Method Article

إعداد و في المختبر توصيف ممغنط مير تعديل الخلايا البطانية

DOI:

10.3791/55567

⸱

May 2nd, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 2Physikalisch-Technische Bundesanstalt, 3Department of Radiology and Neuroradiology, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 4Electron Microscopy Center, University of Rostock

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه المخطوطة كفاءة، والتسليم غير فيروسي مير إلى الخلايا البطانية التي كتبها ناقل PEI / MNP ومغنطة بهم. وهكذا، بالإضافة إلى التعديل الوراثي، ويسمح هذا النهج لتوجيه الخلايا المغناطيسي MRI والكشف. هذه التقنية يمكن استخدامها لتحسين خصائص المنتجات خلية العلاجية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حتى الآن، فإن العلاجات الجراحية والدوائية المتاحة لأمراض القلب والأوعية الدموية (الأمراض القلبية الوعائية) محدودة وغالبا ما الملطفة. وفي الوقت نفسه، الجينات والخلايا العلاجات هي النهج البديلة واعدة للغاية لعلاج الأمراض القلبية الوعائية. ومع ذلك، فإن التطبيق السريري واسعة من العلاج الجيني يقتصر إلى حد كبير بسبب عدم وجود أنظمة توصيل الجينات المناسبة. تطوير ناقلات توصيل الجينات المناسبة يمكن أن توفر حلا للتحديات الراهنة في العلاج بالخلايا. وعلى وجه الخصوص، السلبيات الموجودة، مثل كفاءة محدودة ومنخفضة الاحتفاظ الخلايا في الجهاز المصاب، يمكن التغلب عليها عن طريق الهندسة الخلية المناسبة (أي الوراثية) قبل الزرع. يصف بروتوكول المعروضة تعديل عابر فعالة وآمنة من الخلايا البطانية باستخدام جسيمات متناهية الصغر polyethyleneimine مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic المغناطيسي (PEI / MNP) المستندة إلى متجه التسليم. أيضا، يتم تعريف خوارزمية والأساليب لتوصيف الخلية. وintracellu ناجحةوقد حقق تسليم لار من الرنا الميكروي (مير) في الوريد السري الخلايا البطانية الإنسان (HUVECs) دون التأثير على بقاء الخلية، وظائف، أو الاتصالات بين الخلايا. وعلاوة على ذلك، فقد أثبت هذا النهج لإحداث تأثير وظيفي قوي في خارجية المنشأ قدم مير. الأهم من ذلك أن تطبيق هذا ناقل القائمة MNP-يضمن مغنطة الخلية، مع المرافق إمكانيات استهداف المغناطيسي MRI وتتبع غير الغازية. وهذا قد تقدم أساسا لتسترشد مغناطيسيا، علاجات الخلايا المعدلة وراثيا التي يمكن رصدها غير جراحية مع التصوير بالرنين المغناطيسي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الجينات والعلاج بالخلايا هي أدوات قوية لديها القدرة على حل التحديات الراهنة في علاج الأمراض القلبية الوعائية. وعلى الرغم من أن كلا من هذين النهجين يجري حاليا اختبارها في التجارب السريرية، فهي ليست مستعدة بعد للالتطبيق السريري واسعة 1. والجدير بالذكر أن نهج مشترك لمواجهة التحديات من الجينات والعلاج بالخلايا هو تطوير ناقلات توصيل الجينات متعددة الوظائف مناسبة لتطبيق السريرية. عدم وجود أنظمة توصيل الجينات آمنة وفعالة هو مصدر القلق الرئيسي من العلاج الجيني. في الوقت نفسه، والهندسة الوراثية من المنتجات الخلوية قبل الزرع يمكن التغلب على التحديات الخطيرة للعلاج الخلايا، مثل انخفاض الكفاءة (على سبيل المثال،<....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم الحصول على الحبل السري الإنسان لعزل الخلايا بعد الولادة من علم والنساء الأصحاء الذين أعطى موافقتهم الخطية على استخدام هذه المواد لأغراض البحث وفقا لإعلان هلسنكي. وافقت لجنة أخلاقية من جامعة روستوك الدراسة التي قدمت (ريج. رقم أ 2011 06، لفترة طويلة 23 سبتمبر 2013).

1. إعداد ترنسفكأيشن مجمعات

  1. Biotinylation من polyethyleneimine (PEI).
    1. حل تشعبت PEI في الماء عالى النقاء تح....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والغرض الرئيسي من البروتوكول المقترح هو إنتاج الخلايا المستجيبة مغناطيسيا مير المعدلة وإجراء توصيف دقيق لها (الشكل 1). ونتيجة لذلك، والخلايا transfected بكفاءة، تستجيب لاختيار المغناطيسية والتوجيه وكشف مع التصوير بالرنين المغناطيسي، يجب الحصول على.

أولا، تم التأكد من هويات HUVECs معزولة من تلطيخ نموذجي مع CD31 البطانية علامة (PECAM.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم تقديم إنتاج خلايا معدلة وراثيا محملة النانوية مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic لتوجيهاتهم مزيد من التحكم مغناطيسيا في البروتوكول الحالي. التطبيق الناجح لهذه الاستراتيجية تسمح لتسوية بعض الصعوبات من العلاج بالخلايا، مثل انخفاض الاحتفاظ والفقراء engraftment في المنطقة أصيب 2، 3، 4، من خلال تقديم منتج خلية استهدافه للزرع. وعلاوة على ذلك، يمكن إدخال وقت واحد من المادة الوراثية المخ.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدينا مصالح المالية المتنافسة في الكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونود أن نشكر G. فولدا (مركز المجهر الإلكتروني، جامعة روستوك، ألمانيا) للدعم الفني في الحصول على الصور TEM النانوية مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic تصفيتها وفي إجراء تحليل الأشعة السينية الخاصة بهم. وأيد الأعمال التي تقوم بها في RTC روستوك من قبل الوزارة الاتحادية للتعليم والبحوث ألمانيا (FKZ 0312138A، FKZ 316159 وVIP + 03VP00241) والدولة كروا مكلنبورغ الغربية مع الصناديق الهيكلية للاتحاد الأوروبي (ESF / IV-WM-B34- 0030/10 وكلية العلوم التربوية / IV-BM-B35-0010 / 12) والتي DFG (DA 1296-1)، والرطوبة، مؤسسة، ومؤسسة القلب الألمانية (F / 01/12). وأيد فرانك ويخورست من قبل برنامج أبحاث الاتحاد الأوروبي FP7 "Nanomag" FP7-NMP-20....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
PEI 25 kDaSigma Aldrich408727
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-BiotinThermo Scientific21335
PD-10 أعمدة تحلية المياهGE Healthcare17085101 تحتوي على Sephadex G-25
محلول كاشف نينهيدرين متوسط 2٪سيجما ألدريتش7285
جلايسينسيجما ألدريتش410225
بيرس البيوتين الكمية كيتالحرارية العلمية28005
قارئ الصفيحة الدقيقة نموذج 680Bio-Rad
Streptavidin MagneSphere الجسيمات المغناطيسيةPromegaZ5481
Millex-HV PVDF FilterMerckSLHV013SL 0.45 & micro ؛ م
الميزان 120 مجهر إلكتروني ناقلZeissتسارع الجهد 120  
كاشف الأشعة السينية kV SapphireEDAX-Amatek
بلاستيك لثقافة الخلاياTPP
NHS-Esther Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-31
NHS-Esther Atto 488 ATTO-TEC GmbHAD 488-31
Cy5 miRNA Label IT kitMirus BioMIR 9650
Biotin Atto 565ATTO-TEC GmbHAD 565-71
الكولاجينس النوع الرابع GibcoThermo Scientific17104019
وسط نمو البطانة ، EGM-2LonzaCC-3156 & CC-4176
البنسلين / الستربتومايسين15140122 الحراري العلمي100 وحدة / مل ، 100 وميكرو ؛ جم / مل
MatrigelBD Biosciences356234
الأجسام المضادة المضادة PECAM-1سانتا كروزsc-1506
MS MACS أعمدةMiltenyi Biotec   ؛130-042-201
Near-IR Live / Dead Cell StainKit Thermo ScientificL10119
Cy3 Dye-Label Pre-miR Negative ControlThermo ScientificAM17120"Cy3-miR" أو "Cyanine-miR3" في المخطوطة
Pre-miR miRNA Precursor Molecules - Negative Control Thermo ScientificAM17110"scr-miR" في المخطوطة
Anti-has-miR92a-3p المثبط الاصطناعي Thermo ScientificAM10916
LSM 780 ELYRA PS.1Zeiss
ParaformaldehydeSigma Aldrich158127محلول 4٪ في PBS
DAPI صبغة نوويةThermo ScientificD1306
NucleoSpin RNA KitMachery-Nagel740955
mirVana miRNAIsolation Kit Thermo ScientificAM1560
TaqMan MicroRNA طقم النسخ العكسيالحراري العلمي4366596
StepOnePlus نظام PCR في الوقت الحقيقيالأنظمة الحيوية
طقم النسخ العكسي cDNA عالي السعةThermo Scientific4368814
has-miR-92a TaqManاختبار حراري علمي000431تسلسل miRNA الناضج: UAUUGCACUUGUCCCGGCCUGU
FastGene Taq Ready MixNippon GeneticsLS27
ITGA5 TaqMan الفحصالحراري العلميHs01547673_m1
RNU6B TaqMan فحصحراري علمي001093
18S rRNA التحكم الذاتيالحراري العلمي4333760F
الجيلاتينسيجما ألدريتشG7041
CellTrace كالسين أحمر-برتقاليحراري علميC34851
PBSعموم التكنولوجيا الحيويةP04-53500
BSAسيجما ألدريتش
MACS العازلةMiltenyi Biotec  130-091-221
AgaroseSigma AldrichA9539
7.1 نظام التصوير بالرنين المغناطيسي للحيواناتTesla Bruker CorporationA7906
برنامج ImageJبالمعاهد الوطنية للصحةباستخدام محلل تكوين الأوعية الدموية (NIH)
جهاز MPSBruker Biospin
Matlab SoftwareMathworks
حلقة نيوديم مغناطيس magnets4you GmbHRM-10x04x05-G& oslash ؛ 10 مم ؛ البقايا ~ 1.3   ؛ T ، الإكراه & 955 كيلو أمبير / م
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 ImagingKit Thermo ScientificC10340
FluorSave ReagentMerck345789
بالموجات فوق الصوتية حمامبانديلين النوع الإلكتروني: RK 100 SH
الحركة نظام التطبيقية تمت ترقيته

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Behfar, A., Crespo-Diaz, R., Terzic, A., Gersh, B. J. Cell therapy for cardiac repair-lessons from clinical trials. Nat Rev Cardiol. 11 (4), 232-246 (2014).
  2. Zeng, L., Hu, Q., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Endothelial CellsMicroRNA DeliveryMagnetic NanoparticlesCell TransfectionConfocal MicroscopyFlow CytometryCell ViabilityTube FormationGap Junction CommunicationMRI Tracing

Related Articles