مقالة منهجية

عالية الدقة حنق في مستوى جزيء واحد لجزيء الجزيئي تحديد هيكل

DOI:

10.3791/55623

⸱

مايو 13, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, Clemson University, 2Department of Physics and Astronomy, Clemson University, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, Center for Membrane Biology, Graduate School for Biomedical Sciences, University of Texas Health Science Center

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد هنا بروتوكول للتجارب الحنق عالية الدقة على مستوى جزيء واحد. بالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام هذه المنهجية لتحديد ثلاث حالات مطابقة في مجال الربط يجند من مستقبلات N-ميثيل-D-أسبارتاتي (نمدا). تحديد مسافات دقيقة هي الخطوة الأولى نحو بناء النماذج الهيكلية على أساس التجارب فريت.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد هنا بروتوكول عن كيفية إجراء قياسات لمسافات بينية عالية الدقة باستخدام نقل الطاقة بالرنين فورستر (فريت) على مستوى الجزيء الواحد في أسلوب كشف مضان متعدد المسافات (مفد). مفد يزيد من استخدام جميع "أبعاد" مضان للحد من التحف الضوئية والتجريبية ويسمح لقياس المسافة إنتيردي مع دقة تصل إلى ~ 1 Å في الجزيئات الحيوية جامدة. واستخدمت هذه الطريقة لتحديد ثلاث حالات تطابقية في مجال ربط يجند لمستقبل N-ميثيل-D-أسبارتات (نمدا) لشرح تفعيل المستقبل عند ربط يجند. عند مقارنة الهياكل البلورية المعروفة مع القياسات التجريبية، وافقوا في أقل من 3 Å للحصول على جزيئات حيوية أكثر ديناميكية. جمع مجموعة من القيود عن بعد التي تغطي الأبعاد كاملة من الجزيئات الحيوية من شأنه أن يجعل من الممكن لتوفير نموذج هيكلي لل بيومولكول الحيويوفاق.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف الأساسي للدراسات البيولوجيا الهيكلية هو كشف العلاقة بين هيكل ووظيفة الآلات الجزيئية الحيوية. حدث الانطباع البصري الأول من الجزيئات الحيوية (على سبيل المثال، البروتينات والأحماض النووية) في 1950s من خلال تطوير البلورات بالأشعة السينية 1 ، 2 . يوفر البلورات بالأشعة السينية عالية الدقة، معلومات هيكلية ثابتة مقيدة التعبئة الكريستال. ولذلك، فإن الجمود الكامنة للنماذج الهيكلية الأشعة السينية يغير الطبيعة الديناميكية للجزيئات الحيوية، وهو عامل يؤثر على معظم الوظائف البيولوجية 3 ، 4 ، 5 . الرنين المغناطيسي النووي (نمر) 6 ، 7 ، 8 قدمت حلا بديلا للمشكلة من خلال حل النماذج الهيكلية في المحاليل المائية. وهناك ميزة كبيرةمن الرنين المغناطيسي النووي هو قدرته على استعادة الطبيعة الديناميكية الجوهرية للجزيئات الحيوية والفرق التوافقية، مما يساعد على توضيح العلاقات الجوهرية بين الهيكل والديناميات والوظيفة 3 ، 4 ، 5 . ومع ذلك، فإن الرنين المغناطيسي النووي، مقيدا بحجم العينة وكميات كبيرة من العينة، يتطلب استراتيجيات وضع العلامات المعقدة للنظم الأكبر حجما. لذلك، هناك حاجة ملحة لتطوير طرق بديلة في البيولوجيا الهيكلية.

تاريخيا، فورستر نقل الطاقة الرنين (فريت) 9 لم تأخذ دورا هاما في البيولوجيا الهيكلية بسبب سوء فهم أن الحنق يوفر قياسات المسافة منخفضة الدقة. هذا هو الغرض من هذا البروتوكول لإعادة النظر في قدرة الحنق لتحديد المسافات على نطاق نانومتر، بحيث يمكن استخدام هذه المسافات لبناء نماذج هيكلية من الجزيئات الحيوية. أول التحقق التجريبيأتيون من R - 6 الاعتماد على كفاءة فريت تم القيام به من قبل ستراير في عام 1967 10 من خلال قياس بوليبرولينس من أطوال مختلفة باسم "حاكم الطيفي." وقد أجريت تجربة مماثلة على مستوى الجزيء الواحد في عام 2005 11 . تحولت جزيئات بوليبرولين إلى أن تكون غير مثالية، وبالتالي، تم استخدام جزيئات الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل في وقت لاحق 12 . هذا فتح نافذة لقياس المسافة دقيقة وفكرة استخدام الحنق لتحديد الخصائص الهيكلية للجزيئات الحيوية.

الحنق هو الأمثل عندما يكون نطاق المسافة إنتيردي من ~ 0.6-1.3 R 0 ، حيث R 0 هو المسافة فورستر. ل فلوروفوريس نموذجية المستخدمة في التجارب جزيء واحد جزيء، R 0 هو ~ 50 Å. عادة، فريت يقدم العديد من المزايا على طرق أخرى في قدرته على حل والتمييز بين الهياكل والديناميات فيأنظمة غير متجانسة: (1) نظرا للحساسية في نهاية المطاف من مضان، جزيء واحد تجارب فريت 13 ، 14 ، 15 ، 16 يمكن حل الفرق غير متجانسة عن طريق العد مباشرة وفي الوقت نفسه تميز هياكل أفرادها. (2) يمكن فك رموز مسارات التفاعل المعقدة مباشرة في دراسات فريت ذات الجزيء الواحد لأنه لا حاجة إلى تزامن مجموعة. (3) يمكن أن الحنق الوصول إلى مجموعة واسعة من المجالات الزمنية التي تمتد على مدى 10 عقود في الوقت المناسب، تغطي مجموعة واسعة من الديناميات ذات الصلة بيولوجيا. (4) التجارب فريت يمكن أن يؤديها في أي ظروف الحل، في المختبر وكذلك في الجسم الحي . الجمع بين الحنق مع المجهر مضان يسمح لدراسة الهياكل الجزيئية والتفاعلات مباشرة في الخلايا الحية 15 ، 16 ، سوب> 17 ، 18 ، 19 ، حتى مع دقة عالية 20 . (v) الحنق يمكن تطبيقها على أنظمة ما يقرب من أي حجم (على سبيل المثال، بوليغرولين أوليغوميرس 21 ، 22 ، 23 ، 24 ، Hsp90 25 ، فيروس نقص المناعة البشرية النسخ العكسي 26 ، وريبوسوم 27 ). (6) وأخيرا، يمكن استخدام شبكة من المسافات التي تحتوي على كل الأبعاد للجزيئات الحيوية لاستخلاص نماذج هيكلية من جزيئات ثابتة أو ديناميكية 18 ، 28 ، 29 ، 30 ، 31 ، 32 ، 33 ، 34 ،ريف "> 35 ، 36 ، 37 .

لذلك، يمكن استخدام طيفي جزيء واحد جزيء لاستخلاص المسافات التي هي دقيقة بما فيه الكفاية لاستخدامها للنمذجة الهيكلية مقيدة المسافة 26 . هذا ممكن من خلال الاستفادة من كشف مضان متعدد المسافات (مفد) 28 ، 38 ، 39 ، 40 ، 41 ، 42 ، والذي يستخدم ثمانية أبعاد المعلومات مضان ( أي الطيف الإثارة، طيف مضان، متباين الخواص، ومضان عمر، والوقت المجهري، وشدة مضان، والمسافة بين فلوروفوريس) بدقة وبدقة توفير قيود المسافة. بالإضافة إلى ذلك، يتم الجمع بين الإثارة المشذرة نابض (بيي) مع مفد(بيي-مفد) 42 لرصد مضان متقبل الإثارة المباشرة واختيار أحداث جزيء واحد الناشئة عن العينات التي تحتوي على 1: 1 مانولوجي إلى متقبل الكيمياء المتكافئة. يستخدم إعداد بيي-مفد نموذجي ليزر نابض مشع اثنان متصلا بجهاز المجهر متحد البؤر، حيث يتم تقسيم الكشف الفوتون إلى أربع قنوات مختلفة في مختلف النوافذ الطيفية وخصائص الاستقطاب. مزيد من التفاصيل يمكن العثور عليها في الشكل 1 .

من المهم أن نلاحظ أن الحنق يجب أن تكون جنبا إلى جنب مع الأساليب الحسابية لتحقيق النماذج الهيكلية مثل ذري التي تتفق مع النتائج الحنق 26 ، 30 . ليس الهدف من هذا البروتوكول للذهاب أكثر من المنهجية المرتبطة لبناء نماذج هيكلية مع المسافات المشتقة من الحنق. ومع ذلك، تم تطبيق هذه النهج جنبا إلى جنب مع تقنيات أخرى (على سبيل المثال، زاوية صغيرة مبعثر الأشعة السينيةإنغ أو إلكترون باراماجنيتيك الرنين)، ولادة مجال البيولوجيا الهيكلية التكاملي 43 ، 44 ، 45 ، 46 . الهدف الحالي هو تمهيد الطريق ل الحنق كأداة كمية في علم الأحياء الهيكلي. على سبيل المثال، تم استخدام هذه المنهجية لتحديد ثلاث حالات مطابقة في مجال الربط يجند (لبد) لمستقبل N-ميثيل-D-أسبارتات (نمدا). والهدف النهائي هو التغلب على القيود المذكورة أعلاه وتقديم فريت بين أساليب التكامل المستخدمة لتحديد الهيكلية من الجزيئات الحيوية من خلال توفير مسافات قياسها مع دقة عالية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. برنامج تلفزيوني العازلة إعداد وغرفة العلاج

ملاحظة: ارتداء معطف المختبر والقفازات التي يمكن التخلص منها عند إجراء التجارب الكيميائية الرطبة. استخدام حماية العين عند محاذاة الليزر.

  1. إعداد العازلة برنامج تلفزيوني
    1. حل 4.5 غرام من نا 2 هبو 4 ، 0.44 غرام من ناه 2 بو 4 ، و 3.5 غرام من كلوريد الصوديوم في 400 مل من الماء المقطر. ضمان الرقم الهيدروجيني 7.5 وتعقيم الحل عن طريق التعقيم على دورة السائل لمدة 1 ساعة (اعتمادا على نظام الأوتوكلاف).
    2. خذ 15 مل من الحل بس ومزجها مع 0.1 غرام من الفحم. تصفية مزيج باستخدام العادية 20 مل مرشح حقنة مع حجم المسام 0.2 ميكرون . ختم وتخزين المخزن المؤقت بس في درجة حرارة الغرفة.
  2. المجهر غرفة غطاء الزجاج العلاج
    1. إضافة 500 ميكرولتر من الماء المقطر و 5 ميكرولتر من بوليسوربات 20 السطحي غير الأيوني (انظر قائمة المواد)إلى نظام الزجاج غطاء غرفة (انظر قائمة المواد) وتخلط جيدا. السماح نقع لمدة 30 دقيقة. إزالة حل بوليسوربات 20 وغسل الغرفة بالماء المقطر مرتين. اتركها تنشف.
      ملاحظة: الغرفة جاهزة الآن للاستخدام.

2. إعداد الحمض النووي عينة

ملاحظة: استخدام مصممة الحمض النووي المسمى خيوط (انظر قائمة المواد) لإنشاء الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (دسدنا) العينات القياسية. يجب أن لا يكون الأصباغ مصممة لديها الأصباغ في نهاية البوليمر من أجل تجنب القطع الأثرية التي يمكن أن تضر المسافة المحددة. وينبغي اختيار تسلسل الحمض النووي ليكون بمثابة هيئة جامدة.

  1. إضافة 1.5 ميكرولتر من المتبرع المسمى حبلا الحمض النووي و 4.5 ميكرولتر من الحمض النووي دنا (المقبولة المسمى أو غير المسمى) مجانا في أنبوب ميكروفوج ومزجها مع 24 ميكرولتر من نوكليس خالية من المياه.
    ملاحظة: اعتمادا على مزيج من أوليغونوكلأوتيدس المحدد، سيتم إنشاء العينات التالية: لا الحنق، لوW- الحنق، أو دسدناس الحنق عالية.
  2. تهجين الحمض النووي باستخدام خلاط الحرارية والعملية التالية: 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة و 90 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة و 80 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة و 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة و 60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة و 50 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 40 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 30 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، 10 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، وعقد في 5 درجات مئوية.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ بالمعايير دسدنا ولدت في الفريزر -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل أو يمكن استخدامها على الفور.

3. إعداد عينة البروتين

ملاحظة: بدءا من الحمض النووي المؤتلف للتعبير عن البروتين من الاهتمام في النظم البكتيرية، فمن الممكن أن تتحول البقايا التي المسافات التي سيتم قياسها في سيستينس. للقيام بذلك، استخدم تقنيات تغيير الطفرات الموجهة الموقع القياسية 47 . لتسهيل تنقية البروتين، واستنساخ الحمض النووي المؤتلف ومتحولة في ناقلات تحتوي على علامة تنقية (على سبيل المثال،علامة له). تم استخدام وحدة الربط الغلوتاماتية 1 نطاق ربط يجند (لبد) من مستقبلات مضادات الغلوتامات نمدا غلوتامات (GluN1) لبد ( أي نمدا GluN1 لبد المستنسخة في ناقلات بيت-22b (+)).

  1. بروتين، إكسبريسيون
    1. تحويل البلازميد دنا بناء في نظام التعبير المفضل 48 .
      ملاحظة: سوف تفترض الخطوات التالية أن التعبير عن بروتين قابل للذوبان يتحول في القولونية الإشريكية . التنقية من، على سبيل المثال، خلايا الثدييات ترانسفكتد 49 أو خلايا الحشرات ترانسدوسد 50 ، هو ممكن أيضا، ويمكن الاطلاع على خطوات مفصلة في مكان آخر. تأكد من أن سلالة E. القولونية اختيار مناسب للبروتين من الفائدة. على سبيل المثال، فإن التعبير عن البروتينات التي تحتوي على جسور ثاني كبريتيد يتطلب سلالة من الخلايا المختصة مع حجرة أقل داخل الخلايا الحد (انظر قائمة المواد).
    2. تطعيم كاتب <م> E. كولي باستخدام طرف ماصة معقمة لالتقاط مستعمرة واحدة تحولت 48 . إسقاطه إلى 100 مل من المتوسطة لب انتقائية (انظر قائمة المواد) والسماح للثقافة لتنمو بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
    3. إعداد مرق لب (انظر قائمة المواد). الأوتوكلاف لتعقيم.
    4. تطعيم الثقافات على نطاق واسع من E. القولونية المحولة عن طريق إضافة ثقافة بين عشية وضحاها إلى 2 لتر من المتوسطة لب انتقائية بنسبة 1: 500.
    5. على مدى الساعات القليلة القادمة، تقييم نمو الثقافة من خلال مراقبة قراءات الامتصاصية (عبس) من الثقافة في 600 نانومتر، يشار إليها أحيانا باسم كثافة بصرية في 600 نانومتر (أود 600 )، أو باستخدام متر كثافة الخلية. لاحظ أن القراءات تزيد مع مرور الوقت.
    6. استخراج البروتين التعبير مع تركيز النهائي من 0.5 ملي إيزوبروبيل-β-د-1-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (إيبت) عندما تصل الثقافة أود 600 من 0.7. هزة يسببها القولونية في 20 درجة مئوية لمدة 20-24 ح.
    7. بعد تحريض البروتين، بيليه E. القولونية عن طريق الغزل لمدة 20 دقيقة في 3000 x ج و 4 درجة مئوية. تجاهل طاف وتخزين E. بيليه القولونية التي تحتوي على البروتين داخل الخلايا في -80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. تنقية البروتين
    1. ليس E. القولونية باستخدام طريقة تحلل الاختيار (على سبيل المثال، صوتنة، الصحافة الفرنسية، والتجويف النيتروجين، وما إلى ذلك ) 51 .
    2. تدور أسفل الغشاء والحطام الخلية بواسطة الطرد المركزي المحللة لمدة 1 ساعة في 185،000 x ج و 4 درجة مئوية.
    3. لبروتين له الموسومة، وتحميل طاف على موازنة، النيكل المشحونة، يجمد اللوني المعادن تقارب (إيماك) العمود باستخدام نظام كروماتوغرافيا السائل البروتين سريع (فبلك) نظام (انظر جدول المواد ) 52 .
      ملاحظة: العازلة موازنة ل نمدا GluN1 لبد: 200 ملي كلوريد الصوديوم، 20 ملي تريس، و 1 ملي جليكاين، ودرجة الحموضة 8. شطف عازلة ل نمدا GluN1 لبد: 200 ملي كلوريد الصوديوم، 20 ملي تريس، 1 ملي جليكاين، و 400 ملي إميدازول، ودرجة الحموضة 8.
      1. غسل العمود إماك مع العازلة التي تحتوي على كمية منخفضة (~ 12 ملم) من إيميدازول.
      2. أزل البروتين من العمود إماك باستخدام التدرج الخطي من إيميدازول من 12 ملم إلى 400 ملم.
    4. دياليز البروتين بين عشية وضحاها في العازلة موازنة دون إيميدازول 53 عن طريق وضع شطافة من الخطوة 3.2.3.2 في أنابيب غسيل الكلى وغمره في العازلة موازنة تحت التحريك المستمر لمدة 2-3 ساعة. كرر مرة أخرى على الأقل.
      ملاحظة: الخطوات 3.2.3-3.2.6 تفترض تنقية بروتين له الموسومة. إذا تنقية من خلال بعض طريقة أخرى، وضبط البروتوكول وفقا لذلك.
    5. تحديد كمية البروتين عن طريق أخذ الامتصاصية في 280 نانومتر من البروتين دياليزيد وباستخدام قانون البيرة ( وحدة الامتصاص = ε L ج ، حيث ε هو معامل الانقراض (M -1 سم -1)، والتي يمكن الحصول عليها هنا 54 ؛ l هو طول مسار الضوء (سم)؛ و ج هو تركيز البروتين (M)).
      ملاحظة: المقايسات الكمي البروتين المختلفة المتاحة، بما في ذلك فحص برادفورد وفحص حمض بيسينونينيك. كلاهما يوفر نتائج دقيقة.
  3. بروتين، وضع العلامات
    1. إضافة المانح (ماليميد رد الفعل سماوي الأخضر الصبغة) والمتقبل (مالميد رد الفعل الحمراء الحمراء صبغ) فلوروفوريس إلى البروتين المنقى في 1: 1: 8 البروتين: المانحة: نسبة المولي المقبولة.
    2. احتضان البروتين وفلورفور خليط على الجليد لمدة 30 دقيقة. أوقات حضانة أطول ممكنة.
    3. حزمة 0.5 مل ني نيتريلوترياسيتيك حمض (ني-نتا) عمود الاغاروز (انظر قائمة المواد) وتوازن ذلك باستخدام نفس العازلة موازنة كما هو الحال في الخطوة 3.2.3 في حين أن البروتين هو احتضان.
      ملاحظة: الحفاظ على كمية البروتين المحملة وفقا لقدرة الراتنج ملزمة.
    4. بعد 30 دقيقة فيكوبياتيون، تحميل البروتين / فلوروفور خليط على العمود أعدت في الخطوة 3.3.3 وتنقية عن طريق تدفق الجاذبية.
    5. يغسل فلورفور الزائدة مع 5 مل من العازلة موازنة.
    6. أزل البروتين المسمى من قبل الجاذبية من العمود أربع مرات مع 0.5 مل من العازلة شطف. لأن البروتين قد تم بالفعل تنقيته من البروتينات الأخرى، لا التدرج ضروري.
    7. تحقق من كل خيط مع مطياف الأشعة فوق البنفسجية فيس لتحديد أي جزء يحتوي على البروتين المسمى. مسح الامتصاصية من 230-700 نانومتر لتكون قادرة على التأكد من أن قمم الامتصاصية من البروتين (280 نانومتر) وكل فلورفور (493 نانومتر ل فلورفور السماوي الأخضر و 651 نانومتر لل فلورفور الحمراء البعيدة) مرئية في شطافة.
      ملاحظة: عادة، فإن البروتين أزل في جزء 2.
    8. موازنة عمود تحلية (انظر جدول المواد ) مع برنامج تلفزيوني المعالجة بالفحم (الخطوة 1.1).
    9. تحميل البروتين المسمى على عمود تحلية عن طريق تدفق الجاذبية.
      ملاحظة: الحفاظ على كمية البروتين المحملة وفقا للقدرة عمود التحلية المحدد 55 .
    10. أزل باستخدام 3.5 مل من بس المعالجة بالفحم عن طريق تدفق الجاذبية وجمع 0.5 مل الكسور من شطافة.
    11. استخدام مطياف الأشعة فوق البنفسجية فيس لمسح الامتصاصية من كل خيط من 230-700 نانومتر لتحديد أي جزء يحتوي على البروتين المسمى.
      ملاحظة: الخطوات 3.3.8-3.3.11 أساسا بمثابة خطوة تبادل المخزن المؤقت. البروتوكولات الأخرى التي تخدم هذا الغرض ممكنة أيضا (على سبيل المثال، غسيل الكلى واسعة النطاق). بدلا من ذلك، يمكن للمرء أن يذهب مباشرة إلى الخطوة 3.3.8 من الخطوة 3.3.2.

4. القياسات المطلوبة في ظروف الفرقة (في كوفيت)

  1. تحديد ثابت فورستر
    1. المسح الضوئي F D ، فلورفور الانبعاثات مضان (كبس)، في مقياس فلوري عن طريق إثارة المانحة في 15 نانومتر إلى أقصى طول موجتها الامتصاصية من أجل الحصول على إم الكاملالطيف إسيون. مراقبة الانبعاثات بدءا 5 نانومتر بعد الطول الموجي الإثارة وتنتهي 150 نانومتر في وقت لاحق. استخدام ظروف زاوية سحرية من خلال تعيين المستقطب الانبعاثات إلى 54.7 درجة واستقطاب الإثارة إلى 0 ° 56 .
      ملاحظة: بالنسبة فلورفور المانحة المستخدمة هنا، يحدث الحد الأقصى عبس في 490 نانومتر. يستخدم 475 نانومتر كما الطول الموجي الإثارة، ويتم رصد الانبعاثات من 480-650 نانومتر. بالنسبة للمستقبل، يحدث الحد الأقصى ل عبس عند 645 نانومتر؛ يستخدم 630 نانومتر للطول الموجي الإثارة، ويتم رصد الانبعاثات من 635-735 نانومتر.
    2. استخدام مقياس الفلور لإجراء فحص الإثارة من فلورفور متقبل (عبس A ) تتراوح بين 400-700 نانومتر واستخدام ظروف زاوية السحر عن طريق وضع المستقطب الانبعاثات إلى 54.7 درجة واستقطاب الإثارة إلى 0 ° 56 . تعيين مونوكروماتور الانبعاثات إلى 15 نانومتر بعد الطول الموجي أقصى الانبعاثات. تطبيع إلى أقصى إكسيقيمة تاتيون.
    3. في الجداول المنشورة، حدد معامل الانقراض للمقبل، ε A (M -1 سم -1 ) 56 ، أو استخدم القيم المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
      ملاحظة: القيمة المنشورة للفلوروفور المستقبلة المستخدمة في هذه المخطوطة هي ε A647 = 270،000 سم -1 M -1 56 .
    4. احسب التراكب الطيفي باستعمال J = Σf D · (عبس A · ε A ) · λ 4 ، حيث f d و عبس A و ε A تم تعريفها أعلاه λ وهو طول الموجة (نم). استخدام ورقة عمل لإدراج في الأعمدة جميع القيم التي تعتمد على الطول الموجي التي تم الحصول عليها في الخطوات 4.1.1-4.1.3. محاذاة وفقا لطول الموجة. قم بإجراء التجميع من الطول الموجي الأدنى لانبعاث المتبرع (λ مين ) إلى الطول الموجي الأقصى للمستقبل الامتصاصيe (λ ماكس ).
    5. احسب ثابت فورستر (R o ) باستخدام الصيغة التالية R o 6 = 8.79 x 10 -5 · J · κ 2 · Φ F، D · n -4 ، حيث J هو التداخل الطيفي المحسوب سابقا في الخطوة 4.1.4، κ 2 هو عامل التوجيه، Φ F، D هو العائد الكمومي مضان من فلورفور المانحة، و n هو معامل الانكسار للوسط الذي يقع فلورفور.
      ملاحظة: استخدم n = 1.33 (إذا تم استخدام العازلة المائية) و κ 2 = 2/3.
    6. تحديد قيمة العائد الكم من فلورفور المانحة (Φ F، D ، (انظر المرجع 57) واستعمال قيمة التراكب الطيفي الذي تم الحصول عليه في الخطوة 4.1.4 لحساب القيمة النهائية لاستمرار فورستر باستخدام المقياسمن الخطوة 4.1.5.
      ملاحظة: إذا كان العائد الكمي غير متوفر، اتبع الخطوة 4.2، أدناه، لحساب ذلك. وفي هذه الحالة، استخدم Φ F، D = 0،8، الذي يقابل عمر مانح τ D، r = 4،4 نس.
  2. تحديد العائد الكم مضان
    ملاحظة: الإجراء التالي يفترض التبريد الديناميكي فقط. للنظر في التبريد ثابت، الرجوع إلى المرجع 56. ومع ذلك، تجارب بيي-مفد هي أيضا مفيدة في تحديد العائد الكم، حتى في حالة التبريد ثابت (انظر النتائج).
    1. حدد فلورفور مرجع مع ملامح الامتصاصية والانبعاثات مماثلة لكل من المتقبل والفلوروفوريس المانحة التي تم تحديد العائد الكم (Φ ص ).
      مالحظة: بالنسبة للمتبرع، Φ r = 0،8 و τ r = 4 نس، أما بالنسبة للمقبل، Φ r = 0،32 و τ r = 1،17 نس، ثهيش تتطابق مع Φ r و τ r للفلوروفور السماوي الأخضر و أوليغونوكلأوتيدس ذات الفلوروفور الحمراء، على التوالي 57 ، على التوالي.
    2. قياس تسوس مضان حل الوقت (و (ر)) باستخدام طريقة مرتبط الوقت الفوتون العد (تسك) طريقة في ظروف زاوية السحرية.
    3. تناسب تسوس مضان مع وظيفة الاضمحلال أحادية أو متعددة الأسي في شكل و (t) = Σ ط س ط / τ i ، حيث x ط هو الجزء السكاني و τ i هو عمر مضان السكان.
    4. احسب متوسط ​​عمر الأنواع، <τ> x = Σx i τ i ، حيث x ط هو الجزء السكاني و τ i هو عمر مضان السكان.
    5. استخدام الe Φ F، D = <τ D > x * Φ r / τ r لحساب العائد الكمومي مضان من فلورفور المانحة عن طريق توصيل في عمر مضان والحاصل الكم من المرجع، فضلا عن عمر مضان من فلورفور المانحة.
      ملاحظة: تفترض هذه الطريقة التبريد الديناميكي. للحصول على غيرها من Φ F، D القرارات، اتبع لاكويتز 56 .

5. محاذاة التجربة ل بيي-مفد كشف جزيء واحد (سمد)

ملاحظة: فمن الأفضل لإيقاف الأنوار عند أخذ القياسات.

  1. تعديل المعدات (الشكل 1)
    ملاحظة: يتم استخدام الإعداد مفد بناء المنزل المبينة في الشكل 1 ، مع اثنين من الليزر نابض و 4 قنوات الكشف في الجسم المجهر مقلوب، لهذه التجربة. وهناك أنظمة تجارية مماثلة.
    1. تشغيل الليزر 485 نانومتر و 640 نانومتر وجميع أجهزة الكشف عن الإعداد مفد. افتح البرنامج الذي يتحكم في استحواذ وتسك تكسبك. تأكد من أن معدل تكرار الليزر هو 40 ميغاهرتز.
    2. تعيين قوة الليزر نابض 485 نانومتر إلى 60 μW على مستوى صورة من الهدف 60X 1.2 نا الغمر بالماء والطاقة نبض 640 نانومتر إلى 23 ميكرو واط في وضع الإثارة نابض معشق (بيي-مفد) 42 .
      ملاحظة: لتعيين بيي-مفد، يتم تأخير نبضات الليزر اثنين في برنامج تحكم الليزر. ل 485 نانومتر ليزر الإثارة، وقنوات كشف تسك (قنوات تاك) هي 1-12،499 (قناة "موجه"). ل 640 نانومتر الليزر الإثارة، وقنوات كشف تسك (قنوات تاك) هي 12،499-50،000 ("تأخير" قناة).
    3. إضافة الهدف الغمر السائل (قطرة من الماء المقطر المزدوج) بين عدسة الهدف المجهر وشريحة الزجاج غطاء. للتأكد من أن الطائرة صورة داخل الحل وبعيدا عن سورفا الزجاجسي، وتحويل مقبض التكيف واحد ونصف يتحول بعد العثور على النقطة البؤرية المشرقة الثانية بسبب انعكاس الليزر في واجهة الزجاج السائل.
    4. إضافة 1 ميكرولتر من 100 نانومتر رودامين 110 إلى 50 ميكرولتر من الماء المقطر إلى مركز الزجاج الغطاء. تأكد من أن الحل هو أيضا في مركز الهدف المجهر.
    5. ضبط الثقب (حجم: 70 ميكرون) المواقف (x و y اتجاه واحد في وقت واحد) في حين رصد معدل العد الفوتون على برامج الاستحواذ لتحقيق أقصى قدر من عدد الفوتونات الكشف عنها.
  2. القياس القياسي سمد (العمل في غرفة مظلمة)
    1. استخدم العينة من الخطوة 5.1.4 وسجل 120 ثانية من معدل العد عن طريق النقر على زر "ابدأ" في لوحة التحكم الزمنية التي تم حلها زمنيا (تر) في شكل "* .ht3" 58 على برنامج الاستحواذ.
    2. حساب حاليا التحليل الطيفي ارتباط مضان (فس) 59 ، </ سوب> 60 ، 61 ( أي قياس فس) لتحديد الوقت المميز للانتشار، وعدد الجزيئات في حجم مبائر، حركية الدولة الثلاثي، والسطوع الجزيئي 62 .
      1. فتح البرنامج ل فس (كريستين، جناح مفد). حدد الإعدادات التجريبية بالنقر على "خيارات" -> "تحديد إعداد". حدد ملفا مع إعدادات تجريبية مشابهة ثم انقر فوق "الحصول على معلمات من ملف" لقراءة معلومات رأس الملف.
      2. حدد "تشغيل" -> "ربط" لأداء فس.
        ملاحظة: تأكد من أن أرقام القناة محددة بشكل صحيح وأن "بوابة تاك" (قنوات تسك) يتم تحديدها وفقا لذلك قنوات المطالبة أو تأخير.
      3. حدد "تشغيل" -> "صالح العالمية من منحنيات الارتباط" لفتح روتين مناسبا. استخدام "المعادلة # 24" على البرنامجe وانقر على "بدء".
        ملاحظة: تصف المعادلة رقم 24 على البرنامج وظيفة الارتباط الذاتي ( G ج ) من جزيئات الفلورسنت المنتشرة بحرية على صورة الإضاءة الغوسية ثلاثية الأبعاد، مثل 61 :
        figure-protocol-1
        حيث N هو متوسط ​​عدد الجزيئات في حجم الكشف، x T هو جزء الجزيئات التي تمارس حركية ثلاثية الحالة مع الوقت المميز t t ، t c ، هو زمن الارتباط، t ديف هو وقت الانتشار المرتبط بالهندسية المعلمة ω ، و ω تصف المظهر الجانبي للإضاءة الغوسية. بعد مناسبا، نحيط علما الوقت نشر وعدد من الجزيئات في حجم مبائر.
    3. إضافة 10 ميكرولتر من 100 نانومتر رودامين 101 إلى 50 ميكرولتر من المقطرالمياه وتخلط جيدا. وضع هذا المزيج على رأس الزجاج الغطاء والتأكد من أن القطيرة هي في محور العدسة الهدف. انقر على الزر "بدء" في لوحة تحكم تر لتسجيل 120 ثانية من البيانات بتنسيق تر.
    4. إضافة 1 ميكرولتر من 100 نانومتر فلوروفور الأحمر الأقصى إلى 50 ميكرولتر من الماء المقطر وتخلط جيدا. وضع هذا المزيج في وسط العدسة الهدف. انقر على زر "ابدأ" وسجل 120 ثانية من البيانات بتنسيق تر.
    5. وضع 50 ميكرولتر من الماء المقطر في مركز العدسة الهدف. انقر على زر "ابدأ" وسجل 300 ثانية من البيانات بتنسيق تر.
    6. وضع 50 ميكرولتر من العازلة بس في وسط عدسة موضوعية. انقر على زر "ابدأ" وسجل 300 ثانية من البيانات بتنسيق تر.
    7. خذ 1 ميكرولتر من مزيج من الخطوة 5.1.4 وتخلط مع 50 ميكرولتر من الماء المقطر. ضع هذا المزيج على غطاء الزجاج. أولا، انقر فوق الزر "ابدأ" وجمع 10 ثانية من البيانات في وضع تر. ثم تحليل تتر وضع ملف باستخدام انفجار تحليل مضان مدى الحياة (بيفل) برنامج التحليل (باريس، مجموعة مفد)، كما هو موضح في الخطوة 5.3.
      ملاحظة: تحقق من عدد الرشقات في الثانية من برنامج اختيار وتحليل الرشقات 26 ، 61 . إذا كان مستوى الرشقة حوالي 35 كل 10 ثوان، فمن المناسب لقياس الجزيء الواحد.
    8. مواصلة تسجيل معدل العد في تنسيق تر لمدة 1.5 ساعة ( أي تسسك في سمد) لعلاج كمعيار قياس جزيء واحد.
      ملاحظة: نظرا لحجم الملف الكبير، تقسيم الخام "* .ht3" الملفات إلى ملفات أصغر حجما لتحميل ومعالجة باستخدام بيفل.
  3. تحليل العينات القياسية باستخدام بيفل
    1. افتح برنامج بيفل (باريس).
    2. حدد الإعداد ل بيي في إطار "المنبثقة" التلقائي المنبثقة وقراءة رأس عن طريق تحديد الملف مع إعدادات تجريبية مماثلة. انقر على "الحصول على المعلمات جيئة وذهاباm ". انقر فوق" موافق ". لاحظ أن النافذة المنبثقة تغلق وتدمج في الواجهة الأمامية باريس.انقر فوق" موافق "تحت" التالي ".
    3. اختيار الملفات لتحليل بالنقر على "تحديد" على "مسار مسار البيانات" لتحديد قياس لتحليل.
      1. انقر على "مبعثر الأخضر" (لقياس المياه)، "غرين بغ" (لقياس العازلة)، "سميكة الخضراء" (لقياس 2 نانومتر رودامين 110)، "الانتثار الأحمر" (لقياس المياه)، " ريد بغ "(لقياس العازلة أو المياه)،" سميكة حمراء "(لقياس 20 نانومتر رودامين 101)،" الانتثار الأصفر "(لقياس المياه)،" بغ الأصفر "(لقياس العازلة)، و "الأصفر السميك" (لقياس 2 فلانوفور الحمراء بعيدة المدى).
      2. انقر على "موافق" ضمن "التالي".
        ملاحظة: قناة "الخضراء" يتوافق مع إشارة من أجهزة الكشف الخضراء في قنوات "موجه" تسسك. ال4؛ ريد "تتطابق مع إشارة أجهزة الكشف الحمراء في قنوات" تسكب "" السريعة "، وتقابل القناة" الصفراء "إشارة الكاشفات الحمراء في قنوات تأخير تسك.
    4. انقر فوق "ضبط" بجوار "قطع البيانات بورستويز" لضبط معلمات اختيار جزيء واحد. في النافذة المنبثقة الجديدة، حدد أحداث جزيء واحد مع اثنين من الانحرافات المعيارية عن متوسط ​​وقت وصول إنتيرفوتون ("دت") عن طريق تغيير وقت وصول إنتيرفوتون تحت "عتبة" والحد الأدنى لعدد الفوتونات في حدث جزيء واحد تحت عنوان "دقيقة . " انقر على "رجوع" لإغلاق النافذة المنبثقة. انقر على "موافق" ضمن "التالي".
      ملاحظة: تعتمد العتبة في وحدات مس على معدل عد الخلفية. الحد الأدنى النموذجي لعدد الفوتونات المستخدمة هو 60.
    5. ضبط العمر مضان الأولي "المعلمات تناسب اللون" (على سبيل المثال ، من، إلى، والتلاعب) لتوليدد المعلمات مضان تسوس على "الأخضر"، "الأحمر"، و "الأصفر" الألوان. في النافذة نفسها، اضبط قيم "من" و "إلى" ل "مطالبة" و "تأخير". انقر على "رجوع" لإغلاق النافذة المنبثقة. انقر على "موافق" ضمن "التالي".
      ملاحظة: تأكد من تحديد مربع الاختيار الإثارة 2-اللون. "من" و "إلى" تتوافق مع صناديق الأولي والنهاية على الرسم البياني الاضمحلال مضان (تاك رقم القناة). إذا تم اختيار المعلمات المناسبة الأولية بشكل صحيح، يتم إضافة وظيفة تناسب إلى تسوس مضان على كل قناة.
    6. حدد الموقع على القرص الصلب الذي لحفظ كافة الملفات أسي معالجتها في مجلد الأصل.
      ملاحظة: تقوم باريس بمعالجة جميع الرشقات المحددة وتخلق ملفات إخراج أسي متعددة مما يمكن استخدامه من قبل برامج أخرى للتصور (على سبيل المثال، مجموعة مارغريتا مفد).

6. دسدنا المعايير وعينة ميسurements

  1. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة بس إلى الزجاج غطاء غرفة ووضع قطرة من الماء المقطر بين الغرفة وعدسة موضوعية. انقر على زر "ابدأ" على دواسة التحكم وجمع 5 دقائق من البيانات في وضع تر لاستخدامها في التحليل.
  2. تأخذ كمية صغيرة (عادة حوالي 0.1 ميكرولتر، وتركيز حوالي 1 ميكرومتر) من معيار دسدنا، إضافته إلى المخزن المؤقت بس، وتخلط جيدا. أولا، جمع 10 ثانية من البيانات عن طريق النقر على "ابدأ". ثم تحقق من الرشقة للحصول على 35 رشقة لكل 10 ثوان (كما هو الحال في الخطوتين 5.2.7 و 5.3). وأخيرا، جمع> 2 ساعة من البيانات في شكل تر، كما هو موضح أعلاه.
  3. تحليل البيانات التي تم جمعها لعينات دسدنا، كما هو الحال في الخطوة 5.3.3.
  4. تصور الرسم البياني المتدفق باستخدام مجموعة مفد (مارغريتا) وعرض الكفاءة فريت مقابل <τ D (A) > f أو F D / F A مقابل <τ D (A) > f .
    1. فتح tانه برنامج مارغريتا وحدد "ملف" -> "استيراد جميع *. ؟؟ 4 و * ملفات .mti." حدد المجلد الرئيسي الذي يحتوي على مجلدات فرعية مختلفة.
    2. حدد المعلمات لتصور عن طريق النقر بجوار "X" (أبسيسا) أحد المعلمات المستمدة من باريس (على سبيل المثال، تاو الأخضر أو ​​<τ D (A) > و )؛ وبالمثل، كرر هذا لتنسيق "Y" لتحديد المعلمة المطلوب لتصور (على سبيل المثال، كفاءة الحنق، F D / F A ، أو S بيي بيي).
      ملاحظة: في هذه الحالة، كفاءة الحنق، F D / F A ، أو S بيي الصحيح لمعدل العد الخلفية المناسبة في القنوات الخضراء والأحمر والأصفر. بالنسبة للعوائد الكمومية للمتبرع والمقبل؛ لنسبة كفاءة الكشف (g g / g R )؛ و الحديث المتبادل (α). هنا، g g / g R = 3.7 و α = 0.017، اعتمادا فقط على الصك. معدلات عدد الخلفيةتعتمد على المخزن المؤقت المستخدم، ويتم تحديد قيم العائد الكمي مسبقا.
    3. إضافة خط الحنق عن طريق فتح نافذة "تراكب المعادلة" عن طريق النقر على "عرض" -> "تراكب المعادلة". حدد خط فريت ثابت من القائمة المنبثقة. حدد العمر المناسب المانحين ومعلمات العائد الكم لتوليد خط الحنق الصحيح.
      ملاحظة: يمكن إنشاء خطوط فريت لربط مؤشرات فريت المختلفة.
  5. تحديد عامل التصحيح لإثارة المستقبلة من مصدر الإثارة المانحة (β) باستخدام المعلمة الكيمياء المتكافئة من خلال عرض الكفاءة الحنق مقابل الكيمياء المتكافئة (S بيي) في مارغريتا (المعادلة 1، أدناه).
    ملاحظة: يتم اختيار such بحيث يكون لدى عينة المانحة ذروة في S بيي = 1.0 في مقياس الكيمياء المتكافئة؛ يجب أن يكون للعينة المتقبل فقط قياسا متكافئا ل S بيي = 0.0، وينبغي أن يكون ل دسدنا مع كل من التسميات قياسا متكافئا ل S بيي 0.5. <بر /> ملاحظة: الصك جاهز الآن، وأنه من الممكن لقياس العينات الحنق المسمى.
  6. قياس وتحليل العينات فريت المسمى في القسم 3 باتباع الخطوات 6.3-6.4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في تجارب سمفريت نموذجية باستخدام إعداد مفد (خطوط ليزر: 485 نانومتر في 60 μW و 640 نانومتر في 23 μW، القسم 5.1)، يتم تخفيف عينة مضان إلى تركيز منخفض بيكومولار (10 -12 M = 1 بم) وضعت في المجهر متحد البؤر، حيث نبض الليزر نانو ثانية الثانية تثير جزيئات المسمى بحرية نشرها من خلال حجم الإثارة. حجم مبائر نموذجي هو <4 فيمتوليترز (فل). في مثل هذه التركيزات المنخفضة، يتم الكشف عن جزيئات واحدة فقط في وقت واحد. يتم جمع مضان المنبعثة من الجزيئات ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا العمل، يتم تقديم بروتوكول لمحاذاة ومعايرة وقياس المسافات إنتيردي مع دقة عالية باستخدام بيي-مفد جزيئات جزيء واحد التجارب. من خلال معايرة بعناية جميع المعلمات مفيدة، يمكن للمرء أن يزيد من دقة المسافات المقاسة والوصول إلى دقة أنجستروم. ولتحقيق ذلك، تستخدم مختلف الرسوم البيانية متعددة الأبعاد لتحليل وتحديد السكان لمزيد من التوصيف. باستخدام متوسط ​​الوقت الكلي للتحقق من استقرار العينات المقاسة، فمن الممكن لتصحيح ل فوبوبلاشينغ المانحة والمقبولة واختيار السكان الحنق على أساس معلمة...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن جميع المؤلفين أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة مع محتويات هذه المادة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فج و هس تقر الدعم من المعاهد الوطنية للصحة R01 GM094246 إلى فج. ويقر هس بأموال البدء من برنامج كليمان للتحقيق الإبداعي التابع لجامعة كليمسون ومركز علوم المواد البصرية والتكنولوجيا الهندسية في جامعة كليمسون. كما تم دعم هذا المشروع من خلال زمالة التدريب من مركز كيك للتدريب متعدد التخصصات العلوم البيولوجية لاتحاد ساحل الخليج (نيغمس منحة رقم 1 T32GM089657-05) وزمالة مؤسسة شيسلر للدراسات الانتقالية من الأمراض البشرية المشتركة ل د. المحتوى هو فقط من مسؤولية المؤلفين ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الفحمMerck KGaAK42964486 320
فلتر حقنةFisherbrand09-719Cالحجم: 0.20 & م
غطاء زجاجي ذو غرفةفيشر ساينتفيك1554091.5 زجاج بورسليكات ، 8 آبار
غطاء مجهر زجاجفيشر ساينتفيك063014-9الحجم: 24 × 60-1.5
ماء خال من النوكليزفيشر ساينتفيك148859خال
من نوكلياز توين -20Thermo Scientific28320محلول 10٪ من Polysorbate 20
متقبل حبلا DNA ( تقنيات الحمضالنووي المتكاملة1781248955 & حاد ؛ -د (CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG AT (Cy5) C GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
حبلا الحمض النووي المتقبل (FRET منخفضتقنيات الحمض النووي المتكاملة1779564245 & حاد ؛ -د (CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TT (Cy5) A AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
حبلا الحمض النووي المانحمتكامل تقنيات الحمض النووي1779514375 & حاد ؛ -د (GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GATC TGT TT (Alexa488) A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)
حبلا الحمض النووي (بدون FRET)تقنياتالمتكاملة 5 &ACUTE ؛ -D (CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)
التدوير الحراريEppendorfE6331000025التدرج
الترابطأليكسا فلور 488 C5 & nbsp ؛ MaleimideThermo ScientificA10254يسمى الفلوروفور الأخضر السماوي في المخطوطة
Alexa Fluor 647 C2 & nbsp ؛ MaleimideThermo ScientificA20347يسمى الفلوروفور الأحمر البعيد في المخطوطة
Rhodamine 110Sigma-Aldrich83695-250MG
Rhodamine 101Sigma-Aldrich83694-500MG
LB Broth ، MillerFisher ScientificBP1426لاستزراع E. coli< / em>
AmpicillinSigma-AldrichA0166تستخدم في 100 & ميكرو; جم / مل التركيز النهائي في وسط LB الانتقائي للحفاظ على اختيار البلازميد
Tetracyline   ؛كالبيوكيم58346مستخدم في 12.5 & ميكرو ؛ جم / مل التركيز النهائي في وسط LB الانتقائي للحفاظ على طفرة gor (اختزال فلوتاثيون) في سلالات اوريغامي B (DE3) لتسهيل أكسدة رابطة ثاني كبريتيد
KanamycinFisher ScientificBP906-5المستخدمة في 15 & جم / مل التركيز النهائي في وسط LB الانتقائي للحفاظ على طفرة trxB (اختزال الريوريدوكسين) في بقع B (DE3) لتسهيل أكسدة رابطة ثاني كبريتيد
اوريغامي B (DE3) الخلايا المختصةMillipore70837-3خلايا E. القولونية< / em> للتعبير عن البروتين مع جسور ثاني كبريتيد
الأيزوبروبيل-&بيتا;-D-ثيوغالاكتوبيرانوسيد (IPTG)فيشر العلميBP1755لتحريض الإشريكية القولونية < / em> تعبير البروتين
HiTrap مخلب HPGE Life Sciences17-0409-01لتنقية FPLC على نطاق واسع لبروتين الموسوم
به ImidazoleSigma-Aldrich56749
Ni-NTA Agarose   ؛Qiagen30210
PD-10 عمود تحليةالمياه GE علوم الحياة17-0851-01
AktaPurifierGE LifeSciences 28406264FPLC أداة
غسيل الكلىمختبرات الطيف132562 15 كيلو دالتون MWCO 24 مم عرض مسطح ، 10 أمتار / لفة
DichroicsSemrockFF500 / 646-Di01-25x36500/646 BrightLight
50/50 مستقطب شعاع الخائنQioptiq Linos G33 5743 00010 × 10 فيلم مستقطب
التمرير الأخضر ملفChromaET525 / 50mET525 / 50m قطر 25 مم
مرشح ممر أحمرChromaET720 / 150mET720 / 150m 25 مم قطر جبل
عداد الطاقةThorLabdPM200
UV-Vis مقياس الطيفVarianCary300Bio
Fluorolog 3 مقياس الفلورHoribaFL3-22-R3
Fluorohub TCSPC تحكمHoribaFluorohub-BTCSPC للقياسات الجماعية
NanoLed 485LHoriba485Lليزر الصمام الثنائي الأزرق
NanoLed 635LHoriba635Lليزر الصمام الثنائي الأحمر
أوليمبوس IX73 مجهرأوليمبوسIX73P2Fإطار المجهر
PMA 40 كاشف هجينPicoQuant GmbH932200 ، PMA 40محسن للكشف الأخضر
PMA 50 Hybrid DetectorPicoQuant GmbH932201 ، PMA 50محسن لحساسية ناقل الحركة
485 نانومترليزر PicoQuant GmbHLDH-D-C-485
640 نانومتر ليزرPicoQuant GmbHLDH-D-C-640
Hydraharp 400 وبرنامج تجميع TTTRPicoQuant930021مؤقت حدث Picosecond ووحدة Coutning أحادية الفوتون المرتبطة بالوقت ، تتضمن برنامج تجميع TTTR
SEPIA II SLM 828 وبرنامج SEPIAبرنامج PicoQuant910028Laser لنبضات بيكو ثانية ، بما في ذلك وحدة التحكم في برنامج SEPIA.
الكمبيوترDelloptiplex 7010وحدة المعالجة المركزية: i7-3770 ذاكرة الوصول العشوائي: 16GB
FRET تحديد المواقع والفحص (FPS) البرمجياتهاينريش هاين Unviersityوتشمل Accesibel Volume clacualtor متوفر في مجموعة MFD
http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html Heinrich Heine Unviersityويشمل حزمة برامج BIFL باريس. Margarita لتصور التكرارات متعددة المعلمات ، وبرنامج تحليل توزيع الاحتمالات availabel في http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html
) الحمض النووي أنابيب الضوئي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kendrew, J. C. Architecture of a protein molecule. Nature. 182 (4638), 764-767 (1958).
  2. Kendrew, J. C., et al. A three-dimensional model of the myoglobin molecule obtained by x-ray analysis. Nature. 181 (4610), 662-666 (1958).
  3. Henzler-Wildman, K., Kern, D. Dynamic personalities of proteins. Nature. 450 (7172), 964-972 (2007).
  4. Henzler-Wildman, K. A., et al. A hierarchy of timescales in protein dynamics is linked to enzyme catalysis. Nature. 450 (7171), 913-927 (2007).
  5. Henzler-Wildman, K. A., et al. Intrinsic motions along an enzymatic reaction trajectory. Nature. 450 (7171), 838(2007).
  6. Kline, A. D., Wuthrich, K. Secondary structure of the alpha-amylase polypeptide inhibitor tendamistat from Streptomyces tendae determined in solution by 1H nuclear magnetic resonance. J. Mol. Biol. 183 (3), 503-507 (1985).
  7. Williamson, M. P., Havel, T. F., Wuthrich, K. Solution conformation of proteinase inhibitor IIA from bull seminal plasma by 1H nuclear magnetic resonance and distance geometry. J. Mol. Biol. 182 (2), 295-315 (1985).
  8. Havel, T. F., Wuthrich, K. An evaluation of the combined use of nuclear magnetic resonance and distance geometry for the determination of protein conformations in solution. J. Mol. Biol. 182 (2), 281-294 (1985).
  9. Förster, T. Zwischenmolekulare Energiewanderung und Fluoreszenz. Ann.Phys. 437 (1), 55-75 (1948).
  10. Stryer, L., Haugland, R. P. Energy transfer: a spectroscopic ruler. Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).
  11. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  12. Wozniak, A. K., Schroder, G. F., Grubmuller, H., Seidel, C. A., Oesterhelt, F. Single-molecule FRET measures bends and kinks in DNA. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (47), 18337-18342 (2008).
  13. Orrit, M., Bernard, J. Single Pentacene Molecules Detected by Fluorescence Excitation in a p-Terphenyl Crystal. Phys. Rev. Lett. 65 (21), 2716-2719 (1990).
  14. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  15. Ha, T., et al. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proc.Natl.Acad.Sci.USA. 93, 6264-6268 (1996).
  16. Michalet, X., Weiss, S., Jager, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chem. Rev. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  17. Jares-Erijman, E. A., Jovin, T. M. FRET imaging. Nat. Biotechnol. 21 (11), 1387-1395 (2003).
  18. Sakon, J. J., Weninger, K. R. Detecting the conformation of individual proteins in live cells. Nat Methods. 7 (3), 203-205 (2010).
  19. Stahl, Y., et al. Moderation of Arabidopsis root stemness by CLAVATA1 and ARABIDOPSIS CRINKLY4 receptor kinase complexes. Curr. Biol. 23 (5), 362-371 (2013).
  20. Fessl, T., et al. Towards characterization of DNA structure under physiological conditions in vivo at the single-molecule level using single-pair FRET. Nucleic Acids Res. 40 (16), e121(2012).
  21. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annu. Rev. Biochem. 47, 819-846 (1978).
  22. Schuler, B., Lipman, E. A., Steinbach, P. J., Kumke, M., Eaton, W. A. Polyproline and the "spectroscopic ruler" revisited with single-molecule fluorescence. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 102 (8), 2754-2759 (2005).
  23. Best, R. B., et al. Effect of flexibility and cis residues in single-molecule FRET studies of polyproline. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (48), 18964-18969 (2007).
  24. Hoefling, M., et al. Structural heterogeneity and quantitative FRET efficiency distributions of polyprolines through a hybrid atomistic simulation and Monte Carlo approach. PLoS One. 6 (5), e19791(2011).
  25. Hellenkamp, B., Wortmann, P., Kandzia, F., Zacharias, M., Hugel, T. Multidomain structure and correlated dynamics determined by self-consistent FRET networks. Nat Methods. , (2016).
  26. Kalinin, S., et al. A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling. Nat. Meth. 9 (12), 1218-1225 (2012).
  27. Hickerson, R., Majumdar, Z. K., Baucom, A., Clegg, R. M., Noller, H. F. Measurement of internal movements within the 30 S ribosomal subunit using Forster resonance energy transfer. J. Mol. Biol. 354 (2), 459-472 (2005).
  28. Margittai, M., et al. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (26), 15516-15521 (2003).
  29. Weninger, K., Bowen, M. E., Chu, S., Brunger, A. T. Single-molecule studies of SNARE complex assembly reveal parallel and antiparallel configurations. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (25), 14800-14805 (2003).
  30. Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET. J. Struct. Biol. 173 (3), 497-505 (2011).
  31. Choi, U. B., et al. Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex. Nat. Struct. Mol. Biol. 17 (3), 318-324 (2010).
  32. DeRocco, V., Anderson, T., Piehler, J., Erie, D. A., Weninger, K. Four-color single-molecule fluorescence with noncovalent dye labeling to monitor dynamic multimolecular complexes. BioTechniques. 49 (5), 807-816 (2010).
  33. McCann, J. J., Zheng, L., Chiantia, S., Bowen, M. E. Domain orientation in the N-Terminal PDZ tandem from PSD-95 is maintained in the full-length protein. Structure. 19 (6), 810-820 (2011).
  34. McCann, J. J., et al. Supertertiary structure of the synaptic MAGuK scaffold proteins is conserved. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (39), 15775-15780 (2012).
  35. Andrecka, J., et al. Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase II elongation complex. Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).
  36. Muschielok, A., et al. A nano-positioning system for macromolecular structural analysis. Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).
  37. Muschielok, A., Michaelis, J. Application of the Nano-Positioning System to the Analysis of Fluorescence Resonance Energy Transfer Networks. J. Phys. Chem. B. 115 (41), 11927-11937 (2011).
  38. Renner, A., et al. High Precision FRET Reveals Dynamic Structures in the Drosophila Scaffold Protein Complex Stardust-DPATJ-DLin-7 Mediated by L27 Domains. Biophys. J. 106 (2), 256(2014).
  39. Antonik, M., Felekyan, S., Gaiduk, A., Seidel, C. A. Separating structural heterogeneities from stochastic variations in fluorescence resonance energy transfer distributions via photon distribution analysis. The Journal of Physical Chemistry B. 110 (13), 6970-6978 (2006).
  40. Gaiduk, A., Kühnemuth, R., Antonik, M., Seidel, C. A. Optical Characteristics of Atomic Force Microscopy Tips for Single-Molecule Fluorescence Applications. ChemPhysChem. 6 (5), 976-983 (2005).
  41. Eggeling, C., Fries, J., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  42. Kudryavtsev, V., et al. Combining MFD and PIE for Accurate Single-Pair Förster Resonance Energy Transfer Measurements. ChemPhysChem. 13 (4), 1060-1078 (2012).
  43. Steven, A. C., Baumeister, W. The future is hybrid. J. Struct. Biol. 163 (3), 186-195 (2008).
  44. Cowieson, N. P., Kobe, B., Martin, J. L. United we stand: combining structural methods. Curr. Opin. Struct. Biol. 18 (5), 617-622 (2008).
  45. Boura, E., et al. Solution structure of the ESCRT-I complex by small-angle X-ray scattering, EPR, and FRET spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA. 108 (23), 9437-9442 (2011).
  46. Dominguez, C., Boelens, R., Bonvin, A. M. HADDOCK: a protein-protein docking approach based on biochemical or biophysical information. J. Am. Chem. Soc. 125 (7), 1731-1737 (2003).
  47. Laible, M., Boonrod, K. Homemade site directed mutagenesis of whole plasmids. J Vis Exp. (27), (2009).
  48. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).
  49. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram. J Vis Exp. (117), e54792(2016).
  50. Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies. J Vis Exp. (85), e51206(2014).
  51. Protein Sample Preparation, Handbook. GE Healthcare. , Available from: http://www.gelifesciences.com/file_source/GELS/Service%20and%20Support/Documents%20and%20Downloads/Handbooks/Protein_sample_preparation_handbook.pdf (2016).
  52. Li, Q., Richard, C. -A., Moudjou, M., Vidic, J. Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli. J Vis Exp. (106), e53432(2015).
  53. Scopes, R. K. Protein Purification: Principles and Practice. , Springer. New York. (1993).
  54. Protein Extiction Coefficient Calculator. , Available from: http://www.biomol.net/en/tools/proteinextinction.htm (2016).
  55. Desalting Column Product booklet. GE. , Available from: https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_20161110134421.pdf (2016).
  56. Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy. , Springer. (2007).
  57. Sindbert, S., et al. Accurate distance determination of nucleic acids via Forster resonance energy transfer: implications of dye linker length and rigidity. J. Am. Chem. Soc. 133 (8), 2463-2480 (2011).
  58. Wahl, M. Technical Note. Time Tagged Time-Resolved Fluorescence Data Collection in Life Sciences. PicoQuant. , Available from: https://www.picoquant.com/images/uploads/page/files/14528/technote_tttr.pdf (2010).
  59. Elson, E. L., Magde, D. Fluorescence correlation spectroscopy. I. Conceptual basis and theory. Biopolymers. 13 (1), 1-27 (1974).
  60. Magde, D., Elson, E. L., Webb, W. W. Fluorescence correlation spectroscopy. II. An experimental realization. Biopolymers. 13 (1), 29-61 (1974).
  61. Felekyan, S., et al. Full correlation from picoseconds to seconds by time-resolved and time-correlated single photon detection. Rev. Sci. Instrum. 76 (8), 083104(2005).
  62. Iyer, V., Rossow, M. J., Waxham, M. N. Peak two-photon molecular brightness of fluorophores is a robust measure of quantum efficiency and photostability. JOSA B. 23 (7), 1420-1433 (2006).
  63. Böhmer, M., Wahl, M., Rahn, H. -J., Erdmann, R., Enderlein, J. Time-resolved fluorescence correlation spectroscopy. Chem. Phys. Lett. 353 (5), 439-445 (2002).
  64. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. The Journal of Physical Chemistry A. 102 (33), 6601-6613 (1998).
  65. Kühnemuth, R., Seidel, C. A. M. Principles of Single Molecule Multiparameter Fluorescence Spectroscopy. Single Mol. 2 (4), 251-254 (2001).
  66. Widengren, J., et al. Single-molecule detection and identification of multiple species by multiparameter fluorescence detection. Anal. Chem. 78 (6), 2039-2050 (2006).
  67. Sisamakis, E., Valeri, A., Kalinin, S., Rothwell, P. J., Seidel, C. A. Accurate single-molecule FRET studies using multiparameter fluorescence detection. Methods Enzymol. 475, 455-514 (2010).
  68. Kalinin, S., Felekyan, S., Antonik, M., Seidel, C. A. Probability distribution analysis of single-molecule fluorescence anisotropy and resonance energy transfer. The Journal of Physical Chemistry B. 111 (34), 10253-10262 (2007).
  69. Kask, P., et al. Two-dimensional fluorescence intensity distribution analysis: theory and applications. Biophys. J. 78 (4), 1703-1713 (2000).
  70. Traynelis, S. F., et al. Glutamate Receptor Ion Channels: Structure, Regulation, and Function. Pharmacol. Rev. 62 (3), 405-496 (2010).
  71. Furukawa, H., Gouaux, E. Mechanisms of activation, inhibition and specificity: crystal structures of the NMDA receptor NR1 ligand-binding core. EMBO J. 22 (12), 2873-2885 (2003).
  72. Furukawa, H., Singh, S. K., Mancusso, R., Gouaux, E. Subunit arrangement and function in NMDA receptors. Nature. 438 (7065), 185-192 (2005).
  73. Dolino, D. M., Rezaei Adariani,, Shaikh, S., A, S., Jayaraman, V., Sanabria, H. Conformational Selection and Submillisecond Dynamics of the Ligand-binding Domain of the N-Methyl-d-aspartate Receptor. J. Biol. Chem. 291 (31), 16175-16185 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

NMDA

مقالات ذات صلة