الشيخوخة الخلوية، والدولة لا رجعة فيها اعتقال دورة الخلية، يمكن الناجمة عن مختلف الضغوط الخلوية. هنا، نحن تصف بروتوكولات للحث على الشيخوخة وطرق الخلوية لتقييم علامات الشيخوخة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
وردا على الإجهاد الخلوي أو ضرر، ويمكن الخلايا المتكاثرة لحث على برنامج معين الذي يبدأ حالة اعتقال دورة الخلية على المدى الطويل، ووصف الشيخوخة الخلوية. تراكم خلايا هرمة يحدث مع الشيخوخة عضوي ومن خلال زراعة المستمرة في المختبر. خلايا هرمة تؤثر العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك التطور الجنيني، وإصلاح الأنسجة وتجديدها، وقمع الورم، والشيخوخة. وتشمل السمات المميزة للخلايا هرمة، ولكن لا تقتصر على، وزيادة النشاط β غالاكتوزيداز المرتبطة الشيخوخة (SA-β-غال)؛ INK4A P16، البروتين p53، وP21 المستويات؛ مستويات أعلى من الحمض النووي من التلف، بما في ذلك γ-H2AX. تشكيل المرتبطة الشيخوخة-المغاير البؤر (SAHF)؛ والاستحواذ على المصاحب الشيخوخة إفرازية النمط الظاهري (SASP)، وهي ظاهرة تتميز إفراز عدد من السيتوكينات الموالية للالتهابات والجزيئات الإشارة. هنا، نحن تصف بروتوكولات لكلا تنسخي والشيخوخة DNA الأضرار التي يسببها في الخلايا المستزرعة. وبالإضافة إلى ذلك، نسلط الضوء تقنيات لمراقبة النمط الظاهري الشيخوخي باستخدام العديد من علامات الشيخوخة المرتبطة، بما في ذلك SA-β-غال، γ-H2AX وSAHF تلطيخ، ولقياس البروتين ومرنا مستويات المنظمين دورة الخلية والعوامل SASP. ويمكن تطبيق هذه الأساليب لتقييم الشيخوخة في مختلف النماذج والأنسجة.
المقدمة
منذ أكثر من نصف قرن، ووصف Hayflick وزملاؤه كيف خلايا تتكاثر هو دون تغيير في الثقافة، ولكن فقط لفترة محدودة من الوقت 1. زراعة على المدى الطويل من الخلايا الليفية الإنسان تسبب الخلايا لوقف الانتشار. ومع ذلك، فإنها كانت نشطة عملية الأيض، وهذا ما يسمى الشيخوخة الخلوية. الشيخوخة يمكن أن تكون مفيدة لتثبيط تكون الأورام، ولكن أيضا يمكن أن يكون ضارا، كما هو يعتقد أن تساهم في فقدان القدرة على التجدد الذي يحدث مع الشيخوخة 2 و 3. وقد تبين أن خلايا هرمة تتراكم في الأنسجة كما البشر سن 4 و قد تورطت في عدد من العمليات البيولوجية، بما في ذ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. حمل تنسخي الشيخوخة
- ذوبان الجليد-مرور منخفض الليفية مضاعفا الإنسان (على سبيل المثال، WI-38 و IMR-90) أو خطوط الخلايا الأخرى.
ملاحظة: هنا، تم استخدام الخلايا الليفية مضاعفا الإنسان، ولكن هذه البروتوكولات يمكن استخدامها لتقييم الشيخوخة في أنواع الخلايا الأخرى، مثل البطانية، الظهارية، أو الخلايا الجذعية الوسيطة. قد يكون الأمثل ظروف زراعة لأنواع مختلفة من الخلايا المستخدمة نظرا لمعدلات النمو المختلفة أو ظروف النمو.
ملاحظة: يجب أن تكون الخلايا المتكاثرة ولها مورفولوجيا المغزل (انظر الشكل رقم 1 لالتخطيط....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
أرقام 2-6 تظهر نتائج ممثلة من تلطيخ SA-β-غال. تلطيخ لγ-H2AX وSAHF. تقييم مستويات البروتين من INK4A P16، P21، والبروتين p53. ومرنا ومستويات البروتين من جزيئات هرمة المصاحب. تحدث زيادة تلطيخ SA-β-غال مع تنسخي والحمض النووي الناجم عن الضرر الشيخوخة. أيضا، لاحظ التغيرات المورفولوجية التي تحدث مع الشيخوخة. تصبح الخلايا الموسع ومسطحة بالمقارنة مع ظهور المغزل من الخلايا الليفية المتكاثرة. لهذا النموذج التجريبي، وكانت ملطخ.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
هنا، التي وصفناها طرق تنسخي والحمض النووي الضرر الناجم عن الشيخوخة باستخدام الخلايا الليفية مضاعفا الإنسان. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تضمين تقنيات لقياس البروتين ومستويات مرنا من مختلف البروتينات المرتبطة الشيخوخة، فضلا عن تلطيخ لSA-β-غال ولDNA-الضرر علامة γ-H2AX. هذه البروتوكولات يمكن استخدامها على نطاق واسع لتقييم الظواهر هرمة سواء في التجارب المختبرية والحية، على الرغم من أن العديد من المحاذير وجود لوصف الشيخوخة في الجسم الحي 20. .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
وأيد هذه الدراسة من قبل برنامج بحوث جماعية من المعاهد الوطنية للصحة، والمعهد الوطني للشيخوخة. الكتاب أود أن أشكر ميريام غوروسب وقطب عبدالمحسن بالنسبة لكثير من المناقشات المفيدة حول الشيخوخة وقطب عبدالمحسن للأيضا قراءة نقدية للمخطوطة. كما نشكر أعضاء المختبر لدينا، خاصة دوغلاس دلوزين لقراءة نقدية للمخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| 16٪ هلام تريس جلايسين | Invitrogen | XP00160BOX | |
| حمض الفينول ChCl3< / sub> | Ambion | AM9720 | |
| Alexa-Fluor 568 الماعز المضاد للجسم المضاد للفأر | Invitrogen | A11031 | 1:300 |
| رافعات الخلايا | Corning Inc. | 3008 | مكشطة الخلية |
| ECL المضادة للفأر HRP الجسم المضاد المرتبط | Amersham | NA931V | |
| ECL Plus Western Blouting Substrate | Pierce | 32132 | ECL |
| DAPI | المجسات الجزيئية | MP01306 | مخزون 5 مجم / مل في dH 2< / sub>O |
| الجسم المضاد GAPDH | سانتا كروز | sc-32233 | 1: 1،000 - 5،000 |
| GlycoBlue | Ambion | AM9515 | |
| Histone H3 ثنائي ميثيل K9 الجسم المضاد أحادي النسيلة | Abcam | 1220 | 1: 500 التخفيف |
| البشري IL-6 Quantikine ELISA الفحص | R & أنظمة D | D6050 | |
| البشرية IL-8 Quantikine ELISA الفحص | R & أنظمة D | D8000C | |
| البشرية GROa Quantikine ELISA الفحص | R & أنظمة D | DRG00 | |
| N-N-dimethylformamide ؛ | سيجما | D4551 | DMF |
| p16 الجسم المضاد أحادي النسيلة | BD Biosciences | 51-1325gr | 1: 500 التخفيف |
| p21 الجسم المضاد أحادي النسيلة | Millipore | 05-345 | 1: 750 التخفيف |
| p53 الجسم المضاد أحادي النسيلة | سانتا كروز | sc-126 | 1: 500 استنساخ التخفيف DO-1 |
| phospho-H2AX (Ser139) FITC مترافق الجسم المضاد | إشارات الخلية | 9719 | 1: 2،000 التخفيف |
| < م > الطاقة < م > SYBR الأخضر PCR ماستر ميكس ؛ | Applied Biosystems | 4367659 | |
| علامات الوزن الجزيئي الملطخة | مسبقا Biorad | 161-0374 | |
| ProLong Gold Antifade | Invitrogen | P36930 | |
| غشاء PVDF | Thermo Scientific | 88518 | |
| الشيخوخة & -Galactosidase تلطيخ كيت | خلية إشارات | 9860 | |
| TRIzol | Ambion / Life | Tech 10296028 |
المراجع
- Hayflick, L. The Limited in Vitro Lifetime of Human Diploid Cell Strains. Exp Cell Res. 37, 614-636 (1965).
- van Deursen, J. M. The role of senescent cells in ageing. Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).
- Campisi, J., d'Adda di Fagagna, F.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
