الدهون عزل القطرة عن التحليل الكمي الطيف الكتلي

قطرات الدهون هي غاية الحيوية هيولي (والنووية) عضيات الخلية تتكون من مجموعة أساسية من الدهون المحايدة (الدهون الثلاثية (TG) والكوليسترول استر (CE)) محاطة أحادي الطبقة من الدهون الفوسفاتية مع البروتينات جزءا لا يتجزأ ^1. جميع أنواع الخلايا تنتج قطرات الدهون، ولكنها تختلف في الحجم والتكوين الدهون، والديكور البروتين. قطرات الدهون الوفاء وظائف متنوعة، بما في ذلك منصب الطاقة والسلائف غشاء الخزانات أو ودائع البروتين. وبالإضافة إلى ذلك، من خلال امتصاص الدهون، وأنها تحمي الخلايا من lipotoxicity، والدهون الإفراج كما يشير الجزيئات، ويشاركون في تدهور البروتين والشبكة الإندوبلازمية (ER) استجابات التوتر ^2. على هذا النحو، ومجموعة من البروتينات ربط قطرات الدهون ويحكم جيلهم، وتدهور، والاتجار، والتفاعل مع العضيات الأخرى. ومن بين هذه الأسرة perilipin من البروتينات الدهنية قطرة ملزمة الحسنة النية (PLIN1-5)و "> 3.

الدهون قطرات نشوء حيوي المرجح يبدأ في ER، حيث تحفيز الانزيمات-ER المقيمين تركيب الدهون المحايدة التي تتراكم داخل طبقة ثنائية الغشاء، وتشكيل عدسة الدهون المحايدة، وهي العملية التي كانت تصور في الآونة الأخيرة بشكل جيد في الخميرة ^4. ثم ويعتقد أن غشاء الانحناء وارتفاع مستويات حمض ومادة ال diacylglycerol الفسفاتيديك لجذب البروتينات المشاركة في التركيب الحيوي فوسفورية، وتركيب وقت واحد من الدهون المحايدة الأساسية والدهون الفوسفاتية التدريع مطلوب لتوليد الدهون قطرات ^5. الانزيمات إيواء المجالات عبر الغشاء الذي يقيم في ER تحفيز هذه العملية. التوسع إلى قطرات الدهون الكبيرة يتطلب النشاط من فئة مختلفة من الإنزيمات تجميع الدهون التي تؤوي على الحلزون متقابلة الزمر وبالتالي يمكن السفر من ER إلى قطرات الدهون. تعبئة الدهون من قطرات الدهون يحدث من خلال تفعيل المحلي للtriglyceridه ومادة ال diacylglycerol الليباز الليباز الدهنية الدهون الثلاثية (ATGL) وهرمون الليباز حساسة (HSL) أو عن طريق مسارات ذاتية البلعمة مختلفة، مثل الاقتصاد الكلي والاقتصاد microlipophagy أو الالتهام الذاتي ⁶ الوصيفة بوساطة. قطرات الدهون تتفاعل مع العضيات الخلوية الأخرى، مثل الميتوكوندريا (لبيتا للأكسدة والتوليف الدهن) وER (لتخليق الدهون والاتجار البروتين)، ولكن أيضا مع الجسيمات الحالة، الإندوسومات، والفجوات الناجمة عن البكتيريا داخل الخلايا ^7. في الواقع البكتيريا والفيروسات والطفيليات حتى تستهدف قطرات الدهون للنسخ المتماثل والمثابرة، من بينها HCV ^8.

فيروس التهاب الكبد الوبائي هو أحد الأسباب الرئيسية للمراضة ذات الصلة الكبد والوفاة في جميع أنحاء العالم، وهو ما يمثل حوالي 0.5 مليون حالة وفاة سنويا ^9. العدد الحقيقي للإصابات HCV غير معروف، ولكن تشير التقديرات الأخيرة التي 130-150٬000٬000 الناس مصابون بشكل مزمن. لا VACCINيوجد الإلكترونية، ولكن تمت الموافقة عليه مؤخرا مضادات الفيروسات المفعول المباشر زيادة كبيرة الاستجابات العلاجية مقارنة مع العلاج القائم على فيروسات القياسية. ومع ذلك، في جميع أنحاء العالم، من المرجح أن يقتصر علاج المرضى بسبب التكاليف الباهظة للعلاجات جديدة. ما يقرب من نصف جميع الأفراد المصابين المزمنين مع HCV تطوير مرض الكبد الدهني (تنكس دهني)، وهي حالة تتميز التراكم المفرط للقطرات الدهون في خلايا الكبد. ومن المثير للاهتمام، ظهرت قطرات الدهون أيضا العضيات الخلوية كما الحيوية للنسخ المتماثل HCV، خدمة مزعومة كمواقع التجمع الفيروسية ^{10، 11.}

في الخلايا المصابة HCV، جوهر البروتين الفيروسي وNS5A توطين لقطرات الدهون في عملية تعتمد على مكونات الدهون الثلاثية، ومثبطات مادة ال diacylglycerol ناقلة الأسيل-1 (DGAT1) يضعف الاتجار إلى قطرات الدهون وHCV لاحق إنتاج الجسيمات ¹² و ^{13 و 14 و 15.} وبالإضافة إلى ذلك، والطفرات في الدهون المجالات ملزم قطرة إما الأساسية أو NS5A قمع HCV التجمع ^{16 و 17.} الأساسية وNS5A ثم تجنيد جميع البروتينات الفيروسية الأخرى، وكذلك المجمعات تكرار RNA الفيروسي، إلى الأغشية المرتبطة بشكل وثيق مع دهن قطرات ^16. مطلوب إجراءات متضافرة من جميع البروتينات الفيروسية لإنتاج الناجح للسلالة الفيروسية المعدية ^{10 و 11.} البروتينات الهيكلية هي جزء من virions، والبروتينات غير الهيكلية تعزيز التفاعلات البروتين البروتين المطلوبة لهذه العملية. ومن المثير للاهتمام، يطلب من حسن النية الدهون ملزم قطرة البروتين PLIN3 / TIP47 لكل من تكرار RNA HCV وإطلاق سراح virions ^{18 و 19} 20. وعلى الرغم من هذه التطورات الأخيرة، وتفاصيل الآلية، وخاصة من التفاعلات الفيروسات المضيف أثناء المراحل المتأخرة من تكرار HCV، لا تزال غير محددة، وظيفة محددة من قطرات الدهون غير معروف.

هنا، نحن تصف طريقة لعزل قطرات الدهون لقياس الطيف الكتلي الكمي من البروتينات المرتبطة بها. باستخدام هذا الأسلوب، وجدنا تغيرات عميقة في بروتيوم الدهون الحبرية خلال فيروس التهاب الكبد الوبائي، وحددت A3 annexin كما بروتين المضيف الذي مع قطرات الدهون-fractionates التعاون ومطلوب لHCV كفاءة نضوج ^21.

1. إعداد وسائل الإعلام عن مستقرة النظائر وسمها مع الأحماض الأمينية في الثقافة الخليوي (SILAC)

ملاحظة: هنا، والكميات كيت SILAC البروتين - DMEM تستكمل مع 50 ملغ من ¹³ C ₆ L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك كانت تستخدم لوضع العلامات SILAC. يتم توفير مدال الجنين العجل المصل (FCS) مع مجموعة الكميات SILAC البروتين.

1. إزالة 50 مل من كل زجاجة من DMEM المتوسطة وإضافة 50 مل من FCS مدال.
2. حل 50 ملغ من ¹³ C ₆ L-ليسين-2HCl و 50 ملغ من ¹³ C ₆ L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك في 1 مل من المتوسط. تخلط جيدا وإضافة الأحماض الأمينية إلى المتوسطة DMEM + FCS.
3. إضافة 1X القلم / بكتيريا و1X-L الجلوتامين بديلا. معقم مرشح المتوسط ​​باستخدام فلتر 0.45 ميكرون. تسمية زجاجة كوسط SILAC "الثقيل".
4. لإعداد "خفيفة" المتوسطة، كرر الخطوات من 1،1-1،3 باستخدام 50 ملغ من L-أرجينين، حمض الهيدروكلوريك و 50 ملغ من L-ليسين-2HCl. تسمية زجاجة باسم "ضوء "المتوسطة SILAC.

2. SILAC وضع العلامات والأحماض الأمينية تحكم التأسيس

1. يعرض للتريبسين الخلايا (1X التربسين-EDTA) وانقسام 1 × 10 ⁵ Huh7.5 الخلايا في 2 آبار لوحة الثقافة 6 جيدا تحتوي على 2 مل من المتوسط، واحدة بشكل جيد مع المتوسط SILAC "الثقيل" واحد مع "النور" SILAC المتوسطة.
2. ثقافة الخلايا لمدة لا تقل عن 6 مقاطع (نسبة انقسام: 1: 6)؛ بعد 6 فقرات، يجب أن يكون إدراج الأحماض الأمينية "الثقيلة" أكثر من 95٪.
3. حصاد 1 × 10 ⁶ خلايا "الثقيل" - السكان الخلية -labeled و "النور" لتحليل فعالية التأسيس. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X وبيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 160 x ج و 4 ° C.
4. إعادة تعليق الكريات الخلايا في 150 ميكرولتر من MS-العازلة (150 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.4 درجة الحموضة، و1 ملم EDTA تستكمل مع 1X كوكتيل مثبط البروتياز)، واحتضان الخلايا على الجليد لمدة 30 دقيقة. ليز جملتعلمي اللغة اإلنكليزية صوتنة في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: فيما يلي إعدادات صوتنة المستخدمة هنا: توقيت، عقد. مراقبة الانتاج، 8؛ دورة العمل، 80٪، و2 × 30 نبضة.
5. إزالة الحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في 11000 x ج و 4 ° C. نقل طاف لأنبوب جديد وتحديد تركيز البروتين مع بروتين فحص المنظفات متوافق.
6. خلط 75 ميكروغرام من البروتين العازلة مع عينة 6X (375 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 6.8، 25.8٪ الجلسرين، 123 ملغ / مل SDS، 600 ميكروغرام / مل برموفينول الأزرق، و 60 ميكرولتر / مل β-المركابتويثانول)، يغلي في درجة حرارة 95 درجة C لمدة 5 دقائق، وفصل البروتينات عن طريق SDS-PAGE في SDS العازلة تشغيل (3.02 جم / L تريس قاعدة، 18.8 غ / L الجلايسين، و 1 غرام / L SDS) في 180 V لحوالي 1 ساعة أو وفقا لمصنعي "التعليمات.
7. نقل جل في الغروية حل تلطيخ Coomassie. استئصال الفرقة البروتين نفسه من كل حارة. هضم البروتينات مع التربسين وتحليل فعالية التأسيس من قبل MS تحليل سياسيالصورة، كما هو موضح ^22.

3. الدهون القطرة عزل الخلايا Huh7.5 المسمى SILAC

1. تصيب السكان واحدة من الخلايا (أي تلك التي وصفت مع الأحماض "خفيفة" الأمينية) مع فيروس مراسل HCV التي يحتضنها مع مخزونات فيروس (على سبيل المثال، JC1 ^{NS5AB-mKO2-BSD،} MOI 1) لمدة 4 ساعات في 37 درجة مئوية، كما هو موضح ²¹ .
   ملاحظة: JC1 ^{NS5AB-mKO2-BSD} هو فيروس HCV يحمل مراسل مضان (أحادى Kusabira أورانج 2، mKO2) لمراقبة معدلات الإصابة تليها Blasticidin المقاومة جين (BSD) بين تكرار موقع NS5A-NS5B الانقسام، التي سبق وصفها ^{21، 23.} العمل مع HCV يتطلب BSL2 + (USA) أو S3 ** (ألمانيا) الاحتواء والممارسات على مستوى السلامة الحيوية. بدلا من الإصابة بفيروس HCV، وخلايا يمكن أن يصاب مع مسببات الأمراض المختلفة.
2. توسيع الخلايا المصابة HCV "الخفيفة" وغير مصاب & #34؛ الخلايا الثقيلة "خلال الركض من الثقافات، وتحديد قسامة مع بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في برنامج تلفزيوني وتحديد معدلات الإصابة HCV التدفق الخلوي من البروتين علامة فلوري (على سبيل المثال، mKO2)، كما هو موضح ^21، و وينبغي أن تكون معدلات الإصابة أعلى من 90٪ للدهن قطيرة العزلة ملاحظة: إذا كنت تستخدم JC1 ^{NS5AB-mKO2-BSD} HCV سلالة، إضافة 10 ميكروغرام / مل blasticidin S إلى متوسطة "خفيفة" لتحديد لخلايا HCV إيجابي.
3. 1 د قبل العزلة الدهون قطرة، وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني، ويعرض للتريبسين، resuspend في "النور" و "الثقيل" المتوسطة، وعد الخلايا باستخدام غرفة عد نويباور. بذور 7 × 10 ⁶ خلايا من كل السكان في 150 سم ² خلية طبق الثقافة. إعداد لا يقل عن 5 أطباق في "النور" و "الثقيل" سكان الخلية. ثقافة الخلايا في 30 مل من المتوسط ​​/ طبق O / N.
4. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا في برنامج تلفزيوني 1X. فصل الخلايا في 1XPBS باستخدام مكشطة الخلية.
5. عدد سكان كل منهما خلية باستخدام غرفة عد نويباور وتجمع أعداد الخلايا متساوية في أنبوب الطرد المركزي 50 مل. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 160 x ج و 4 ° C.
6. إزالة PBS و resuspend بيليه خلية في 1 مل من عازلة السكروز (0.25 M السكروز، 1 ملم EDTA، و1 ملم DTT، على أن تستكمل مع الكوكتيل مثبط البروتياز). نقل تعليق خلية إلى ضيقة الخالط Dounce وليز الخلايا مع 200 السكتات الدماغية على الجليد.
   ملاحظة: تأكيد تحلل الخلية الكامل باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق.
7. نقل المحللة في أنبوب 1.5 مل microfuge وتدور باستمرار نوى وحطام خلية لمدة 10 دقيقة في 1000 x ج و 4 ° C.
8. بعد الطرد المركزي، وتخزين قسامة من 25 ميكرولتر من جزء آخر من الأسلحة النووية (PNS) في -20 ° C كعنصر تحكم الإدخال.
9. ضع بقية جزء الجهاز العصبي المحيطي في الجزء السفلي من أنبوب الطرد المركزي (11 × 60 ملم) وتراكب مع العازلة الدهون قطرات تغسل (~ 3 مل، 4 مل طفلالله) (50 ملي العازلة فوسفات البوتاسيوم 7.4 درجة الحموضة، و 100 ملي كلوريد البوتاسيوم، 1 ملم EDTA، و1 ملم phenylmethanesulfonyl الفلورايد).
10. أجهزة الطرد المركزي لمدة 2 ساعة عند 100000 x ج و 4 ° C. حصاد العائمة جزء الدهون قطرات باستخدام عازمة، قنية حادة من أعلى الأنبوب (حوالي 250-500 ميكرولتر، اعتمادا على كمية من قطرات الدهون). وضع جزء الدهون قطرة في أنبوب الطرد المركزي (11 × 60 ملم)، وتراكب مع العازلة الدهون قطرات تغسل (~ 3.5 مل، 4 مل الكل)، وكرر الخطوة الطرد المركزي.
11. حصاد العائمة جزء الدهون قطرات باستخدام عازمة، قنية حادة من أعلى الأنبوب ونقل قطرات الدهون إلى 1.5 أنبوب جديد microfuge مل. إضافة 500 ميكرولتر من غسل العازلة الدهون قطرة وتدور لمدة 20 دقيقة في 21000 x ج و 4 ° C.
    ملاحظة: قطرات الدهون تظهر والفرقة بيضاء تطفو على أعلى العازلة.
12. إزالة غسل العازلة تحتاني باستخدام هلام تحميل ماصة وكرر هذه الخطوة غسل ثلاث مرات.
13. بعد إزالة النهائية للغسل العازلة باستخدام هلام تحميل ماصة، مزيج 5 ميكرولتر من الكسور قطرات الدهون مع 10 ميكرولتر من NP-40 تحلل العازلة (50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 7.4 درجة الحموضة، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 1٪ NP-40 ، على أن تستكمل مع الكوكتيل مثبط البروتياز). احتضان العينة على الجليد لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع المواد المعدية. تحديد مستوى البروتين مع بروتين فحص المنظفات متوافق. وهناك حاجة لا يقل عن 35 ميكروغرام من البروتين لMS-التحليل.
14. تخزين الدهون كسور قطرة في -20 ° C.
15. مزيج حجم المماثل من قطرات جزء الدهون مع 4x وصبغ التحميل. احتضان على الجليد لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع المواد المعدية. يغلي في درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
16. فصل البروتينات باستخدام SDS-PAGE وفقا لبروتوكول الصانعين. نقل جل في الغروية حل تلطيخ Coomassie. استئصال جميع العصابات البروتين من الهلام. بعد تريبسيني في جل الهضم ^{24 <}/ سوب>، تتبخر العينات ويحل لهم في حمض الفورميك بنسبة 0.1٪. تحليل من قبل LC-MS / MS.
    ملاحظة: هنا، وLC-MS / MS أجريت التحليلات على الرباعي وقت من الطيران مطياف الكتلة (Q-TOF) أو على مصيدة الخطي الرباعي (LTQ) orbitrap مطياف الكتلة. وإلى جانب كل من الأدوات مع ESI المصدر إلى نظام نانو UPLC. تحليل البيانات وLC-MS / MS تحليل على Q-TOF وعلى مطياف الكتلة orbitrap أجريت على النحو المبين ^{21 و 22.} الحرص على عدم تلويث العينة مع الكيراتين الإنسان. دائما استخدام نصائح ماصة خالية من الكيراتين وأنابيب. إعداد مخازن تحت غطاء تدفق الصفحي مع المواد الكيميائية خالية من الكيراتين. قبل الاستخدام، وتنظيف جميع الأسطح والأجهزة مع الماء المقطر والايثانول. دائما ارتداء القفازات ومعطف المختبر.

4. تحليل الدهون القطرة الطهارة

1. تمييع aliquots من الدهون كسور قطرة 1: 2 وكسور الإدخال (راجع الخطوة 3.9) 01:10 مع NP-40 ليزهو العازلة. احتضان العينات في الثلج لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع المواد المعدية. تحديد مستوى البروتين مع بروتين فحص المنظفات متوافق.
2. خلط كميات متساوية من البروتين العازلة مع عينة 6X واحتضان العينات في الثلج لمدة 1 ساعة إلى تعطيل الفيروس إذا كان يعمل مع المواد المعدية. المضي قدما SDS-PAGE ونقل البروتينات على غشاء النيتروسليلوز من النشاف دبابات على 80 V لمدة 90 دقيقة.
   ملاحظة: بعد حجب الغشاء في عرقلة العازلة (الخالي المجففة مسحوق الحليب 5٪ في TBS-T (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 7.6، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 0.05٪ Tween20))، واحتضان مع الأجسام المضادة الموجهة ضد علامات قطرات الدهون (على سبيل المثال ، PLIN1، PLIN2، أو PLIN3) وعلامات من المقصورات التحت خلوية أخرى (على سبيل المثال، CALR، MnSOD، أو تويولين)، تليها الأجسام المضادة إلى جانب HRP الثانوية. استخدام التوهج للكشف عن البروتينات.

قطرات الدهون ضرورية لفيروس التهاب الكبد الوبائي مثل المواقع المفترضة التجمع الفيريون، ولكن الآليات الجزيئية من التشكل والخروج من virions غير معروفة إلى حد كبير. لتحديد عوامل التبعية المضيف جديدة تشارك في هذه العملية، أجرينا الكمي تحليل بروتيوم الدهون قطرة من الخلايا المصابة HCV 21 (الشكل 1A). أنشأنا بروتوكول لتنقية قطرات الدهون وبشكل روتيني الكشف عن تخصيب قوي من الدهون ملزم قطرة البروتينات PLIN2 / ADRP وPLIN3 / TIP47 واستنزاف علامات الأجزاء الخلوية الأخرى، مثل β تويولين للالأنابيب الدقيقة، MnSOD للالميتوكوندريا، أو calreticulin / calnexin لER (الشكل 1B، C). نحن بتجميع قائمة من البروتينات التي cofractionate موثوق مع قطرات الدهون في الخلايا Huh7.5 (1D الشكل)، وذلك باستخدام النظائر وضع العلامات، والبروتينات التي تم تحديدها على وجه التحديد أن يتم تجنيدأو النازحين من قطرات الدهون في الخلايا المصابة HCV (الشكل 1E). وتشير النتائج التي توصلنا إليها HCV يفصل قطرات الدهون من وظيفة عادية في التمثيل الغذائي و / أو تنظيم وتحديد تبعية المضيفة وتقييد العوامل المفترضة.

شكل 1: (A) مخطط للتجربة. وصفت الخلايا Huh7.5 ساذجة مع الأحماض الأمينية "الثقيل" أو "خفيفة" الأحماض الأمينية. والخلايا المصابة تحمل "خفيفة" الأحماض الأمينية مع فيروس HCV مراسل (JC1 NS5AB-mKO2-BSD). كانت مختلطة "لايت" و "الثقيل" السكان المسمى الأحماض الأمينية، وتم عزل قطرات الدهون من قبل اثنين من تنبيذ فائق لاحق وثلاثة غسل الخطوات، مفصولة SDS-PAGE، وتحليلها من قبل LC-ESI-MS / MS. لاحظ العائمة الأبيض جزء الدهون قطرة (السهم الأحمر) بعد ultracentrifugati على والغسيل في أنابيب microfuge. (B) تحليل لطخة غربية الكسور قطرة آخر النووية والدهون ويظهر في إثراء الدهون البروتينات قطرة علامة في أجزاء قطرات الدهون واستنزاف علامات الأجزاء الخلوية الأخرى. (C) Coomassie الأزرق والفضة تلطيخ من طاف بعد النووي (السندات الإذنية) وكسور قطرات الدهون مفصولة SDS-PAGE. ويرد تلطيخ الفضة لتصور فقط. (D) مخطط النشاط لعدد من الببتيدات ونسبة التغطية بروتين من البروتينات التي تم تحديدها في كسور الدهون قطرة من خلايا Huh7.5 (قطع: ≥5 الببتيدات وتغطية ≥20٪). (E) مخطط النشاط يصور المخصب أو المنضب الدهون البروتينات المرتبطة قطرة بعد الإصابة بفيروس HCV (تطبيع لمتوسط، قطع 1.5 أضعاف، * ف <0.05، ** ف <0.01 ***، ف <0.001). تعديل من 21.وآخرون = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.