توفر هذه المقالة طريقة مفصلة لإجراء فحص الكيميائي العدلة السريع عن طريق دمج العزلة على رقاقة العدلات من الدم الكامل واختبار الكيميائي على رقاقة ميكروفلويديك واحدة.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
طريقة الكل على رقاقة للتحليل الكيميائي العدلات السريعة مباشرة من قطرة الدم
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
العدلات الهجرة و الكيميائي حاسمة لجهاز المناعة في الجسم. وتستخدم الأجهزة ميكروفلويديك على نحو متزايد للتحقيق الهجرة العدلات والكيماوية نظرا لمزاياها في التصور في الوقت الحقيقي، ومراقبة دقيقة لتوليد تركيز تركيز الكيميائية، وانخفاض كاشف واستهلاك العينة. في الآونة الأخيرة، وقد بذلت جهود متزايدة من قبل الباحثين ميكروفلويديك نحو تطوير متكاملة وسهلة التشغيل نظم تحليل الكيميائي ميكروفلويديك، مباشرة من الدم كله. في هذا الاتجاه، وقد تم تطوير أول طريقة على كل رقاقة لدمج تنقية سلبية المغناطيسي من العدلات والمقايسة الكيميائي من عينات حجم الدم الصغيرة. هذه الطريقة الجديدة تسمح السريعة عينة إلى نتيجة اختبار العدلات الكيميائي في 25 دقيقة. في هذه الورقة، ونحن نقدم مفصلة البناء والتشغيل وتحليل البيانات طريقة لهذا الفحص الكيميائي الكل على رقاقة مع مناقشة حول استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها، ييميوالتوجهات والاتجاهات المستقبلية. تظهر النتائج التمثيلية للاختبار الكيميائي العدلات اختبار كاشف كيميائي محدد، N -Formyl-ميت-ليو-ف (فملب)، والبلغم من مرض الانسداد الرئوي المزمن (كوبد)، وذلك باستخدام هذه الطريقة كل على رقاقة. هذا الأسلوب ينطبق على العديد من التحقيقات المتعلقة بالهجرة الخلية والتطبيقات السريرية.
المقدمة
الكيميائي، وهي عملية موجهة للهجرة الخلية للذوبان التدرج الكيميائي التدرج، وتشارك بشكل حاسم في العديد من العمليات البيولوجية بما في ذلك الاستجابة المناعية 1 ، 2 ، 3 ، تطوير الأنسجة 4 والسرطان الانبثاث 5 . العدلات هي مجموعة فرعية من خلايا الدم البيضاء الأكثر وفرة وتلعب أدوارا حاسمة في تمكين وظائف الدفاع المضيف الفطرية الجسم، وكذلك في الوساطة الاستجابات المناعية التكيفية 6 ، 7 . وقد تم تجهيز العدلات بآلات كيميائية عالية التنظيم تسمح لهذه الخلايا المناعية المتحركة بالاستجابة لكل من الممتصات الكيميائية المستمدة من الممرضات (على سبيل المثال فملب) والمشتقات الكيميائية المستمدة من المضيف (على سبيل المثال إنتيرليوكين 8) من خلال إيمشيموتاكسيس 8 . العدلات الهجرة والكيميائية توسط مختلف المشاكل الفسيولوجيةوالأمراض مثل الالتهابات والسرطانات 1 ، 9 . وبالتالي، فإن التقييم الدقيق للالعدلات الكيميائي يوفر قراءات وظيفية هامة لدراسة البيولوجيا العدلات والأمراض المرتبطة بها.
بالمقارنة مع المقايسات الكيميائي التقليدية المستخدمة على نطاق واسع (على سبيل المثال مقايسة ترانسويل 10 )، وأجهزة ميكروفلويديك تظهر وعدا كبيرا لتقييم الكمي للهجرة الخلية والكيماوية بسبب جيل التدرج الكيميائي تسيطر على وجه التحديد والتصغير 11 ، 12 ، 13 . على مدى العقدين الماضيين أو نحو ذلك، وقد وضعت مختلف الأجهزة ميكروفلويديك لدراسة الكيميائي من أنواع الخلايا البيولوجية المختلفة، وخاصة العدلات 11 . وقد كرس جهد كبير لتوصيف الهجرة العدلات في تشي معقد من الناحية المكانية التدرجات ميكال التي تم تكوينها في الأجهزة ميكروفلويديك 14 ، 15 . وقد وضعت استراتيجيات مثيرة للاهتمام أيضا لدراسة اتخاذ القرارات الاتجاهية عن طريق العدلات باستخدام الأجهزة ميكروفلويديك 16.Aside من البحوث الموجهة بيولوجيا، وقد تم تمديد تطبيقات الأجهزة ميكروفلويديك لاختبار العينات السريرية لتقييم المرض 17 ، 18 ، 19 . ومع ذلك، فإن استخدام العديد من الأجهزة ميكروفلويديك يقتصر على مختبرات البحوث المتخصصة ويتطلب العزلة العدلات مطولة من حجم كبير من عينات الدم. لذلك، كان هناك اتجاه متزايد لتطوير أجهزة ميكروفلويديك متكاملة للتحليل الكيميائي العدلات السريع مباشرة من قطرة من الدم الكامل 20 ، 21 ، 22 ،إف "> 23 ، 24 .
نحو هذا الاتجاه، تم تطوير طريقة كل على رقاقة أن يدمج تنقية العدلات السلبية المغناطيسية والمقايسة الكيميائي اللاحقة على جهاز ميكروفلويديك واحد 25 . هذه الطريقة على كل رقاقة لديه الميزات الجديدة التالية: 1) على النقيض من الاستراتيجيات السابقة على رقاقة أن عزل العدلات من الدم عن طريق الالتصاق الخلية القائمة على الالتصاق أو الخلية القائمة على حجم الترشيح 20 ، 22 ، هذه الطريقة الجديدة تسمح عالية النقاء، على رقاقة الفصل المغناطيسي من العدلات من كميات صغيرة من الدم كله، فضلا عن قياس الكيميائي على التحفيز الكيميائي. 2) هيكل لرسو السفن الخلية يساعد على محاذاة المواقف الأولية للعدلات قريبة من قناة التدرج الكيميائية ويسمح تحليل الكيميائي بسيط دون تتبع خلية واحدة. 3) دمج العزلة العدلات و تشيموتمحور الفحص على جهاز واحد ميكروفلويديك يسمح السريع تحليل عينة إلى نتيجة الكيميائي في 25 دقيقة عندما لا يكون هناك انقطاع بين الخطوات التجريبية.
توفر هذه الورقة بروتوكول مفصل لبناء وتشغيل وطريقة تحليل البيانات من هذا كله على رقاقة الفحص الكيميائي. وتظهر الورقة الاستخدام الفعال للطريقة المتقدمة لأداء الكيميائي العدلات عن طريق اختبار معروفة كيميائي المؤتلف المعروفة وعينات كيميائية معقدة من المرضى، تليها مناقشة حول استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها، والقيود والاتجاهات المستقبلية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وتمت الموافقة على جميع بروتوكولات جمع العينات البشرية من قبل مجلس أخلاقيات البحوث المشتركة بين أعضاء هيئة التدريس في جامعة مانيتوبا، وينيبيغ.
1. ميكروفلويديك جهاز تلفيق ( الشكل 1A )
- تصميم وشفافية قناع الطباعة.
- تصميم الجهاز كما هو مفصل سابقا 25 . انظر الشكل 1 أ .
ملاحظة: يتضمن الجهاز طبقتين. الطبقة الأولى (4 ميكرون عالية) يحدد الخلية قناة لرسو السفن لاقتراض الخلايا بجانب قناة التدرج. الطبقة الثانية (60 ميكرون عالية) يحدد قناة توليد التدرج، والميناء وقناة لتحميل الخلايا، وخزانات مدخل الكيميائية ومخرج النفايات. تم تصميم علامات المحاذاة للطبقتين. للطبقة الثانية، وطول وعرض قناة الإدخال اعوج المنبع هو 60 مم و 200 ميكرون، على التوالي. طول وعرض المصبقناة اعوج الإدخال هو 6 ملم و 280 ميكرون، على التوالي. - اطبع ملامح الطبقة الأولى والثانية إلى قناع الشفافية باستخدام طابعة عالية الدقة.
ملاحظة: تعتمد دقة الطباعة على الحد الأدنى من الميزات في التصميم. في التصميم الحالي، تم اختيار 32،000 نقطة في البوصة لمدة 10 ميكرون الحد الأدنى من الميزات.
- تصميم الجهاز كما هو مفصل سابقا 25 . انظر الشكل 1 أ .
- تنظيف رقاقة السيليكون.
- وضع 3 في رقاقة السيليكون في منظف البلازما. تطبيق فراغ لمدة 3 دقائق.
- تشغيل الطاقة البلازما وتعيين مستوى إلى عالية. استخدام البلازما الأكسجين لعلاج رقاقة السيليكون لمدة 30 دقيقة.
- إيقاف نظافة البلازما وإخراج رقاقة السيليكون. رقاقة السيليكون مستعدة لتصنيع قالب الجهاز.
- تصنع الطبقة الأولى بواسطة ضوئيات في منشأة غرف الأبحاث.
ملاحظة: قد تختلف المعلمات تلفيق الدقيق اعتمادا على منشأة تصنيع.- تمييع 10 مل سو-8 2025 مع 10 مل SU-8 2000 في كسارة الزجاج لإعداد مقاومة للضوء مصممة. ترك الخليط في غطاء الدخان لمدة 10 دقيقة حتى تختفي الفقاعات.
- وضع بعناية رقاقة السيليكون تنظيفها على الدوار مع تشاك مناسبة وتطبيق الفراغ لشل رقاقة السيليكون.
- صب بعناية 3 مل من خليط مقاومة للضوء على مركز رقاقة السيليكون. تدور في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان. ثم تدور في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية للحصول على النهائي 4 ميكرون سمك طلاء مقاوم للضوء على رقاقة السيليكون.
- إزالة بعناية رقاقة السيليكون من الدوار ويخبز رقاقة السيليكون على موقد لمدة 4 دقائق في 95 درجة مئوية.
- وضع بعناية رقاقة السيليكون على قناع اليجنر وتعيين وقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية إلى 6 ثوان. نعلق بعناية قناع الشفافية من الطبقة الأولى على لوحة زجاجية شفافة باستخدام شريط لاصق.
- ضع بلطف لوحة الزجاج الشفاف مع قناع المرفقة إلى ألينر ومحاذاة قناع مع رقاقة السيليكون. فضح سيليكون رقاقة إلى الأشعة فوق البنفسجية لنمط هيكل لرسو السفن الخلية.
- إزالة بعناية لوحة من الزجاج وإخراج رقاقة السيليكون المكشوفة. خبز رقاقة السيليكون على موقد لمدة 4 دقائق في 95 درجة مئوية.
- نقل رقاقة السيليكون إلى غطاء الدخان ووضعه في وعاء زجاجي يحتوي على سو-8 المطور. هز بلطف هذا لمدة 30 ثانية.
- تنظيف رقاقة السيليكون باستخدام الطازجة سو-8 المطور تليها الأيزوبروبيل (إيبا) داخل غطاء الدخان. تجفيف رقاقة السيليكون بواسطة غاز النيتروجين داخل غطاء الدخان. الطبقة الأولى جاهزة.
- قم بتفريق الطبقة الثانية على الطبقة الأولى.
- استخدام شريط لاصق لتغطية علامات المحاذاة على الطبقة الأولى. وضع بعناية رقاقة السيليكون مع الطبقة الأولى على تشاك فراغ الدوار وتطبيق فراغ لشل رقاقة السيليكون.
- صب 3 مل من سو-8 2025 مقاوم للضوء على رقاقة السيليكون. تدور رقاقة السيليكون في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 ثوان. ثم تدور في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 30ثانية للحصول على النهائي 60 ميكرون سمك طلاء مقاوم للضوء على رقاقة السيليكون.
- إزالة بعناية رقاقة السيليكون من الدوار ونقله إلى موقد؛ خبز في 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- إزالة الشريط اللاصق بلطف لفضح علامات المحاذاة على الطبقة الأولى. وضع رقاقة السيليكون على موقد والخبز في 95 درجة مئوية لمدة 6 دقائق.
- وضع بعناية رقاقة السيليكون على قناع اليجنر وتعيين وقت التعرض للأشعة فوق البنفسجية لتكون 18 ثانية.
- نعلق بعناية قناع الشفافية للطبقة الثانية على لوحة زجاجية شفافة باستخدام شريط لاصق.
- ضع بعناية لوحة من الزجاج مع قناع المرفقة إلى أليغنر، ومحاذاة القناع والطبقة الأولى على رقاقة السيليكون بواسطة علامات محاذاة العبور باستخدام المجهر التفتيش من أليغنر.
- فضح رقاقة السيليكون المغلفة مقاومة للضوء إلى الأشعة فوق البنفسجية لنمط تحميل الخلية وقنوات التدرج.
- إزالة بعناية لوحة من الزجاج وإخراج السيليكون ثعفر. خبز رقاقة السيليكون على موقد في 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة ومن ثم نقل رقاقة السيليكون إلى 95 درجة مئوية لوحة ساخنة أخرى والخبز لمدة 6 دقائق.
- نقل رقاقة السيليكون إلى غطاء الدخان ووضعه في وعاء زجاجي يحتوي على سو-8 المطور. هز بلطف هذا لمدة 6 دقائق.
- تنظيف رقاقة السيليكون باستخدام الطازجة سو-8 المطور تليها إيبا داخل غطاء الدخان.
- تجفيف رقاقة السيليكون باستخدام غاز النيتروجين داخل غطاء الدخان. وضع رقاقة السيليكون على موقد ويصعب خبز القالب في 150 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الطبقة الثانية جاهزة.
- ماستر العفن تعديل السطح.
ملاحظة: يتم تطبيق خطوة تعديل سطح سيلانيزاتيون إلى سو-8 العفن لتسهيل بوليديميثيلزيلوكسان (بدمس) الافراج عن القالب في لينة الطباعة الحجرية.- خذ 10 ميكرولتر من تريديكافلورو-1،1،2،2-تيترايدروكتيل (ثلاثي كلوروزيلان) الحل في طرف ميكروبيبيت. وضع طرف ميكروبيبيت في أنبوب بلاستيكي 15 مل أند قم بتخفيف الغطاء من الأنبوب.
- وضع أنبوب و سو-8 منقوشة رقاقة السيليكون داخل المجفف وتطبيق الفراغ لمدة 1 ساعة. القناع العفن جاهز لافتعال بدمس الجهاز.
- تفريق الجهاز بدمس.
- إعداد الحل بدمس عن طريق خلط 40 غرام بدمس قاعدة و 4 ز وكيل علاج في كوب من البلاستيك. وضع استعداد سو-8 العفن الرئيسي في طبق بتري وتصب بعناية 44 غرام حل بدمس على القالب.
- وضع طبق بتري في مجفف وتطبيق فراغ إلى ديغاس حل بدمس لمدة 20 دقيقة. ثم ضع طبق بتري في الفرن وعلاج بدمس في 80 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- بعد الخبز، واخراج طبق بتري ووضعه على مقاعد البدلاء نظيفة. قطع بعناية وقشر قبالة بدمس بلاطة من سو-8 العفن.
- لكمة خارج ميناء التحميل الخلية باستخدام 3 مم الناخس القطر. لكمة من الخزانات مدخل الكيميائية ومخرج النفايات باستخدام الناخس قطرها 6 ملم.
- إزالة الغبار علىسطح بدمس بلاطة باستخدام شريط لاصق. وضع بلاطة بدمس وشريحة زجاجية نظيفة في آلة البلازما. تطبيق الفراغ لمدة 3 دقائق.
- تشغيل الطاقة البلازما وتعيين مستوى إلى عالية. ضبط بلطف صمام الهواء و بلازماتريت بدمس بلاطة والشريحة الزجاجية لمدة 3 دقائق.
- إيقاف الطاقة البلازما والافراج عن فراغ. تأخذ بعناية من بدمس بلاطة والشريحة الزجاجية باستخدام ملاقط.
- وضع على الفور بدمس بلاطة (مع هياكل قناة وجه لأسفل) على رأس الشريحة الزجاجية. اضغط بلطف بدمس بلاطة لسندات إلى الزجاج. ملء قناة ميكروفلويديك مع الماء منزوع الأيونات على الفور. اكتمال تصنيع الجهاز ميكروفلويديك والتجمع.
2. ميكروفلويديك خلية الهجرة إعداد الفحص
- إعداد جهاز ميكروفلويديك.
- إعداد 50 ميكروغرام / مل حل فبرونيكتين عن طريق تمييع 50 ميكرولتر من محلول فبرونيكتين الأسهم (1 ملغ / مل) إلى 95081؛ L دولبيكو الفوسفات مخزنة المالحة (دبس) داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
- إعداد وسيلة الهجرة عن طريق خلط 9 مل معهد روزويل بارك التذكاري المتوسطة (رمي-1640) و 1 مل من رمي-1640 مع 4٪ ألبومين المصل البقري (بسا).
- إزالة الماء منزوع الأيونات من الجهاز.
- إضافة 100 ميكرولتر حل فبرونيكتين للجهاز من منفذ. انتظر 3 دقائق للتأكد من أن جميع القنوات مليئة حل فبرونيكتين. وضع جهاز ميكروفلويديك في طبق بتري مغطاة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة حل فبرونيكتين من الجهاز. إضافة 100 المتوسطة الهجرة ميكرولتر من منفذ. انتظر 3 دقائق للتأكد من أن جميع القنوات مليئة المتوسطة الهجرة.
- احتضان الجهاز لمدة 1 ساعة أخرى في درجة حرارة الغرفة. الجهاز هو ثم جاهزة لتجربة الكيميائي.
- إعداد حل تشيمواتراكتانت لتجربة الكيميائي.
- إعداد 100 نم حل فملب في رأوتال 1 مل المتوسطة الهجرة. مزيج 5 ميكرولتر من الأسهم فيتس-ديكستران (10 كيلو دالتون، 1 ملم) مع حل فملب في أنبوب 1.5 مل.
ملاحظة: يستخدم فيتس-ديكستران لقياس التدرج. بدلا من ذلك، استخدم رودامين كمؤشر التدرج. الحل فيملب تشيمواتراكتانت هو ثم جاهزة للتجربة الكيميائي.
- إعداد 100 نم حل فملب في رأوتال 1 مل المتوسطة الهجرة. مزيج 5 ميكرولتر من الأسهم فيتس-ديكستران (10 كيلو دالتون، 1 ملم) مع حل فملب في أنبوب 1.5 مل.
- إعداد عينة البلغم.
ملاحظة: تم اختبار الكيميائي العدلات الناجم عن التدرج من عينة البلغم من مرضى مرض الانسداد الرئوي المزمن باعتبارها تطبيق التشخيص السريري لهذه الطريقة كل على رقاقة.- الحصول على بروتوكول الأخلاق البشرية لجمع عينات البلغم من مرضى الانسداد الرئوي المزمن.
ملاحظة: حصلنا على موافقات لجمع العينات في مستشفى سيفين أوكس العام في وينيبيغ (التي وافقت عليها جامعة مانيتوبا). - الحصول على استمارات موافقة خطية مستنيرة من جميع المواد الدراسية.
- جمع عينات مرض البلغم عفوية المرضى مرض الانسداد الرئوي المزمن. مكان 500 ميكرولتر عينة البلغم في أنبوب 1.5 مل.
- إضافة 500 ميكرولتر 0.1٪ ديثيوثريتول في أنبوب 1.5 مل وخلط بلطف. وضع أنبوب في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
- الطرد المركزي العينة في 753 x ج لمدة 10 دقيقة ثم جمع طاف. الطرد المركزي طاف في 865 x ج لمدة 5 دقائق ثم جمع طاف النهائي. تخزين طاف التي تم جمعها داخل الفريزر -80 درجة مئوية قبل الاستخدام.
- عندما تكون جاهزة لتجربة الكيميائي، ذوبان الجليد الحل البلغم. نقل 900 ميكرولتر المتوسطة الهجرة إلى أنبوب 1.5 مل وتخلط مع 100 ميكرولتر حل البلغم داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية. الحل البلغم هو ثم جاهزة للتجربة الكيميائي.
- الحصول على بروتوكول الأخلاق البشرية لجمع عينات البلغم من مرضى الانسداد الرئوي المزمن.
- جمع عينات الدم.
- الحصول على بروتوكول أخلاقيات الإنسان لجمع عينات الدم من المانحين الأصحاء. الحصول على استمارات موافقة خطية مستنيرة من جميع المتبرعين بالدم.
ملاحظة: تم الحصول على عينات هنا في مستشفى فيكتوريا العام في وينيبيغ (التي وافق عليها مجلس أخلاقيات البحوث المشتركة بين أعضاء هيئة التدريس في جامعة مانيتأوبا). - جمع عينة الدم عن طريق الوريد ووضع العينة في أنبوب المغلفة إدتا. الحفاظ على أنبوب في مجلس الوزراء السلامة الأحيائية قبل التجربة.
- الحصول على بروتوكول أخلاقيات الإنسان لجمع عينات الدم من المانحين الأصحاء. الحصول على استمارات موافقة خطية مستنيرة من جميع المتبرعين بالدم.
3. آل-أون-تشيب كيميائي فحص عملية
- على رقاقة العزلة الخلية ( الشكل 1B ).
- مكان 10 ميكرولتر الدم كله في أنبوب 1.5 مل داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
ملاحظة: تفاصيل جمع عينات الدم في القسم 2.4. - إضافة 2 ميكرولتر الأجسام المضادة كوكتيل (أب) و 2 ميكرولتر الجسيمات المغناطيسية (مب) من العدلة عدة العزلة (انظر الجدول من المواد) في أنبوب 1.5 مل و مزيج بلطف. وهذا سوف تسمية الخلايا في الدم ما عدا العدلات.
- احتضان خليط الدم أب-مب لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: هذا سوف علامة مغناطيسيا الأجسام المضادة المسمى الخلايا في الدم. - إرفاق اثنين من الأقراص المغناطيسية الصغيرة إلى جانبي تحميل خلية صأورت من الجهاز. نضح المتوسطة من جميع موانئ الجهاز.
- ببطء ماصة 2 ميكرولتر الدم أب-مب خليط في الجهاز ميكروفلويديك من ميناء تحميل الخلية.
ملاحظة: المحاصرين المسمى الخلايا مغناطيسيا إلى الجدران الجانبية من ميناء تحميل الخلية في حين أن العدلات سوف تتدفق في الجهاز وتصبح محاصرين في هيكل لرسو السفن الخلية. - انتظر بضع دقائق حتى المحاصرين ما يكفي من العدلات في منطقة لرسو السفن الخلية.
- مكان 10 ميكرولتر الدم كله في أنبوب 1.5 مل داخل مجلس الوزراء السلامة الأحيائية.
- الكيميائي مقايسة ( الشكل 1C ).
- وضع جهاز ميكروفلويديك على درجة الحرارة المرحلة المجهر التي تسيطر عليها في 37 درجة مئوية.
- إضافة 100 ميكرولتر حل تشيمواتراكتانت (فملب أو حل البلغم) و 100 ميكرولتر الهجرة المتوسطة لخزانات مدخل المعينة باستخدام اثنين بيبيتورس. وهذا سيولد التدرج الكيميائي في قناة التدرج عن طريق المستمر الصفحي تدفق القائم على خلط الكيميائية بمساعدة بريسورe موازنة هيكل.
ملاحظة: تفاصيل جمع البلغم من مرضى الانسداد الرئوي المزمن في القسم 2.3.- بالنسبة إلى تجربة التحكم المتوسط، لا تضيف سوى وسيط الترحيل إلى كل من خزانات الإدخال.
- الحصول على صورة مضان من فيتس-ديكستران في قناة التدرج.
- استيراد الصورة إلى برنامج إيماجيج باستخدام الأمر "ملف | فتح".
- قياس التشكيل الجانبي مضان عبر قناة التدرج باستخدام الأمر "تحليل | مؤامرة الملف الشخصي".
- تصدير بيانات القياس إلى جدول بيانات لمزيد من التآمر.
- احتضان الجهاز على درجة الحرارة مرحلة المجهر التي تسيطر عليها أو في التقليدية حاضنة ثقافة الخلية لمدة 15 دقيقة.
- صورة قناة التدرج باستخدام هدف 10X لتسجيل المواقف النهائية الخلايا لتحليل البيانات.
- إذا لزم الأمر، تسجيل الهجرة الخلية في الجهاز عن طريق الفاصل الزمني الفاصل الزمني.
4. خلية الهجرة دتحليل آتا ( الشكل 1C )
- تحليل مقايسة الكيميائي عن طريق حساب مسافة الهجرة الخلية من هيكل لرسو السفن كما هو موضح أدناه. انظر الشكل 1 ج .
- استيراد الصورة إلى نيه إيماجيج البرمجيات (الإصدار 1.45).
- حدد مركز كل خلية انتقلت إلى قناة التدرج.
- قياس إحداثيات الخلايا المحددة لمواقعها النهائية. قياس إحداثيات نقطة على حافة هيكل لرسو السفن كموقف مرجعي الأولي.
- تصدير بيانات الإحداثيات المقاسة إلى برنامج جداول بيانات ( مثل إكسيل). احسب مسافة الترحيل للخلايا كالفرق بين الموضع النهائي للخلية والموقع المرجعي الأولي على طول اتجاه التدرج.
- معايرة المسافة إلى ميكرومتر. حساب متوسط وانحراف مسافة الهجرة من جميع الخلايا كمقياس الكيميائي.
- قارن بين ميغمسافة التموين في وجود التدرج الكيميائي إلى تجربة التحكم المتوسط باستخدام t -test الطالب.
- إذا تم تسجيل الصور الفاصل الزمني للهجرة الخلية، يمكن إجراء المزيد من التحليل للهجرة الخلية و الكيميائي عن طريق تحليل تتبع الخلية 15 .
ملاحظة: المواد المطلوبة لبناء وأداء فحص الكيميائي على رقاقة على النحو المفصل في جدول المواد.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يتم اختيار العدلات سلبا من قطرة من الدم كله مباشرة في الجهاز ميكروفلويديك. تم التحقق من نقاء العدلات معزولة من قبل على رقاقة جيمزا تلطيخ وأظهرت النتائج نموذجية على شكل حلقة ونوى الفص على شكل العدلات ( الشكل 2A ) 25 . وهذا يدل على فعالية العزلة على رقاقة العدلة في نقاء عالية من حجم صغير من الدم الكامل. وعلاوة على ذلك، يمكن للهيكل لرسو السفن محاذاة بشكل فعال الخلايا بجانب قناة التدرج قبل تطبيق الت...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه الورقة، تم وصف بروتوكول مفصل لعزل مباشرة العدلات من الدم الكامل تليها اختبار الكيميائي، وكلها على رقاقة ميكروفلويديك واحدة. هذا الأسلوب يوفر ميزات مفيدة في عملية سهلة، واختيار السلبية من العدلات عالية النقاء، سريع عينة إلى نتيجة اختبار الكيميائي، الكواشف المخفضة واستهلاك العينة، وتحليل البيانات الهجرة الهجرة دقيقة. كما تقدير تقريبي، على الأقل 25٪ من العدلات من مدخلات عينة الدم كاملة دخلت بشكل فعال في هيكل لرسو السفن في الجهاز، وجدنا النقاء العدلات عالية من قبل على رقاقة جيم...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا يوجد تضارب في المصالح للكشف.
شكر وتقدير
ويدعم هذا العمل جزئيا من المنح المقدمة من مجلس العلوم الطبيعية والهندسة البحوث في كندا (نزيرك) والمعاهد الكندية للبحوث الصحية (سيهر). نشكر المعهد السريري للبحوث التطبيقية والتعليم في مستشفى فيكتوريا العام في وينيبيغ ومستشفى سيفين أوكس العام في وينيبيغ لإدارة العينات السريرية من البشر. نشكر الدكتور هاجيت بيريتز-سوروكا لمناقشة مفيدة حول استراتيجيات عملية الفحص. نشكر البروفيسور كارولين رن والدكتور شياو مينغ (كودي) تشن من جامعة واترلو لدعمهم السخي في عملية التصوير.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي>تصنيع الجهاز< / قوي> | |||
| محاذاة القناع | ABM | N / A | |
| Spinner | Solitec | 5000 | |
| Hotplate | VWR | 11301-022 | |
| منظف البلازما | هاريك البلازما | PDC-001 | |
| مجفف الفراغ | فيشر ساينتفيك | 08-594-15A | |
| مقياس رقمي | Ohaus | CS200 | |
| SU-8 2000 أرق | Microchem | SU-8 2000 | |
| SU-8 2025 مقاوم للضوء | Microchem | SU-8 2025 | |
| SU-8 مطور | Microchem | SU-8 مطور | |
| Si رقاقة | Silicon، Inc | LG2065 | |
| كحول الأيزوبروبيل | فيشر Scientific | A416-4 | |
| (tridecafluoro-1،1،2،2-tetrahydrooctyl) trichlorosilane | Gelest | 78560-45-9 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) | Ellsworth المواد اللاصقة | 2065622 | |
| طبق بتري | فيشر FB0875714 | ||
| الشرائح الزجاجية | العلمية فيشر Scientific | 12-544-4 | |
| وسادة القطع | N / A | N / A | الطلب |
| اللكمات | N / A | N / A | حسب الطلب |
| < قوي > الاسم < / قوي > | < قوي > المصدر < / strong > | رقم الكتالوج < / strong > | التعليقات < strong > |
| على الرقاقة عزل الخلايا ومقايسة الانجذاب الكيميائي < / strong> | |||
| RPMI 1640 | فيشر SH3025502 | ||
| DPBS | Fisher Scientific | SH3002802 | |
| ألبومين مصل البقر (BSA) | سيجما ألدريتش | SH3057402 | |
| فيبرونيكتين | VWR | CACB356008 | |
| fMLP | سيجما ألدريتش | F3506-10MG | |
| الأقراص المغناطيسية | أدوات النيلي | 44202-1 | قطر 5 مم ، 1 مم سميكة |
| FITC-Dextran: | سيجما-ألدريتش | FD10S | |
| Rhodamine | Sigma-Aldrich | R4127-5G | |
| محلول وصمة عار Giemsa | Rowley Biochemical Inc. | G-472-1-8OZ | |
| EasySep Direct Human Neutrophil Isolation Kit | STEMCELL Technologies Inc | 19666 | |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Nikon Ti-U مجهر | نيكون | Ti-U | |
| الغرفة البيئية. | InVivo Scientific | N / A | |
| CCD | نيكون | DS-Fi1 |
المراجع
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nat Rev Immunol. 13 (13), 159-175 (2013).
- Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets. Nat Immunol. 6 (12), 1182-1190 (2005).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur. J. Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Laird, D. J., von Andrian, U. H., Wagers, A. J. Stem cell trafficking in tissue development, growth, and disease. Cell. 132 (4), 612-630 (2008).
- Condeelis, J., Segall, J. E. Intravital imaging of cell movement in tumours. Nat Rev Cancer. 3 (12), 921-930 (2003).
- Kruger, P., et al. Neutrophils: between host defence, immune modulation, and tissue injury. PLoS Pathog. 11 (3), e1004651(2015).
- Mócsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. J Exp Med. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Foxman, E. F., Campbell, J. J., Butcher, E. C. Multistep navigation and the combinatorial control of leukocyte chemotaxis. J Cell Biol. 139 (7), 1349-1360 (1997).
- Tazzyman, S., Niaz, H., Murdoch, C. Neutrophil-mediated tumour angiogenesis: subversion of immune responses to promote tumour growth. Semin Cancer Biol. 23 (3), 149-158 (2013).
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115 (3), 453-466 (1962).
- Wu, J., Wu, X., Lin, F. Recent developments in microfluidics-based chemotaxis studies. Lab Chip. 13 (13), 2484-2499 (2013).
- Sackmann, E. K., Fulton, A. L., Beebe, D. J. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature. 507 (7491), 181-189 (2014).
- Kim, S., Kim, H. J., Jeon, N. L. Biological applications of microfluidic gradient devices. Integr Biol. 2 (11-12), 584-603 (2010).
- Irimia, D., et al. Microfluidic system for measuring neutrophil migratory responses to fast switches of chemical gradients. Lab Chip. 6 (2), 191-198 (2006).
- Lin, F., et al. Neutrophil migration in opposing chemoattractant gradients using microfluidic chemotaxis devices. Ann Biomed Eng. 33 (4), 475-482 (2005).
- Ambravaneswaran, V., Wong, I. Y., Aranyosi, A. J., Toner, M., Irimia, D. Directional decisions during neutrophil chemotaxis inside bifurcating channels. Integr Biol. 2 (11-12), 639-647 (2010).
- Jones, C. N., et al. Spontaneous neutrophil migration patterns during sepsis after major burns. PloS One. 9 (12), e114509(2014).
- Butler, K. L., et al. Burn injury reduces neutrophil directional migration speed in microfluidic devices. PloS One. 5 (7), e11921(2010).
- Wu, J., et al. A microfluidic platform for evaluating neutrophil chemotaxis induced by sputum from COPD patients. PloS One. 10 (5), e0126523(2015).
- Sackmann, E. K., et al. Microfluidic kit-on-a-lid: a versatile platform for neutrophil chemotaxis assays. Blood. 120 (14), e45-e53 (2012).
- Agrawal, N., Toner, M., Irimia, D. Neutrophil migration assay from a drop of blood. Lab Chip. 8 (12), 2054-2061 (2008).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic platform for measuring neutrophil chemotaxis from unprocessed human whole blood. J Vis Exp. (88), (2014).
- Jones, C. N., et al. Microfluidic assay for precise measurements of mouse, rat, and human neutrophil chemotaxis in whole-blood droplets. J Leukocyte Biol. 100 (1), 241-247 (2016).
- Sackmann, E. K. -H., et al. Characterizing asthma from a drop of blood using neutrophil chemotaxis. P Natl Acad Sci. 111 (16), 5813-5818 (2014).
- Wu, J., et al. An all-on-chip method for testing neutrophil chemotaxis induced by fMLP and COPD patient's sputum. Technology. 04 (02), 104-109 (2016).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
