مقالة منهجية

الدهون عزل القطرة عن التحليل الكمي الطيف الكتلي

10.1K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55585

⸱

أبريل 17, 2017

 ,  ,  , 
1Heinrich Pette Institute, Leibniz Institute for Experimental Virology, 2Core Facility Mass Spectrometric Proteomics, University Medical Center Hamburg-Eppendorf

في هذه المقالة

ملخص

قطرات الدهون هي عضيات مهمة لتكرار عدة مسببات الأمراض، بما في ذلك فيروس التهاب الكبد C (HCV). نحن تصف طريقة لعزل قطرات الدهون لمطياف الكتلة الكمية من البروتينات المرتبطة بها. أنها يمكن أن تستخدم في إطار مجموعة من الشروط، مثل عدوى فيروس، والإجهاد البيئي، أو العلاج من تعاطي المخدرات.

الملخص

قطرات الدهون ضرورية لتكرار مجموعة متنوعة من مسببات الأمراض المختلفة، وأبرزها فيروس التهاب الكبد C (HCV)، والموقع المفترض التشكل الفيريون. ويمكن استخدام تحليل بروتيوم الدهون قطرات الكمي لتحديد البروتينات التي توطين أو مشردون من قطرات الدهون في ظل ظروف مثل العدوى بالفيروس. هنا، نحن تصف البروتوكول الذي تم استخدامه بنجاح لوصف التغيرات التي طرأت على بروتيوم الدهون قطرات بعد الإصابة مع HCV. نحن نستخدم مستقرة النظائر وسمها مع الأحماض الأمينية في الثقافة الخليوي (SILAC)، وبالتالي تسمية بروتيوم كاملة من السكان واحدة من الخلايا التي تحتوي على الأحماض الأمينية "الثقيلة" ل quantitate البروتينات التي مطياف الكتلة. لعزل الدهون قطرة، والسكان الخلية اثنين (أي / "خفيفة" الأحماض الأمينية المصابة HCV و / الأحماض الأمينية "الثقيلة" غير المصابة السيطرة) يتم خلط 1: 1 و هي lysed ميكانيكيا في المخزن منخفض التوتر. بعد إزالة النوى وخلايا دebris بانخفاض الطرد المركزي السرعة، يتم إثراء البروتينات المرتبطة قطرات الدهون من قبل اثنين من الخطوات تنبيذ فائق اللاحقة تليها ثلاث خطوات الغسيل في المخزن متساوي التوتر. ويتم تحليل نقاء الكسور قطرات الدهون التي النشاف الغربية مع الأجسام المضادة الاعتراف مقصورات التحت خلوية مختلفة. ثم يتم فصل البروتينات المرتبطة قطرات الدهون عن طريق الكهربائي للهلام SDS-بولكرلميد (SDS-PAGE)، يليه Coomassie تلطيخ. بعد زيتية هضم، وكميا الببتيدات التي اللوني التأين electrospray، جنبا إلى جنب قياس الطيف الكتلي السائل (LC-ESI-MS / MS). باستخدام هذا الأسلوب، حددنا البروتينات تجنيدهم للقطرات الدهون على فيروس التهاب الكبد الوبائي التي قد تمثل العوامل المضيفة المؤيدة أو المضادة للفيروسات. يمكن تطبيق أسلوبنا لمجموعة متنوعة من الخلايا المختلفة والظروف والثقافة، مثل العدوى مع مسببات الأمراض، والإجهاد البيئي، أو العلاج من تعاطي المخدرات.

المقدمة

قطرات الدهون هي غاية الحيوية هيولي (والنووية) عضيات الخلية تتكون من مجموعة أساسية من الدهون المحايدة (الدهون الثلاثية (TG) والكوليسترول استر (CE)) محاطة أحادي الطبقة من الدهون الفوسفاتية مع البروتينات جزءا لا يتجزأ 1. جميع أنواع الخلايا تنتج قطرات الدهون، ولكنها تختلف في الحجم والتكوين الدهون، والديكور البروتين. قطرات الدهون الوفاء وظائف متنوعة، بما في ذلك منصب الطاقة والسلائف غشاء الخزانات أو ودائع البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، من خلال امتصاص الدهون، وأنها تحمي الخلايا من lipotoxicity، والدهون الإفراج كما يشير الجزيئات، ويشاركون في تدهور البروتين والشبكة الإندوبلازمية (ER) استجابات التوتر 2. على هذا النحو، ومجموعة من البروتينات ربط قطرات الدهون ويحكم جيلهم، وتدهور، والاتجار، والتفاعل مع العضيات الأخرى. ومن بين هذه الأسرة perilipin من البروتينات الدهنية قطرة ملزمة الحسنة النية (PLIN1-5)و "> 3.

الدهون قطرات نشوء حيوي المرجح يبدأ في ER، حيث تحفيز الانزيمات-ER المقيمين تركيب الدهون المحايدة التي تتراكم داخل طبقة ثنائية الغشاء، وتشكيل عدسة الدهون المحايدة، وهي العملية التي كانت تصور في الآونة الأخيرة بشكل جيد في الخميرة 4. ثم ويعتقد أن غشاء الانحناء وارتفاع مستويات حمض ومادة ال diacylglycerol الفسفاتيديك لجذب البروتينات المشاركة في التركيب الحيوي فوسفورية، وتركيب وقت واحد من الدهون المحايدة الأساسية والدهون الفوسفاتية التدريع مطلوب لتوليد الدهون قطرات 5. الانزيمات إيواء المجالات عبر الغشاء الذي يقيم في ER تحفيز هذه العملية. التوسع إلى قطرات الدهون الكبيرة يتطلب النشاط من فئة مختلفة من الإنزيمات تجميع الدهون التي تؤوي على الحلزون متقابلة الزمر وبالتالي يمكن السفر من ER إلى قطرات الدهون. تعبئة الدهون من قطرات الدهون يحدث من خلال تفعيل المحلي للtriglyceridه ومادة ال diacylglycerol الليباز الليباز الدهنية الدهون الثلاثية (ATGL) وهرمون الليباز حساسة (HSL) أو عن طريق مسارات ذاتية البلعمة مختلفة، مثل الاقتصاد الكلي والاقتصاد microlipophagy أو الالتهام الذاتي 6 الوصيفة بوساطة. قطرات الدهون تتفاعل مع العضيات الخلوية الأخرى، مثل الميتوكوندريا (لبيتا للأكسدة والتوليف الدهن) وER (لتخليق الدهون والاتجار البروتين)، ولكن أيضا مع الجسيمات الحالة، الإندوسومات، والفجوات الناجمة عن البكتيريا داخل الخلايا 7. في الواقع البكتيريا والفيروسات والطفيليات حتى تستهدف قطرات الدهون للنسخ المتماثل والمثابرة، من بينها HCV 8.

فيروس التهاب الكبد الوبائي هو أحد الأسباب الرئيسية للمراضة ذات الصلة الكبد والوفاة في جميع أنحاء العالم، وهو ما يمثل حوالي 0.5 مليون حالة وفاة سنويا 9. العدد الحقيقي للإصابات HCV غير معروف، ولكن تشير التقديرات الأخيرة التي 130-150٬000٬000 الناس مصابون بشكل مزمن. لا VACCINيوجد الإلكترونية، ولكن تمت الموافقة عليه مؤخرا مضادات الفيروسات المفعول المباشر زيادة كبيرة الاستجابات العلاجية مقارنة مع العلاج القائم على فيروسات القياسية. ومع ذلك، في جميع أنحاء العالم، من المرجح أن يقتصر علاج المرضى بسبب التكاليف الباهظة للعلاجات جديدة. ما يقرب من نصف جميع الأفراد المصابين المزمنين مع HCV تطوير مرض الكبد الدهني (تنكس دهني)، وهي حالة تتميز التراكم المفرط للقطرات الدهون في خلايا الكبد. ومن المثير للاهتمام، ظهرت قطرات الدهون أيضا العضيات الخلوية كما الحيوية للنسخ المتماثل HCV، خدمة مزعومة كمواقع التجمع الفيروسية 10، 11.

في الخلايا المصابة HCV، جوهر البروتين الفيروسي وNS5A توطين لقطرات الدهون في عملية تعتمد على مكونات الدهون الثلاثية، ومثبطات مادة ال diacylglycerol ناقلة الأسيل-1 (DGAT1) يضعف الاتجار إلى قطرات الدهون وHCV لاحق إنتاج الجسيمات 12 و 13 و 14 و 15. وبالإضافة إلى ذلك، والطفرات في الدهون المجالات ملزم قطرة إما الأساسية أو NS5A قمع HCV التجمع 16 و 17. الأساسية وNS5A ثم تجنيد جميع البروتينات الفيروسية الأخرى، وكذلك المجمعات تكرار RNA الفيروسي، إلى الأغشية المرتبطة بشكل وثيق مع دهن قطرات 16. مطلوب إجراءات متضافرة من جميع البروتينات الفيروسية لإنتاج الناجح للسلالة الفيروسية المعدية 10 و 11. البروتينات الهيكلية هي جزء من virions، والبروتينات غير الهيكلية تعزيز التفاعلات البروتين البروتين المطلوبة لهذه العملية. ومن المثير للاهتمام، يطلب من حسن النية الدهون ملزم قطرة البروتين PLIN3 / TIP47 لكل من تكرار RNA HCV وإطلاق سراح virions 18 و 19 20. وعلى الرغم من هذه التطورات الأخيرة، وتفاصيل الآلية، وخاصة من التفاعلات الفيروسات المضيف أثناء المراحل المتأخرة من تكرار HCV، لا تزال غير محددة، وظيفة محددة من قطرات الدهون غير معروف.

هنا، نحن تصف طريقة لعزل قطرات الدهون لقياس الطيف الكتلي الكمي من البروتينات المرتبطة بها. باستخدام هذا الأسلوب، وجدنا تغيرات عميقة في بروتيوم الدهون الحبرية خلال فيروس التهاب الكبد الوبائي، وحددت A3 annexin كما بروتين المضيف الذي مع قطرات الدهون-fractionates التعاون ومطلوب لHCV كفاءة نضوج 21.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد وسائل الإعلام عن مستقرة النظائر وسمها مع الأحماض الأمينية في الثقافة الخليوي (SILAC)

ملاحظة: هنا، والكميات كيت SILAC البروتين - DMEM تستكمل مع 50 ملغ من 13 C 6 L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك كانت تستخدم لوضع العلامات SILAC. يتم توفير مدال الجنين العجل المصل (FCS) مع مجموعة الكميات SILAC البروتين.

  1. إزالة 50 مل من كل زجاجة من DMEM المتوسطة وإضافة 50 مل من FCS مدال.
  2. حل 50 ملغ من 13 C 6 L-ليسين-2HCl و 50 ملغ من 13 C 6 L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك في 1 مل من المتوسط. تخلط جيدا وإضافة الأحماض الأمينية إلى المتوسطة DMEM + FCS.
  3. إضافة 1X القلم / بكتيريا و1X-L الجلوتامين بديلا. معقم مرشح المتوسط ​​باستخدام فلتر 0.45 ميكرون. تسمية زجاجة كوسط SILAC "الثقيل".
  4. لإعداد "خفيفة" المتوسطة، كرر الخطوات من 1،1-1،3 باستخدام 50 ملغ من L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك و 50 ملغ من L-ليسين-2HCl. تسمية زجاجة باسم "ضوء "المتوسطة SILAC.

2. SILAC وضع العلامات والأحماض الأمينية تحكم التأسيس

  1. يعرض للتريبسين الخلايا (1X التربسين-EDTA) وانقسام 1 × 10 5 Huh7.5 الخلايا في 2 آبار لوحة الثقافة 6 جيدا تحتوي على 2 مل من المتوسط، واحدة بشكل جيد مع المتوسط SILAC "الثقيل" واحد مع "النور" SILAC المتوسطة.
  2. ثقافة الخلايا لمدة لا تقل عن 6 مقاطع (نسبة انقسام: 1: 6)؛ بعد 6 فقرات، يجب أن يكون إدراج الأحماض الأمينية "الثقيلة" أكثر من 95٪.
  3. حصاد 1 × 10 6 خلايا "الثقيل" - السكان الخلية -labeled و "النور" لتحليل فعالية التأسيس. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X وبيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 160 x ج و 4 ° C.
  4. إعادة تعليق الكريات الخلايا في 150 ميكرولتر من MS-العازلة (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.4 درجة الحموضة، و1 ملم EDTA تستكمل مع 1X كوكتيل مثبط البروتياز)، واحتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة. ليز جملتعلمي اللغة اإلنكليزية صوتنة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: فيما يلي إعدادات صوتنة المستخدمة هنا: توقيت، عقد. مراقبة الانتاج، 8؛ دورة العمل، 80٪، و2 × 30 نبضة.
  5. إزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 11000 x ج و 4 ° C. نقل طاف لأنبوب جديد وتحديد تركيز البروتين مع بروتين فحص المنظفات متوافق.
  6. خلط 75 ميكروغرام من البروتين العازلة مع عينة 6X (375 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8، 25.8٪ الجلسرين، 123 ملغ / مل SDS، 600 ميكروغرام / مل برموفينول الأزرق، و 60 ميكرولتر / مل β-المركابتويثانول)، يغلي في درجة حرارة 95 درجة C لمدة 5 دقائق، وفصل البروتينات عن طريق SDS-PAGE في SDS العازلة تشغيل (3.02 جم / L تريس قاعدة، 18.8 غ / L الجلايسين، و 1 غرام / L SDS) في 180 V لحوالي 1 ساعة أو وفقا لمصنعي "التعليمات.
  7. نقل جل في الغروية حل تلطيخ Coomassie. استئصال الفرقة البروتين نفسه من كل حارة. هضم البروتينات مع التربسين وتحليل فعالية التأسيس من قبل MS تحليل سياسيالصورة، كما هو موضح 22.

3. الدهون القطرة عزل الخلايا Huh7.5 المسمى SILAC

  1. تصيب السكان واحدة من الخلايا (أي تلك التي وصفت مع الأحماض "خفيفة" الأمينية) مع فيروس مراسل HCV التي يحتضنها مع مخزونات فيروس (على سبيل المثال، JC1 NS5AB-mKO2-BSD، MOI 1) لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية، كما هو موضح 21 .
    ملاحظة: JC1 NS5AB-mKO2-BSD هو فيروس HCV يحمل مراسل مضان (أحادى Kusabira أورانج 2، mKO2) لمراقبة معدلات الإصابة تليها Blasticidin المقاومة جين (BSD) بين تكرار موقع NS5A-NS5B الانقسام، التي سبق وصفها 21، 23. العمل مع HCV يتطلب BSL2 + (USA) أو S3 ** (ألمانيا) الاحتواء والممارسات على مستوى السلامة الحيوية. بدلا من الإصابة بفيروس HCV، وخلايا يمكن أن يصاب مع مسببات الأمراض المختلفة.
  2. توسيع الخلايا المصابة HCV "الخفيفة" وغير مصاب & #34؛ الخلايا الثقيلة "خلال الركض من الثقافات، وتحديد قسامة مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني وتحديد معدلات الإصابة HCV التدفق الخلوي من البروتين علامة فلوري (على سبيل المثال، mKO2)، كما هو موضح 21، و وينبغي أن تكون معدلات الإصابة أعلى من 90٪ للدهن قطيرة العزلة ملاحظة: إذا كنت تستخدم JC1 NS5AB-mKO2-BSD HCV سلالة، إضافة 10 ميكروغرام / مل blasticidin S إلى متوسطة "خفيفة" لتحديد لخلايا HCV إيجابي.
  3. 1 د قبل العزلة الدهون قطرة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، ويعرض للتريبسين، resuspend في "النور" و "الثقيل" المتوسطة، وعد الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور. بذور 7 × 10 6 خلايا من كل السكان في 150 سم 2 خلية طبق الثقافة. إعداد لا يقل عن 5 أطباق في "النور" و "الثقيل" سكان الخلية. ثقافة الخلايا في 30 مل من المتوسط ​​/ طبق O / N.
  4. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X. فصل الخلايا في 1XPBS باستخدام مكشطة الخلية.
  5. عدد سكان كل منهما خلية باستخدام غرفة عد نويباور وتجمع أعداد الخلايا متساوية في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 160 x ج و 4 ° C.
  6. إزالة PBS و resuspend بيليه خلية في 1 مل من عازلة السكروز (0.25 M السكروز، 1 ملم EDTA، و1 ملم DTT، على أن تستكمل مع الكوكتيل مثبط البروتياز). نقل تعليق خلية إلى ضيقة الخالط Dounce وليز الخلايا مع 200 السكتات الدماغية على الجليد.
    ملاحظة: تأكيد تحلل الخلية الكامل باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق.
  7. نقل المحللة في أنبوب 1.5 مل microfuge وتدور باستمرار نوى وحطام خلية لمدة 10 دقيقة في 1000 x ج و 4 ° C.
  8. بعد الطرد المركزي، وتخزين قسامة من 25 ميكرولتر من جزء آخر من الأسلحة النووية (PNS) في -20 ° C كعنصر تحكم الإدخال.
  9. ضع بقية جزء الجهاز العصبي المحيطي في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي (11 × 60 ملم) وتراكب مع العازلة الدهون قطرات تغسل (~ 3 مل، 4 مل طفلالله) (50 ملي العازلة فوسفات البوتاسيوم 7.4 درجة الحموضة، و 100 ملي كلوريد البوتاسيوم، 1 ملم EDTA، و1 ملم phenylmethanesulfonyl الفلورايد).
  10. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 ساعة عند 100000 x ج و 4 ° C. حصاد العائمة جزء الدهون قطرات باستخدام عازمة، قنية حادة من أعلى الأنبوب (حوالي 250-500 ميكرولتر، اعتمادا على كمية من قطرات الدهون). وضع جزء الدهون قطرة في أنبوب الطرد المركزي (11 × 60 ملم)، وتراكب مع العازلة الدهون قطرات تغسل (~ 3.5 مل، 4 مل الكل)، وكرر الخطوة الطرد المركزي.
  11. حصاد العائمة جزء الدهون قطرات باستخدام عازمة، قنية حادة من أعلى الأنبوب ونقل قطرات الدهون إلى 1.5 أنبوب جديد microfuge مل. إضافة 500 ميكرولتر من غسل العازلة الدهون قطرة وتدور لمدة 20 دقيقة في 21000 x ج و 4 ° C.
    ملاحظة: قطرات الدهون تظهر والفرقة بيضاء تطفو على أعلى العازلة.
  12. إزالة غسل العازلة تحتاني باستخدام هلام تحميل ماصة وكرر هذه الخطوة غسل ثلاث مرات.
  13. بعد إزالة النهائية للغسل العازلة باستخدام هلام تحميل ماصة، مزيج 5 ميكرولتر من الكسور قطرات الدهون مع 10 ميكرولتر من NP-40 تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.4 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 1٪ NP-40 ، على أن تستكمل مع الكوكتيل مثبط البروتياز). احتضان العينة على الجليد لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع المواد المعدية. تحديد مستوى البروتين مع بروتين فحص المنظفات متوافق. وهناك حاجة لا يقل عن 35 ميكروغرام من البروتين لMS-التحليل.
  14. تخزين الدهون كسور قطرة في -20 ° C.
  15. مزيج حجم المماثل من قطرات جزء الدهون مع 4x وصبغ التحميل. احتضان على الجليد لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع المواد المعدية. يغلي في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  16. فصل البروتينات باستخدام SDS-PAGE وفقا لبروتوكول الصانعين. نقل جل في الغروية حل تلطيخ Coomassie. استئصال جميع العصابات البروتين من الهلام. بعد تريبسيني في جل الهضم 24 </ سوب>، تتبخر العينات ويحل لهم في حمض الفورميك بنسبة 0.1٪. تحليل من قبل LC-MS / MS.
    ملاحظة: هنا، وLC-MS / MS أجريت التحليلات على الرباعي وقت من الطيران مطياف الكتلة (Q-TOF) أو على مصيدة الخطي الرباعي (LTQ) orbitrap مطياف الكتلة. وإلى جانب كل من الأدوات مع ESI المصدر إلى نظام نانو UPLC. تحليل البيانات وLC-MS / MS تحليل على Q-TOF وعلى مطياف الكتلة orbitrap أجريت على النحو المبين 21 و 22. الحرص على عدم تلويث العينة مع الكيراتين الإنسان. دائما استخدام نصائح ماصة خالية من الكيراتين وأنابيب. إعداد مخازن تحت غطاء تدفق الصفحي مع المواد الكيميائية خالية من الكيراتين. قبل الاستخدام، وتنظيف جميع الأسطح والأجهزة مع الماء المقطر والايثانول. دائما ارتداء القفازات ومعطف المختبر.

4. تحليل الدهون القطرة الطهارة

  1. تمييع aliquots من الدهون كسور قطرة 1: 2 وكسور الإدخال (راجع الخطوة 3.9) 01:10 مع NP-40 ليزهو العازلة. احتضان العينات في الثلج لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع المواد المعدية. تحديد مستوى البروتين مع بروتين فحص المنظفات متوافق.
  2. خلط كميات متساوية من البروتين العازلة مع عينة 6X واحتضان العينات في الثلج لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع المواد المعدية. المضي قدما SDS-PAGE ونقل البروتينات على غشاء النيتروسليلوز من النشاف دبابات على 80 V لمدة 90 دقيقة.
    ملاحظة: بعد حجب الغشاء في عرقلة العازلة (الخالي المجففة مسحوق الحليب 5٪ في TBS-T (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 0.05٪ Tween20))، واحتضان مع الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات قطرات الدهون (على سبيل المثال ، PLIN1، PLIN2، أو PLIN3) وعلامات من المقصورات التحت خلوية أخرى (على سبيل المثال، CALR، MnSOD، أو تويولين)، تليها الأجسام المضادة إلى جانب HRP الثانوية. استخدام التوهج للكشف عن البروتينات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

قطرات الدهون ضرورية لفيروس التهاب الكبد الوبائي مثل المواقع المفترضة التجمع الفيريون، ولكن الآليات الجزيئية من التشكل والخروج من virions غير معروفة إلى حد كبير. لتحديد عوامل التبعية المضيف جديدة تشارك في هذه العملية، أجرينا الكمي تحليل بروتيوم الدهون قطرة من الخلايا المصابة HCV 21 (الشكل 1A). أنشأنا بروتوكول لتنقية قطرات الدهون وبشكل روتيني الكشف عن تخصيب قوي من الدهون ملزم قطرة البروتينات PLIN2 / ADRP وPLIN...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

هنا، نحن تصف بروتوكول لعزل قطرات الدهون لتحليل الدهون قطرات بروتيوم الكمي لمقارنة التخصيب واستنزاف البروتينات المرتبطة قطرات الدهون في ظل ظروف ثقافة متنوعة، مثل الالتهابات الفيروسية. كطريقة بديلة، يمكن إجراء تحليل بروتيوم مع quantifications خالية من التسمية على أساس مجموع شدة الذروة. هذا الأسلوب لديه أي قيود النطاق الديناميكي ويتجنب المشاكل الأيضية. الاستفادة من نهج SILAC هي أن العينات يتم تجميع السابقة الدهون قطرات العزلة، وبالتالي فإن النتائج تكون مستقلة عن أخطاء في إعداد العينا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

نشكر R. Bartenschlager (جامعة هايدلبرغ) ليبني JC1، CM رايس (جامعة روكفلر) للخلايا Huh7.5، J مكلوشلان (مجلس البحوث الطبية وحدة علم الفيروسات) لبناء، T واكيتا (المعهد الوطني للJFH1 الأمراض المعدية، واليابان) لJFH1، وB وبستر ووك غرين (معهد جلادستون لعلم الفيروسات والمناعة) ليبني مراسل HCVcc. وأيد هذا العمل من جانب صناديق من DFG (HE 6889 / 2-1 (EH)، INST 337 / 15-1 2013، وINST 337 / 16-1 2013 (HS)). ويدعم معهد هاينريش بيت، معهد ليبنيز لعلم الفيروسات التجريبي من قبل الحرة ومدينة هامبورغ ووزارة الصحة الاتحادية. وكان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر، أو في الإعداد للمخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
طقم تكميم البروتين SILAC - DMEMThermo Fisher89983  
13C6 L-Arginine-HCl 50  mgThermo Fisher88210
Roti-Load 1Roth GmbHK929.1
Roti-Blue 5x ConcentrateRoth GmbHA152.2   ؛
10x SDS-Tris-Glycine - BufferGeyer Th. GmbH & amp Co.KG A1415,0250 
GlutaMAX (100x)Life Technologies GmbH 350500038 
محلول البنسلين / الستربتومايسين لزراعة الخلاياسيجما-ألدريتش كيمي GmbH  ؛P4333-100ml 
DPBS 1x Dulbecco's SalineSigma-Aldrich Chemie GmbH D8537 
Trypsin-EDTASigma-Aldrich Chemie GmbH T3924-100ML 
كلوريد الصوديوم BioChemica< / em>AppliChem GmbHA1149،1000
Tris Ultrapure    AppliChem GmbHA1086,5000A 
EDTA BioChemica< / em>AppliChem GmbHA1103,0250
كوكتيل مثبط البروتياز 5 ملSigma-Aldrich Chemie GmbH P8340-5ML 
D (+) -Sucrose BioChemica< / em>AppliChem GmbHA3935،1000
حمض الهيدروكلوريك (HCl) 37٪ Ph. Eur. ، NFAppliChem GmbHA0625
DC Protein Assay  ؛Bio-Rad Laboratoris GmbH 500-0116 
GlycerolAppliChem GmbH151339
SDS UltrapureAppliChem GmbHA1112
Bromophenol blueAppliChem GmbHA2331
& beta ; -Mercaptoethanol   ;AppliChem GmbHA4338
BlasticidinInvivogenant-bl-1   ؛
كلوريد البوتاسيوم AppliChem GmbHA1039
فينيل ميثان سولفونيل فلورايد   ;AppliChem GmbHA0999
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةسيجما-ألدريتش كيمي GmbH 221309
ثنائي البوتاسيوم هيدروجين فوسفاتسيجما ألدريتش كيمي GmbH P3786 
DTT AppliChem GmbHA2948
NP-40AppliChemA1694
TWEEN 20AppliChemA4974
مسحوق الحليب المجفف الخالي من الدسمAppliChemA0830
Anti-ADFP / ADRP   ؛أبكامAB52355
M6PRB1 / TIP47 100 & مايكرو ؛ زأبكامAB47639
كالريتيكولين ، pAb 200 & مايكرو ؛ زEnzo Life Science GmbH ADI-SPA-600-F 
مكافحة &>-Tubulin Sigma-Aldrich Chemie GmbH T6074 200 & ل  
الإيثانول المطلق (EtOH)Geyer Th. GmbH & amp Co.KG A3678,0250  
Anti-MnSODEnzo Life Science GmbH ADI-SOD-110-F
المضادة للفأر HRPثيرمو فيشر بيرس32430
مكافحة الأرانب HRPثيرمو فيشر   بيرس32460
Amersham Hyperfilm ECLGE Healthcare28906836
Lumi-Light Western Blotting SubstrateSigma-Aldrich Chemie GmbH 12015196001
96 بئر لوحة ثقافة الخلاياGreiner Bio-One GmbH 655 180 
حقنة تيرومو 1 ملTerumoSS-01T
Filtropur BT 50 ، 500 مل ، 0.45 & micro ؛ m SARSTEDT 83.1823.100 
الهلامية مسبقة الصب Mini-PROTEAN TGX ، أي هلام حل kDBio-Rad Laboratoris GmbH  ؛456-9034 
6-Well Cell Culture PlateGreiner Bio-One GmbH 657160 
أطباق Nunclon 150/20 فيشر ساينتفيك GmbH 10098720 - 168381 
مكشطة الخليةneoLab Migge GmbH C-8120 
أنبوب، 50 ملGreiner Bio-One GmbH 227261 
أنبوب SafeSeal خالي من RNase SARSTEDT 72.706.400 
أنابيب الطرد المركزي فائقة الوضوح 11 × 60 ممBeckman Coulter GmbH 344062 
إبر الشفطTranscodent6482
Biosphere Fil. نصيحة 1000 SARSTEDT 70.762.211 
المحيط الحيوي. نصيحة 200SARSTEDT 70.760.211 
المحيط الحيوي. نصيحة 10SARSTEDT 70.1130.210 
طاحونة المناديل DounceFisher Scientific GmbH 11883722
Pestles For Dounce جميع المطاحن الأنسجة الزجاجيةFisher Scientific GmbH 10389444
Orbitrap Fusion
Branson Sonifier 450
Thermomixer Comfort ، مع Thermoblock 1.5 ملEppendorf5355   ؛ 000.127
خلية ثلاثية صغيرة PROTEAN ، وحدة صغيرة عبر اللطخة ، ومصدر طاقة أساسي PowerPac ،   ؛BioRad165-8033
Mini-PROTEAN 3 غرفة الصب المتعددةBioRad165-4110
PowerPac HC Power SupplyBiorad164-5052
الطرد المركزي مركزي Eppendorf5424R
 Eppendorf5424
Optima L-90KBeckman Coulter GmbH 365670
SW 60 Ti RotorBeckman Coulter GmbH 335649
إنفينيت M1000 PROتيكان
المواد أجهزة جهاز طرد

المراجع

  1. Thiam, A. R., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. The biophysics and cell biology of lipid droplets. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).
  2. Welte, M. A. Expanding roles for lipid droplets. Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).
  3. Brasaemle, D. L. Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis. J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).
  4. Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER. J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).
  5. Kory, N., Farese, R. V. Jr, Walther, T. C. Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets. Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).
  6. Hashemi, H. F., Goodman, J. M. The life cycle of lipid droplets. Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).
  7. Gao, Q., Goodman, J. M. The lipid droplet-a well-connected organelle. Front Cell Dev Biol. 3, 49(2015).
  8. Herker, E., Ott, M. Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions. J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).
  9. Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. Estimates on HCV disease burden worldwide - filling the gaps. J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).
  10. Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land. Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).
  11. Lindenbach, B. D., Rice, C. M. The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly. Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).
  12. Barba, G., et al. Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).
  13. Shi, S. T., et al. Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology. 292 (2), 198-210 (2002).
  14. Herker, E., et al. Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1. Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).
  15. Camus, G., et al. Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core. J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).
  16. Miyanari, Y., et al. The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production. Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).
  17. Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus. J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).
  18. Vogt, D. A., et al. Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein. PLoS Pathog. 9 (4), e1003302(2013).
  19. Ploen, D., et al. TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus. J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).
  20. Ploen, D., et al. TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles. Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).
  21. Rosch, K., et al. Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production. Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).
  22. Kwiatkowski, M., et al. Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).
  23. Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus. J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).
  24. Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes. Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).
  25. Ting, L., et al. Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling. Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).
  26. Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes. J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).
  27. Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3' untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells. Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).
  28. Ariumi, Y., et al. DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication. J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).
  29. Weinlich, S., et al. IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3'UTR. RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SILAC SDS PAGE LC ESI MS MS HCV Perilipin

مقالات ذات صلة