آبار مع 10 ميكرومتر) في الآبار الستة المقبلة. احتضان لوحة في ترطيب، 5٪ CO 2 جو الحاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 5 ساعات.
    2. ماصة من المتوسط ​​من كل جانب. غسل الخلايا مرتين مع 2 مل برنامج تلفزيوني بعناية. إضافة 500 ميكرولتر من محلول التربسين-EDTA في كل الآبار. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية حتى الخلايا تنفصل (حوالي 10 دقيقة).
    3. إضافة 1 مل من المتوسط ​​الشامل في كل بئر لوقف التربسين. يهز لوحة. تعليق الخلايا بلطف مع ماصة، ونقل تعليق من كل بئر في أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية. أنابيب الطرد المركزي في 150 x ج لمدة 4 دقائق، في 4 درجات مئوية.
    4. من اجل الخروج من supernatants بعناية، مع خطوة واحدة. إضافة 500 ميكرولتر من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني في كل أنبوب FACS وبلطف اعادة تعليق الخلايا. إبقاء الأنابيب على الجليد حتى نهايةالتجربة.
  2. تحليل وحساب
    1. تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي. لالإثارة، استخدم 488 نانومتر الطول الموجي الأرجون ليزر وللكشف عن استخدام 530 نانومتر الطول الموجي. إعداد تدفق عداد الكريات المعلمات عن طريق تشغيل الخلايا السيطرة السلبية. استخدم هذه المعلمات لتحليل الخلايا المعالجة (الشكل 4A). تقييم البيانات مع برنامج الشركة المصنعة، وتحديد متوسط ​​كثافة الفلورسنت (MFI) القيم، وحساب القيم المؤسسة النسبية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الصور التي تم الحصول عليها عن طريق الليزر متحد البؤر المسح المجهري (CLSM) تقدم معلومات مذهلة حول الإقبال على تقارن نره-FITC على الثقافة خلية معينة في وقت وتركيز بطريقة تعتمد. بالتوازي مع هذه تقارن-نره FITC، وجود نره الأشعة تحت الحمراء على سطح الخلية هو أيضا التحقق منه من التجربة CLSM. وعلاوة على ذلك، باستخدام الحمض النووي تلطيخ التحقيق الفلورسنت بعيدة الحمراء، فمن الممكن أن مباين نوى الخلايا إلى جانب نره ونره الأشعة تحت الحمراء. ومع ذلك، في حين أن ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التجارب وصفت هنا استخدام المسمى انتقائي نظائرها نره لتمسكا فحص مزارع الخلايا في المختبر. المجهر متحد البؤر والتدفق الخلوي طرق مناسبة لتتبع وقياس امتصاص الخلوية من هذه تقارن-نره FITC في وقت وتركيز بطريقة تعتمد. هذه التجارب لها الخطوات الهامة التالية: 1) الحفاظ على والثقافة خلية صحية معقمة. 2) يجب أن يكون الببتيدات نره من جودة عالية؛ 3) يجب اتباعها تركيزات معقولة وحضانة مرات. 4) علاج وغسل الخطوات. 5) إعدادات أداة متكيف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم المشروع من قبل الصندوق الوطني للبحوث OTKA (K 104045).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
EBC-1JCRB بنك الخليةJCRB0820سرطان الخلايا الحرشفية في الرئة البشرية
BxPC-3ATCCCRL-1687سرطان البنكرياس البشري الغدي
ديترويت -562ATCCCCL-138سرطان البلعوم البشري
RPMI-1640 متوسط مع L-glutamineLonzaBE12-702Fوسط ثقافة لخلايا BxPC-3
الحد الأدنى الأساسي للنسر وسطLonzaBE12-611Fمتوسط لخلايا EBC-1 ، ومكملة ب 0.1٪ بيروفات الصوديوم لخلايا ديترويت -562
مصل الأبقار الجنينيEuroClone ECS0180Lيكمل وسط الثقافة
MycoZap Plus-CL & nbsp ؛LonzaVZA-2012يكمل وسط الثقافة (المضادات الحيوية)
قوارير ثقافة الخلايا الخطية القياسيةVWR10062-872توفر بيئة نمو متسقة ومعقمة للخلايا
خليط التربسين-EDTA   ؛LonzaBE17-161Eإزالة الخلايا المرفقة
محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS)LonzaBE17-516Fمذيب
ثنائي ميثيل سلفوكسيدSigma-AldrichD8418-100MLمذيب
محلول تريبان الأزرق ، 0.4٪Thermo Fisher Scientific15250061يستخدم لعد الخلايا
[D-Lys6< / sup> (FITC)] -GnRH-Iمن صنعنا- نقاء & ge; 98٪ (HPLC)
[D-Lys6< / sup> (FITC)] -GnRH-IIالتي أدلى بها لنا-Purity & ge ؛ 98٪ (HPLC)
[Lys8< / sup> (FITC)] -GnRH-IIIمن صنع لنا-Purity & ge ؛ 98٪ (HPLC)
قاع زجاجي 8 آبار شريحة مجهريةIbidi80826استخدم في تجربة CLSM
لوحة ثقافة خلية Corning Costar ، 12 بئرSigma-AldrichCLS3513-50EAاستخدم في تجربة FACS
حل التثبيت (10٪ فورمالين محايد مخزن)Bio-Optica01V60Pإصلاح الخلايا الملتصقة
ألبومين مصل الأبقارSigma-AldrichA7906-10Gمنع الارتباط غير المحدد للأجسام المضادة
GnRHR الأجسام المضادةProteintech19950-1-APكاشف الكيمياء المناعية ، يرتبط بمستقبلات GnRH البشرية من النوع
الأول الجسم المضاد الثانوي ، Alexa Fluor 546 المترافقThermo Fisher ScientificA11035كاشف الكيمياء المناعية ، يرتبط بالجسم المضاد
الأساسي محلول مسبار الفلورسنت (Draq5)Thermo Fisher Scientific62254نوى Counterstain
Fluoromount مائية تصاعد متوسطةSigma-AldrichF4680-25MLاستخدام في تجربة CLSM ، مع الحفاظ على
المجهر المقلوبElektro-Optika Ltd.   ؛Alpha XDS-2Tتحقق من النمط الظاهري والتقاء مزارع الخلايا مجهر
المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر المقلوبZeissLSM-710الاستخدام في تجربة CLSM
مقياس التدفق الخلويBD BiosciencesBD FACSCaliburالاستخدام في تجربة FACS
ثقافة الفلوري

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11(2016).
  2. Majumdar, S., Siahaan, T. J. Peptide-mediated targeted drug delivery. Med Res Rev. 32 (3), 637-658 (2012).
  3. Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K. GnRH in non-hypothalamic reproductive tissues. Anim Reprod Sci. 88 (1-2), 95-113 (2005).
  4. Schally, A. V., et al. Hypothalamic hormones and cancer. Front Neuroendocrinol. 22 (4), 248-291 (2001).
  5. Limonta, P., et al. GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).
  6. Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances. J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).
  7. Manea, M., et al. In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice. Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).
  8. Argyros, O., et al. Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth. Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).
  9. Karampelas, T., et al. GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery. Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).
  10. Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -L. Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling. Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).
  11. Millar, R. P., et al. Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).
  12. Olberg, D. E., et al. Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression. Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).
  13. Zoghi, M., et al. Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging. Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).
  14. Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging. Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).
  15. Nederpelt, I., et al. Characterization of 12 GnRH peptide agonists - A kinetic perspective. Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).
  16. Szabo, I., et al. Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting. J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).
  17. Leurs, U., et al. GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate. Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).
  18. Murányi, J., et al. Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells. J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

GnRH AnaloguesFluorescent LabelingConfocal MicroscopyFlow CytometryCellular UptakeCancer Cell LinesGnRH ReceptorsDrug TargetingFluorescence QuantificationTime Concentration Dependent

مقالات ذات صلة