مقالة منهجية

مضان المجهر المعيشة أو الثابتة والملون على أساس ورقة الخفيفة خنفساء الدقيق الحمراء الأجنة

DOI:

10.3791/55629

⸱

أبريل 28, 2017

 ,  , 
1Physical Biology, Buchmann Institute for Molecular Life Sciences (BMLS), 2Cluster of Excellence Frankfurt, Macromolecular Complexes, 3Goethe-Universität Frankfurt am Main – Campus Riedberg

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح تصوير التشكل للأجنة الحشرات مع ضوء على أساس ورقة مضان المجهر الدولة من الفن. ويحدد هذا البروتوكول ويقارن ثلاث تقنيات التركيب المناسبة للأجنة خنفساء الدقيق الحمراء، ويدخل اثنين من رواية خطوط المعدلة وراثيا حسب الطلب مناسبة تماما لتصوير العيش، ويناقش ضوابط الجودة الأساسية ويشير إلى القيود التجريبية الحالية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أصبح الدقيق الحمراء خنفساء خنفساء الدقيق الحمراء هام كائن نموذج حشرة في علم الوراثة التنموية والبيولوجيا التطورية التطوري. مراقبة الأجنة خنفساء مع خفيفة على أساس ورقة مضان المجهر لها مزايا متعددة على widefield التقليدية ومتحد البؤر المجهري مضان. نظرا لخصائص فريدة من نوعها المجهر القائم على ورقة خفيفة، وثلاث صور ثلاثية الأبعاد من العينات الحية يمكن تسجيلها مع نسب عالية إشارة إلى الضجيج وانخفاض كبير في الصورة تبيض وكذلك صور سمية على طول عدة اتجاهات على مدى فترات تدوم عدة أيام. مع أكثر من أربع سنوات من التطوير المنهجي وزيادة مستمرة من البيانات، والوقت يبدو مناسبا لوضع إجراءات التشغيل القياسية لاستخدام التكنولوجيا ورقة الخفيفة في المجتمع خنفساء وكذلك في المجتمع الحشرات بشكل عام. يصف هذا البروتوكول ثلاث تقنيات التركيب مناسبة وأو لأغراض مختلفة، تقدم خطين خنفساء المعدلة وراثيا جديدة مصنوعة خصيصا مناسبا للتصوير الحية على المدى الطويل، وتشير خمسة الأصباغ الفلورية لتسمية هياكل داخل الخلايا من الأجنة ثابتة وتوفر معلومات عن ما بعد معالجة البيانات للتقييم في الوقت المناسب من البيانات المسجلة. تركز ممثل النتائج على التصوير الحي على المدى الطويل، باجتزاء البصرية ومراقبة من نفس الجنين على طول عدة اتجاهات. يتم توفير قواعد البيانات منها كمورد للتحميل. وأخيرا، يناقش بروتوكول مراقبة الجودة لفحوصات التصوير الحية، والقيود الحالية وتطبيق الإجراءات المحددة لأنواع الحشرات الأخرى.

ويهدف هذا البروتوكول في المقام الأول لعلماء البيولوجيا التطورية الذين يسعون حلول التصوير التي يتفوق المعدات المختبرية القياسية. وهي تشجع محاولة مستمرة لإغلاق الفجوة بين المختبرات / المجتمعات الموجه من الناحية الفنية، والذي تطوير وصقل مايكرويننسخ منهجيا، ومختبرات علوم الحياة / المجتمعات، والتي تتطلب حلولا "التوصيل والتشغيل" للتحديات التقنية. وعلاوة على ذلك، فإنه يدعم هذا النهج البديهي أن يتحرك الأسئلة البيولوجية في مركز الاهتمام.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الطحين خنفساء خنفساء الدقيق الحمراء الأحمر، الذي ينتمي إلى عائلة كبيرة من الخنافس darkling (Tenebrionidae)، لديها تاريخ طويل في مجال العلوم الزراعية والحياة وهو ثاني أفضل درس كائن نموذج نموذج حشرة بعد ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة. خلال العقود الأربعة الماضية، أصبحت قوية وشعبية نموذج حشرة كائن في علم الوراثة التنموية في البيولوجيا التطورية التطوري، وخلال السنوات العشرين الماضية، في التشكل الجنيني لمجموعة متنوعة من الأسباب:

ذبابة الفاكهة وخنفساء على حد سواء تنتمي إلى كاملات الانسلاخ، ولكن تباينت ما يقرب من 300 مليون سنة مضت 1، 2، 3، 4. في حين أن التطور الجنيني ذبابة الفاكهة يعتبر عادة على النحو المستمد للغاية، خنفساء يظهر الوضع القابل للأجداد جمعةopment التي وجدت في نسبة كبيرة من أنواع الحشرات 5، 6، 7، 8، 9. أولا، خنفساء يسلك تنمية رأس غير ملتف، أي فمها وهوائيات تظهر بالفعل خلال مرحلة التطور الجنيني 10، 11، 12، 13، 14، 15. ثانيا، خنفساء يتبع مبادئ التنمية قصيرة من الجراثيم، أي تضاف شرائح البطن بالتتابع من منطقة النمو الخلفي خلال germband استطالة 16 و 17 و 18 و 19. ثالثا، خنفساء تطور ويحط في وقت لاحقاثنين من الأغشية الجنينية، أي خارج السلى، والذي يغطي الجنين فقط البطني، والمصلية، الذي يغلف الجنين تماما 20 و 21 و 22. كل من الأغشية تلعب مخلق حاسما 23 وكذلك دور وقائي ضد الكائنات الدقيقة 24 و 25 و 26 جفاف. رابعا، والساقين embryonically النامية تعمل بكامل طاقتها خلال مرحلة الحياة اليرقات وبمثابة براعم للأرجل الكبار خلال التحول العذراء 27، 28، 29، 30، 31.

نظرا لحجم ومطالبهم متواضعة صغيرة، وزراعة خنفساء في المختبر هي اضحة إلى حد ما. ثقافات البرية من نوع (WT) سلالات أو خطوط المعدلة وراثيا تتكون عادة من حوالي 100-300 البالغين ويمكن أن تظل داخل زجاجات سعة لتر واحد من الزجاج (البصمة 80 سم 2) شغل 3-4 سم عالية (حوالي 50 غ) مع متوسط النمو التي تتكون من القمح والحبوب الكاملة الطحين تستكمل مع الخميرة الجافة الخاملة. A إمدادات المياه ليست ضرورية. وهذا يسمح حتى معامل صغيرة للحفاظ على العشرات من الثقافات خنفساء داخل حاضنات الحشرات الصغيرة أو متوسطة الحجم متوفرة تجاريا. يتم فصل مراحل تطور لاحقة من خنفساء (اليرقات بعد حوالي رابع الطور، الشرانق والكبار) بسهولة من وسط النمو عن طريق النخل. ويتم الحصول على أجنة متزامنة التي يحتضنها البالغين لفترات قصيرة على وسط وضع البيض. لتحقيق تنمية سريعة، يتم الاحتفاظ الثقافات خنفساء في 32 ° C (حوالي أربعة أسابيع في الجيل)، في حين يتم تنفيذ حفظ الأوراق المالية عادة في 22-25 درجة مئوية (حوالي عشرة أسابيع في جيل).

خلال العقد الماضي، العديد من تك القياسيةوقد تم تكييف hniques تدريجيا والأمثل للخنفساء، على النحو الموجز في كتب الناشئة نموذج الكائنات 32. من أهمية كبيرة ومتقدمة أساليب وراثية مثل الجنينية 33، اليرقات 34، 35 أو الوالدين 36 و 37 RNA القائم على التدخل إسقاط الموروثة، والتحول سلالة الجرثومية سواء مع piggyBac 38، 39 أو نظام ترانسبوزاز مينوس 40 و كريسبر / الجينوم أساس Cas9- الهندسة 41. وعلاوة على ذلك، تم التسلسل الجينوم خنفساء قبل نحو عقد من الزمن 42، والآن في الجولة الثالثة من الجينوم الافراج عن التجمع 43، والذي يسمح تحديد كفاءة والجينوم على نطاق والتحليل المنهجي للجينات 44 أو عناصر وراثية أخرى 45 و 46. بالإضافة إلى ذلك، تتوفر للنهج الوراثية النسبية 47، 48، 49، 50 جينومات أربعة أنواع coleopteran أخرى. بالتعاون مع تسلسل الجينوم، تم إجراء تحليلين الوراثية على نطاق واسع، أي شاشة الطفرات إقحامي 51 و جين ضربة قاضية شاشة أساس التدخل RNA منهجي 52 و 53.

مضان التصوير الحي مع widefield، متحد البؤر أو ضوء المجهر القائم على ورقة (LSFM) يسمح لمراقبة التشكل الجنيني للخنفساء بوصفها وظيفة من الزمن (أي التشكل) في سياق متعدد الأبعاد (الجدول 1). في widefield ومضان المجهري متحد البؤر، وكسكيتويسترشد أوجه وانبعاث الضوء من خلال العدسة نفسها موضوعية. في كلا النهجين، يضيء العينة كامل لكل طائرة ثنائية الأبعاد المسجلة. وبالتالي، يتم إخضاع العينات إلى مستويات طاقة عالية جدا. في LSFM، إلا أن fluorophores في المستوى البؤري متحمسون بسبب فصل الإضاءة والكشف باستخدام اثنين من العدسات موضوعية مرتبة عموديا (الشكل 1). LSFM يأتي في اثنين من تطبيقات شريعي - في طائرة واحدة إضاءة المجهر (SPIM) والرقمية الممسوحة ضوئيا ضوء الليزر على أساس ورقة مضان المجهر (DSLM، الشكل 2) - وتقدم العديد من المزايا الهامة على الأساليب التقليدية: (ط) الجوهرية القدرة باجتزاء البصرية، (ب) قرار محوري جيد، (ج) انخفاض بقوة مستوى الصورة تبيض، (د) منخفضة جدا صور سمية، (ت) ارتفاع نسبة الإشارة إلى الضوضاء، (السادس) عالية نسبيا سرعة الاستحواذ، (السابع) التصوير على طول عدة اتجاهات و (السادسب) اختراق الأنسجة أعمق بسبب استخدام منخفضة العددية فتحة إضاءة العدسات الهدف 54 و 55 و 56.

وقد تم بالفعل تطبيق LSFM بنجاح في خنفساء لتوثيق ما يقرب من التشكل الجنيني كامل 57 وتحليل مبادئ تمزق الغشاء خارج الجنينية في بداية إغلاق الظهرية 23. لزيادة جاذبية LSFM في المجتمع خنفساء وللعلوم الحشرات بشكل عام، فإنه من الأهمية بمكان وضع إجراءات التشغيل القياسية وتحسين الطرق والبروتوكولات ومجموعة الموارد إلى المستوى الذي يصبح المجهر وسهولة -استخدام أداة قياسية في مختبرات البيولوجيا التنموية، والأسئلة البيولوجية البقاء في مركز الاهتمام.

يبدأ هذا البروتوكول مع أساسيات خنفساء </ م> زراعة، أي صيانة، والاستنساخ وجمع الأجنة. بعد ذلك، موضحة استراتيجيتين التجريبية: (ط) التصوير المباشر لخطوط المعدلة وراثيا حسب الطلب و (ب) تصوير الأجنة الثابتة التي كانت ملطخة الأصباغ الفلورية (الجدول 2). وفي وقت لاحق، وشرح ثلاث تقنيات المتصاعدة مع أغراض مختلفة قليلا في التفاصيل (الشكل 3 والجدول 3): (ط) عمود الاغاروز، (ب) نصف الكرة الاغاروز و (ج) صاحب بيت العنكبوت رواية. بروتوكول ثم يشرح الإجراء الحصول على البيانات مع LSFM. وترد طرائق التصوير والاعتبارات الرئيسية. وأخيرا، أوضح استرجاع الجنين ويتم تقديم اقتراحات لمعالجة البيانات الأساسية. في نتائج تمثيلية، بيانات التصوير على الهواء مباشرة من اثنين من الرواية وترد 58 خطوط المعدلة وراثيا الدبقية الأزرق ويتم توفير قواعد البيانات التصوير منها كمورد للتحميل حسب الطلب. بالإضافة إلى ذلك، صورةوتعرض البيانات للأجنة الثابتة التي كانت ملطخة مع مجموعة متنوعة من الأصباغ مضان. وتركز النقاش على مراقبة الجودة، والقيود الحالية للنهج التصوير الحي والتكيف البروتوكول إلى الأنواع الأخرى.

هو مكتوب على بروتوكول لالمجاهر مضان القائم على ورقة الخفيفة التي تكون مجهزة مع غرفة العينة وآلية المشبك للتدوير لحاملي موحد عينة 54، 59، 60، والتي عادة ما تكون العناصر على شكل اسطوانة مصنوعة من المعدن والبلاستيك أو الزجاج مع قطر في نطاق ملليمتر. البروتوكول هو أيضا مناسبة لكلا تطبيقات شريعي، أي SPIM وDSLM، فضلا عن الاجهزة مع اثنين أو أكثر إضاءة والكشف عن الأسلحة 61 و 62 و 63. نتائج تمثيلية تظهر البيانات في قناتين الطيفية، الأخضر (ايلlumination مع ليزر 488 نانومتر، والكشف من خلال 525/50 ممر الموجة فلتر) والأحمر (الإضاءة مع ليزر 561 نانومتر، والكشف من خلال 607/70 ممر الموجة مرشح)، ولكن بروتوكول يمكن توسيعها إلى ثلاث أو أربع قنوات الطيفية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تربية الثقافات خنفساء

ملاحظة: يتم تحديد الشروط القياسية باعتباره درجة حرارة الحضانة من 25 درجة مئوية، والرطوبة النسبية 70٪ في 12 ساعة مشرق / 12 ساعة دورة الظلام. لمزيد من المعلومات حول خنفساء تربية، تتوفر 64 المبادئ التوجيهية ذات الصلة. يتطلب هذا البروتوكول اثنين من وسائل الإعلام على الطحين المختلفة، والتي يمكن أن تكون مستعدة بكميات كيلوغرام وتخزينها لعدة أشهر.

  1. قبل العمل مع الطحين والخميرة الجافة الخاملة، تخزين حزم فتحها عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة 24 ساعة ومن ثم السماح لهم الاحماء لدرجة حرارة الغرفة. هذا الإجراء يزيل مسببات الأمراض المحتملة.
  2. يمر الكامل والدقيق القمح والحبوب والخميرة الجافة غير نشطة من خلال غربال مع 710 ميكرون حجم فتحات الشباك، ثم إعداد المتوسطة النمو من خلال استكمال الطحين والحبوب الكاملة منخول مع 5٪ (ث / ث) منخول الخميرة الجافة الخاملة.
  3. تمرير 405 دقيق القمح الناعم والخميرة الجافة غير نشطة من خلال غربال مع 250 & #181؛ م حجم فتحات الشباك، ثم إعداد المتوسطة وضع البيض من قبل المكمل لمنخول 405 دقيق القمح مع غرامة 5٪ (ث / ث) منخول الخميرة الجافة الخاملة.
  4. تمرير ثقافة خنفساء كل منها من خلال غربال مع 800 حجم ميكرون شبكة. تجاهل متوسط ​​النمو بقايا. نقل اليرقات، والشرانق والكبار على طبق زجاجي كبير.
  5. في حالة وجود أية ثقافة ذرية، ونقل حوالي 80 اليرقات و / أو الشرانق إلى زجاجة جديدة لتأسيس ثقافة جديدة ذرية. إذا لم يكن هناك اليرقات و / أو الشرانق موجودة، وتأخذ حوالي 40 البالغين بدلا من ذلك. إضافة 50 غرام من متوسط ​​النمو واحتضان تحت الظروف القياسية.
  6. جمع حوالي 300 البالغين (500-700 ملغ) في زجاجة جديدة أخرى لتأسيس ثقافة التصوير. إضافة 50 غرام من متوسط ​​النمو واحتضان تحت الظروف القياسية. السماح للثقافة التصوير ليستقر لمدة 24 ساعة على الأقل في المدى المتوسط ​​نمو جديدة قبل جمع الأجنة.
  7. استبدال المتوسطة نمو ثقافة التصوير على الأقل كل سنتين نحنEKS، والتي يمكن أن يتم ذلك بالتزامن مع جمع الأجنة (انظر 3.2). بعد شهرين إلى ثلاثة أشهر، واستبدال ثقافة التصوير تماما من قبل الكبار جديد من الثقافة ذرية.
  8. إذا تم استخدام خط المعدلة وراثيا غير متماثل، الإشراف الثقافات ذرية في كثير من الأحيان عن طريق إزالة الحيوانات غير المعدلة وراثيا. من الناحية المثالية، وتوليد خطوط متماثل إذا التحوير منها ليست قاتلة أو يسبب العقم عند موجودة على كل من الكروموسومات. يكون الثقافات متماثل عادة ما يكون متوسط ​​مستوى أعلى مضان والظروف التجريبية الشاملة وأضيق، منذ راثى واحد فقط موجود.

2. إعداد مجهر والمعايرة

ملاحظة: الجنين خنفساء لديه طول الأمامي الخلفي من حوالي 600-660 ميكرون ويبلغ قطرها مستعرضة من حوالي 300-330 ميكرون. معظم الكاميرات CCD الحديثة حجم رقاقة الاستشعار من حوالي 9 مم × 7 ملم، أي قطر من 11.4 ميكرون، وعلى مسافة بكسل بكسل من 6.45 ميكرون.عندما جنبا إلى جنب مع التكبير 10x عدسة الهدف، الجنين يمكن تصوير جملة وتفصيلا مع الملعب بكسل من 0.645 ميكرون. معظم الكاميرات sCMOS الحديثة لديها أكبر حجم رقاقة الاستشعار من حوالي 16 ملم × 14 ملم، أي يبلغ قطرها 21.3 ميكرون، وعلى مسافة بكسل بكسل 6.5 ميكرون. عندما جنبا إلى جنب مع 20X التكبير عدسة الهدف، الجنين يمكن تصوير جملة وتفصيلا مع الملعب بكسل من 0.325 ميكرون.

  1. إرفاق الإضاءة والهدف كشف عدسات المجهر. تأكد من أن أشعة الليزر والمرشحات مضان تطابق امتصاص fluorophore والأطياف الانبعاثات بشكل جيد للغاية.
  2. إرفاق حجرة العينة إلى المجهر. ملء حجرة العينة مع PBS 7.4 درجة الحموضة أو أي عازلة التصوير مناسبة أخرى.
  3. تبديل ومعايرة المجهر. وقد نشرت إجراءات ومبادئ توجيهية حل لمشاكل المجاهر مبنية خصيصا على أساس ورقة الخفيفة (أكثر تحديدا لتنفيذ DSLM) معايرة شاملة العلاقات العامةeviously 65. بالنسبة للأجهزة التجارية، اتبع إرشادات الشركة المصنعة بعناية فائقة. سوء قد تستنفد غرفة عينة من المتوسطة واحداث فوضى في الصك وكذلك العينة.

3. جمع المعدلة وراثيا أو WT الأجنة

  1. تمرير مستعمرة التصوير من خلال غربال مع 800 ميكرون حجم شبكة. جمع الخنافس الكبار في زجاجة جديدة وإضافة 10 غرام من متوسط ​​وضع البيض. احتضان الثقافة وضع البيض لمدة 1 ساعة عند 25 درجة مئوية والرطوبة النسبية 70٪ في الضوء.
  2. تمرير ثقافة وضع البيض من خلال غربال مع 800 ميكرون حجم شبكة لفصل البالغين من وسط وضع البيض، والذي يحتوي على حوالي 30-100 الأجنة. نقل الكبار لزجاجة جديدة وإضافة إما ز القديم أو 50 من متوسط ​​النمو الطازجة.
  3. إذا يجب أن تبدأ الملاحظة في المرحلة الأريمة موحدة (على سبيل المثال مجموعة البيانات DS0002)، واحتضان المتوسط ​​وضع البيض لمدة 15 ساعة عند 25 درجة مئوية، والرطوبة النسبية 70٪. تيس تبدأ في بداية تراجع germband (على سبيل المثال مجموعات البيانات DS0001 و DS0003)، واحتضان الأجنة لمدة 23 ساعة عند 32 درجة مئوية، والرطوبة النسبية 70٪. وإذا رغبت مراحل النمو الأخرى، الرجوع إلى الأدب منهما 64 و 65 و التكيف مع فترة حضانة و / أو درجة الحرارة عند الضرورة.

4. الأجنة Dechorionation

ملاحظة: إن المشيمه هو الطبقة الخارجية من قشر البيض ويتكون من البروتينات والسكريات. إنه خفيف بقوة ماصة ولكنه ليس أساسيا لتحقيق التنمية السليمة وبالتالي يمكن إزالتها كيميائيا.

  1. تمرير المتوسطة وضع البيض من خلال غربال مع 300 ميكرون حجم شبكة. جمع الأجنة في مصفاة الخلية مع 100 ميكرون حجم شبكة والتخلص من بقايا المتوسطة وضع البيض.
  2. إعداد لوحة 6 جيدا على النحو التالي: ملء A1، A2، A3 والآبار B3 مع 10 مل PBS 7.4 درجة الحموضة وB1 و B2 الآبار مع 9 مل PBS. ثم يضاف بعناية1 مل هيبوكلوريت الصوديوم إلى B1 و B2. مراقبة سير خطوات 4،3-4،8 تحت المجهر ستيريو. هيبوكلوريت الصوديوم تنبيه غير قابلة للتآكل.
  3. إدراج مصفاة خلية في A1 جيدا (PBS 7.4 درجة الحموضة) وغسل الأجنة لمدة دقيقة واحدة في إطار التحريض لطيف. يجب أن جزيئات الدقيق أكبر من فصل الأجنة.
  4. نقل مصفاة الخلية إلى البئر B1 (هيبوكلوريت الصوديوم في برنامج تلفزيوني ودرجة الحموضة 7.4) ويهز لوحة بقوة لمدة 30 ثانية. يجب أن الجسيمات الدقيق المتبقية فصل تماما من الأجنة.
  5. نقل مصفاة الخلية إلى A2 جيدا (PBS 7.4 درجة الحموضة) وغسل الأجنة لمدة 1 دقيقة في إطار التحريض لطيف.
  6. لdechorionation، ونقل مصفاة الخلية إلى B2 جيدا (هيبوكلوريت الصوديوم في برنامج تلفزيوني 7.4 درجة الحموضة). يهز لوحة بقوة حتى تمزقات المشيمه ويفصل من الأجنة. المشيماء يشبه، غشاء رقيق شبه شفافة مع حواف يمزق، في حين أن الأجنة dechorionated لديها خيال عادي.
  7. عشر نقلالبريد مصفاة الخلية إلى A3 جيدا (PBS 7.4 درجة الحموضة) وغسل الأجنة لمدة 1 دقيقة في إطار التحريض لطيف. إذا لا تزال تعلق أي شظايا المشيمه للأجنة بعد الغسيل، وكرر الخطوة 4.6.
  8. تخزين الأجنة في البئر B3 (PBS 7.4 درجة الحموضة). التخزين لعدة ساعات لا يضر الأجنة، ولكن نأخذ في الاعتبار أن التنمية لا يزال مستمرا.
  9. لخطوط المعدلة وراثيا غير متماثل، وإزالة أي أجنة غير الفلورسنت إذا أمكن ذلك. لتثبيت وتلطيخ للWT أو الأجنة وراثيا، تابع الخطوة 5. للحصول على التصوير الحي من الأجنة وراثيا، تابع الخطوة 6.

5. المحي غشاء Permeabilization، التثبيت، وتلطيخ

ملاحظة: الغشاء المحي هو الطبقة الداخلية من قشر البيض. ومن منيع أصباغ الفلورسنت ويجب أن permeabilized كيميائيا قبل تلطيخ الآن.

  1. ملء قارورة التلألؤ مع الحل تثبيت / permeabilization (1.5 مل 4٪ (ث / ت) لامتصاص العرق في PBS الرقم الهيدروجيني 6.9 لالثانية 1.5 مل ن هيبتان). نقل الأجنة مع الفرشاة لقارورة. قارورة غطاء مع رقائق الألومنيوم لحماية fluorophores من الضوء واحتضان لمدة 30 دقيقة على منصة هزاز في 50 التناوب في الدقيقة الواحدة. تنبيه امتصاص العرق السامة والمسببة للتآكل، ن هيبتان هي قابلة للاشتعال والسامة.
  2. إزالة الحل تثبيت وعلاج الأجنة ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة في 3 مل 0.1٪ (ت / ت) تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني 7.4 درجة الحموضة، وبعد ذلك مرة واحدة لمدة 15 دقيقة في 3 مل 1٪ (ت / ت) تريتون X-100 في PBS الرقم الهيدروجيني 7.4 على منصة هزاز في 50 التناوب في الدقيقة الواحدة. تنبيه تريتون X-100 للتآكل.
  3. إزالة حل permeabilization وإضافة 0.5 مل من محلول تلطيخ إلى القارورة. يتم توفير حلول تلطيخ النموذجية في الجدول 2. الأجنة وصمة عار بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية على منصة هزاز في 50 التناوب في الدقيقة الواحدة. لالأصباغ المقترحة في الجدول 2، وغسل ليست ضرورية.

6. إعداد تركيب الاغاروز

  1. إضافة 1 غرام المنخفض الذوبانالاغاروز إلى 100 مل PBS 7.4 درجة الحموضة ويسخن المزيج لمدة 2-3 دقيقة في فرن الميكروويف في 800 W. إذا جزيئات صغيرة الاغاروز لا تزال موجودة، كرر عملية التسخين في 30 ثانية فترات حتى تذوب الجزيئات تماما. لا يحتاج الاغاروز متزايدة لتكون طازجة في كل مرة، وعزز الاغاروز يمكن إعادة المسال من قبل التدفئة كما هو موضح أعلاه. هذه العملية يمكن أن تتكرر 5-6 مرات من قبل قد تبخرت الكثير من المياه.
  2. السماح للالاغاروز ليبرد إلى ما يقرب من 40-45 درجة مئوية، ثم ملء اثنين من 1.5 مل أنابيب رد فعل مع الاغاروز ساخنة والحفاظ على تلك الأنابيب عند 35 درجة مئوية في thermoblock.

7. الأجنة تركيب والإدراج في غرفة عينة

  1. الخيار 1: عمود الاغاروز (الشكل 3A-C، العمود الأول، الجدول 3، العمود الثاني)
    1. ملء مل حقنة 1.0 مع الماء المقطر ونعلق عليه إلى واحدة من فتحات الزجاج الشعرية باستخدام خرطوم مطاطي صغير.ملء منتصف الطريق الشعرية مع الماء المقطر.
    2. اختيار الجنين مع الفرشاة وضعه على الجانب الداخلي من الآخرين فتح الزجاج الشعرية. المضي قدما بسرعة إلى الخطوة التالية قبل الجنين يجف.
    3. عصا الشعرية في الاغاروز السائل ورسم ببطء بضعة ميكرولتر من الاغاروز السائل جنبا إلى جنب مع الجنين في شعري. ثم بسرعة تزيد قوة رسم بحيث يتم سحب الجنين جنبا إلى جنب مع الاغاروز. في النهاية، يجب أن يكون عدد قليل ميكرولتر من الاغاروز فوق وتحت الجنين. تعيين الشعرية جانبا لبضع دقائق، والسماح للالاغاروز يصلب.
    4. تقصير الشعرية مع قطع الزجاج الماس يبلغ طوله حوالي 5 ملم. يجب ملء جزء المتبقي تماما مع الاغاروز وينبغي أن يكون الجنين داخل الربع الثاني.
    5. أدخل اسطوانة الصلب مع دبوس في حجرة العينة، ومن ثم الصاق جزء الشعرية على رأس دبوس. عمود الاغاروز يجب أن تبرز بضعة ملليمترات وROM جزء الشعرية مع الجزء الذي يحتوي على الجنين.
  2. الخيار 2: نصف الكرة الاغاروز (الشكل 3A-C، العمود الثاني، الجدول 3، العمود الثالث)
    1. رسم 200 ميكرولتر من الاغاروز السائل إلى مل حقنة 1.0، ثم استخدامه لملء الأنابيب الصلب من الأعلى مع الاغاروز حتى أشكال نصف الكرة الأرضية في افتتاح السفلي. يجب أن يكون قطرها نصف الكرة مساويا لقطر الماسورة. انتظر بضع دقائق حتى عززت agarose.
    2. اختيار الجنين مع الفرشاة وإعادة ترتيب ذلك على طرف الفرشاة بحيث تصبح نهاية الأمامي يمكن الوصول إليها. تراجع نصف الكرة الاغاروز إلى الاغاروز السائلة لتغطية ذلك مع طبقة رقيقة.
    3. وضع الجنين مع نهايته الأمامية تستقيم على قطب من نصف الكرة الاغاروز. تحويل أنابيب الصلب حول وتصحيح وضع الجنين مع الفرشاة. إذا لزم الأمر، وتثبيت الجنين عن طريق إضافة 2 ميكرولتر الاغاروز إلى الحدود جنين / نصف الكرة الغربي. المثاليلاي، ينبغي تغطية أقل من نصف سطح الجنين في الاغاروز ويجب على الأجنحة تكون حادة قدر الإمكان.
    4. إدراج أنابيب الصلب مع نصف الكرة الأرضية والجنين ببطء إلى حجرة العينة.
  3. الخيار 3: صاحب بيت العنكبوت (الشكل 3A-C، العمود الثالث، الجدول 3، العمود الرابع)
    1. اختيار الجنين مع الفرشاة وضعه جانبا.
    2. تغطية حفرة فترة زمنية محددة لصاحب بيت العنكبوت مع 5-8 ميكرولتر الاغاروز السائل، ثم إزالة معظم الاغاروز حتى لا يبقى سوى فيلم الاغاروز رقيقة.
    3. وضع الجنين على الفيلم الاغاروز وضبط موقفها. بعناية نقل الجنين الى مركز محور س من الحفرة فترة زمنية محددة، ومواءمة محورها الأمامي الخلفي ممدود مع محور ممدود من الحفرة فترة زمنية محددة.
    4. تضاف حامل بيت العنكبوت مع الجنين شنت ببطء في حجرة العينة. وضع صاحب بيت العنكبوت بحيث لا تتداخل مع الإثارة وانبعاثضوء، أي 45 درجة بالنسبة إلى X- وض محور.

مضان المجهر أساس ورقة-8. الخفيفة

  1. تقرر على طول كم من الاتجاهين (وعلى طول والتوجهات) ينبغي تصوير الجنين. أربعة اتجاهات (جنبا إلى جنب توجهات 0 درجة و 90 درجة مئوية، 180 درجة و 270 درجة) وعادة ما توفر مفاضلة جيدة بين التغطية وحمل الطاقة.
  2. إعداد عدد من القنوات مضان. المؤشرات الرئيسية لكل قناة هي خط ليزر، مرشح مضان، قوة الليزر ومدة التعرض. للتصوير الحية على المدى الطويل، من المهم أن حمل الطاقة متكامل لا يتجاوز التسامح الجنين. ومدة التعرض من 25-50 مللي يضمن التصوير السريع، في حين أن قوة الليزر ما بين 100 و 300 مللي واط ينبغي ألا يؤثر على سلامة الجنين. لعينات ثابتة، وقت التعرض وقوة الليزر يمكن الضعف على الأقل.
  3. لفحوصات التصوير الحية، تكوين مرور الوقت. شركاتوليته مرحلة التطور الجنيني من خنفساء يستغرق حوالي سبعة أيام في درجة حرارة الغرفة (23 ± 1 ° C)، وأقل قليلا من ثلاثة أيام في 32-35 ° C 64. تحديد الفترة الزمنية وفقا للأحداث التخلق التي ينبغي مراعاتها. لفترات زمنية قصيرة، والنظر في تخفيض وقت التعرض وقوة الليزر (انظر 8.2).
  4. وضع الجنين في وضع نقل الضوء على X- وy محاور في مركز مجال الرؤية دون تعريضها ليزر. تدوير الجنين 360 درجة في 90 ° الخطوات لفحص الجنين عن أي ضرر يمكن أن حدثت أثناء عملية التركيب.
  5. تدوير الجنين بشكل مناسب حول المحور الصادي لمحاذاة محاور الجنينية مع محاور المجهر، على سبيل المثال محور الجانبي مع محور س، أي محور ظهري بطني مع محور ض. عند استخدام تقنية صاحب بيت العنكبوت، قد المحاذاة لا يكون ممكنا.
  6. في وضع مضان، وتحديد كومة ض FOص كل اتجاه. إضافة 25-50 ميكرون كما عازلة المكاني في الجبهة من وراء الجنين. بما في ذلك المخزن المؤقت، وض المكدس نموذجي يغطي حوالي 350-400 ميكرون للجنين خنفساء. أيضا تحديد ض تباعد، التي ينبغي أن تكون أربع مرات التباعد الأفقي، أي التباعد على طول X- و y-محاور 66.
  7. إذا يتم تصوير اثنين أو أكثر من الأجنة في موازاة ذلك، أعد في 8.4 مع الجنين القادم.
  8. للتصوير على المدى الطويل، وضمان أن يتم تعبئة حجرة العينة مع كافية PBS 7.4 درجة الحموضة أو عازلة التصوير الأخرى. تشمل أيضا افتتاح حجرة العينة.
  9. بدء عملية التصوير. للتصوير الحية على المدى الطويل، ومراقبة حيازة الصحيح على طول كل الاتجاهات في جميع القنوات لجميع الأجنة. في بعض الأحيان تحقق خلال الأيام القادمة أن الأجنة على قيد الحياة وفي المكان المناسب.

9. الجنين استرجاع ومراقبة الجودة

  1. وبمجرد الانتهاء من التصوير، وإزالة صاحب العينة معالأجنة من حجرة العينة. الأجنة فقط من فحوصات التصوير الحية يجب أن يتم استردادها. يمكن التخلص منها الأجنة الثابتة والملون.
  2. إذا تم إجراء فحص التصوير الحي، ونقل الجنين الى شريحة الكائن. لتقنية عمود الاغاروز، استخراج الأجنة من المحيط الاغاروز مع مشرط، والصغرى سكين أو شفرة حلاقة. لتقنية نصف الكرة الاغاروز، ونقل الكرة الأرضية مع الجانب المسطح إلى الشريحة الكائن. إزالة الجنين ليست ضرورية. لتقنية صاحب بيت العنكبوت، ترجل بلطف الأجنة من الفيلم الاغاروز مع الفرشاة. احتضان الشريحة الكائن في وعاء زجاجي صغير في الغلاف الجوي الرطوبة المشبعة تحت ظروف قياسية حتى يفقس يرقات.
  3. بعد الفقس، ونقل اليرقات إلى الآبار الفردية من 24 لوحة جيدا وإضافة 500 ملغ من متوسط ​​النمو إلى كل بئر. احتضان تحت الظروف القياسية. مقارنة الوقت اللازم لتطوير كامل والتشكل من اليرقات تصوير لWT غير المصورة وlarv المعدلة وراثياعبد اللطيف (انظر المناقشة). في المقايسات التي تميز تنمية WT، يجب أن تكون هناك انحرافات واضحة المورفولوجية ملحوظ بشكل مثالي.
  4. وبمجرد أن اليرقات تطوير للبالغين الأصحاء، وتزويدهم شركاء WT المناسب من نفس السلالة الخلفية. بعد أسبوعين، تحقق لإنتاج ذرية. ضع في اعتبارك أيضا للتحقق من خصوبة النسل عن طريق التزاوج منهم بين يقلص. فقط عندما تتطور الأجنة تصوير في البالغين الخصبة التي تنتج ذرية خصبة، وإجراء التصوير يمكن اعتبار غير الغازية.

10. معالجة الصور البيانات

ملاحظة: للحصول على معالجة بيانات الصورة، وأوصت مفتوحة المصدر برامج معالجة الصور يماغيج 67 أو فيجي مشابه لها 68. تم العثور على كلا الإصدارين فضلا عن وثائق شاملة على www.imagej.net. تنسيق الملف القياسي لبيانات LSFM هو شكل ملف صورة الموسومة (TIFF). يسمح خيار حاوية جوهري في ستوالغضب من مداخن صورة مثل ض المداخن أو سلسلة زمنية من التوقعات القصوى ض ضمن ملف واحد التي يمكن فتحها في يماغيج أو فيجي عن طريق السحب والإفلات.

  1. إذا لزم الأمر، وتناوب على ض مداخن لتحقيق المواءمة بين المحور الأمامي الخلفي للجنين مع المحور الصادي (صورة → → تحويل تدوير). يرجى ملاحظة أن المعلمات التناوب يجب أن يتم تعيين بشكل فردي لكل اتجاه، ولكن ليس لمرور الوقت والقنوات مضان.
  2. اقتصاص مداخن ض على طول X-، Y- وض محاور بحيث الحد الأدنى من الخلفية فقط (20 - 40 بكسل على طول X- ومحاور ذ، 5-10 طائرات على طول محور ض) تبقى (لس - ومحاور ذ، استخدم أداة التحديد المستطيلة، ثم صورة → المحاصيل، وبالنسبة للض محور، واستخدام صورة → الأكوام → → أدوات شريحة حارس). يرجى ملاحظة أن المعلمات المحاصيل يجب أن يتم تعيين بشكل فردي لكل اتجاه، ولكن ليس لنقاط الوقت والقنوات مضان.
  3. حساب الحد الأقصى لإسقاط ض لكل ض المكدس(صورة → الأكوام مشروع Z →، واختيار ماكس الكثافة). حسابات كثافة الإسقاط هي إجراءات تبسيط البيانات التي تعمل على إزالة البعد المكاني واحد.
  4. للحصول على بيانات التصوير الحي على المدى الطويل، والنظر في استخدام يماغيج أو النصي فيجي التي تنفذ معالجة الخطوات 10،1-10،3 لجميع الاتجاهات، وجميع النقاط الوقت وجميع القنوات مضان 65. من الناحية المثالية، سلسلة جميع القصوى التوقعات ض لكل قناة والتوجيه وحفظها على شكل سلسلة من الوقت في حاوية TIFF واحد. بدلا من ذلك، المكونات في BigDataViewer 69 لفيجي يمكن استخدامها للتنقل من خلال مجموعات البيانات الكبيرة تيرابايت.
  5. اعتمادا على طرائق الخط والتصوير المعدلة وراثيا، والتعديلات كثافة ديناميكية من مداخن الوقت قد يكون من المرغوب فيه بسبب الصورة تبيض و / أو fluorophore تقلبات التعبير. إما ImageJ- أو فيجي مضمن ظيفة بليتش تصحيح (صورة → → ضبط تصحيح بليتش، اختر الرسم البياني مطابقة) أو dedicaواقترح تيد البرمجيات 65.
  6. ينصح إذا تم تسجيل الجنين و / أو على طول عدة اتجاهات وفي القنوات مضان متعددة، والجمع الأفقي للالاتجاهين (صورة → الأكوام → → أدوات الجمع) ودمج قناة (صورة → اللون دمج → القنوات).
  7. تسجيل ودمج ض مداخن المكتسبة على طول عدة اتجاهات 70، في نهاية المطاف في تركيبة مع إزالة التفاف 71، يسمح حساب صورا ثلاثية الأبعاد فائقة الجودة موحدة وقرار موحد الخواص. كل من المكونات الإضافية هي مفتوحة المصدر ومثبتة مسبقا في فيجي، لكنها تتطلب وجود معالم (المجهرية الفلورسنت، مثل حبات) حول العينة.
  8. إطار عمل مفتوح المصدر لاستخراج واسعة النطاق البيانات الكمية والتحليل وتتوفر أيضا، على سبيل المثال لتقسيم وتتبع نواة الخلية 72 أو سلل شكل اعتراف 73.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول في إطار تجريبي للتصوير مضان المعيشة أو ثابتة وملطخة الأجنة خنفساء مع LSFM. ويرجع ذلك إلى انخفاض مستويات الصورة تبيض والصور سمية، وهي نتيجة مباشرة لقدرتها باجتزاء البصرية، LSFM بشكل خاص مناسبة تماما لتصوير حي على المدى الطويل.

وAGOC رواية {ATub'H2B-mEmerald} # 1 خط المعدلة وراثيا يعبر عن انصهار بروتين histone2B-mEmerald ت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

رقابة جودة

في فحوصات التصوير الحية، يجب أن تكون إجراءات إعداد وتسجيل غير الغازية، أي لا الميكانيكية والتعامل مع المواد الكيميائية (جمع، dechorionation و التركيب على حامل العينة) ولا تحميل الطاقة المتكاملة خلال الملاحظة أن تؤثر على سلامة العينة. للدراسات التي تميز تنمية WT، فمن المستحسن استخدام البيانات الوحيدة من التجارب التي الجنين على قيد الحياة في عملية التسجيل، يتم استرداد بنجاح وتطو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الكاتب الاشتراكات

تصور FS وEHKS البحث. FS إنشاء خطوط AGOC المعدلة وراثيا. وقد أجريت خفيفة على أساس ورقة التصوير مضان التي كتبها FS وSK. كتب FS وEHKS المخطوطة مع مدخلات من SK.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر سفين بلاث للدعم التقني. وكان خط المعدلة وراثيا، الدبقية الأزرق هدية عينية من جريجور بوشر (غوتنغن، ألمانيا). وقد تم تمويل هذا البحث من قبل الكتلة التميز فرانكفورت للالمجمعات ضخم (CEF-MC، EXC 115، المتحدث فولكر دوتشش) الممنوحة في جزء منه إلى EHKS في معهد BUCHMANN لعلوم الحياة الجزيئية (BMLS، مدير إنريكو شليف) في Goethe UNIVERSITAT فرانكفورت قبل جمعية الألمانية للبحوث (DFG).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
دقيق القمح كامل الحبوبديميتر إي في1.13E + 08الولايات المتحدة: دقيق القمح الكامل ، المملكة المتحدة: دقيق القمح الكامل
405 دقيق القمح الناعمDemeter e.V.1.13E + 08الولايات المتحدة: دقيق المعجنات ، المملكة المتحدة: دقيق طري
غير نشط خميرة جافةFlystuff / Genesee Scientific62-106
Saine المخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4Thermo Fisher Scientific10010-023
هيبوكلوريت الصوديوم ، ~ 12٪ نشط ClSigma Aldrich425044-250MLتحذير: هيبوكلوريت الصوديوم هو آغاروز
منخفض الذوبانالتآكل كارل روث6351.2
صفيحة 6 آباربرتقالية علمية4430500
صفيحة 24 بئربرتقالية علمية4430300
شعيرات دموية زجاجية داخلية & 0.46 ممالعلامة التجارية GmbH + Co KG7087 09
SYTOX GreenThermo Fisher Scientific57020شرح تحضير محلول التلوين في الجدول 2
YOYO-1 Iodideتم شرح تحضير محلول التلوينY3601
BOBO-3 IodideThermo Fisher ScientificB3586شرح تحضير محلول التلوين في الجدول 2
Alexa Fluor 488 PhalloidinThermo Fisher ScientificA12379شرح تحضير محلول التلوين في الجدول 2
Alexa Fluor 546 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22283يتم شرح تحضير محلول التلوين في الجدول 2
غربال ، 800 & م حجم شبكةVWR الدولية200.025.222-051
غربال ، 710 & م حجم شبكةVWR International200.025.222-050لإعداد متوسط النمو (الخطوة 1.1)
غربال ، 300 وميكرو ؛ م حجم شبكةVWR الدولية200.025.222-040
غربال ، 250 وميكرو ؛ حجم شبكة mVWR International200.025.222-038لإعداد متوسط وضع البيض (الخطوة 1.2)
طبق زجاجي ، & أوسلاش ؛ 100 مم ومرات ؛ 20 ممخلية CLS70165102Sigma Aldrich
، 100 & micro ؛ حجم شبكة mفرشاة طلاء BD Biosciences352360
، رأس & 2 ممحقنة VWR International149-2121
، 1.0 ملB. براون ميديكال AG9166017V
قوارير تلألؤSigma AldrichM1152-1000EA
paraformaldehyde (PFA)Sigma Aldrich158127تحذير: بارافورمالدهيد سام ومسبب للتآكل
ن-هيبتان &GE; 99٪كارل روث8654.1تحذير: n-heptane قابل للاشتعال وسام
Triton X-100Sigma AldrichX100-100MLتحذير: Trition X-100 مادة أكالة
يتم Thermo Fisher Scientific في الجدول 2 تم تم مصفاة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brown, S. J., Denell, R. E., Beeman, R. W. Beetling around the genome. Genet. Res. 82, 155-161 (2003).
  2. Misof, B., et al. Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 346, 763-767 (2014).
  3. Tong, K. J., Duchêne, S., Ho, S. Y. W., Lo, N. INSECT PHYLOGENOMICS. Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487(2015).
  4. Kjer, K. M., et al. INSECT PHYLOGENOMICS. Response to Comment on "Phylogenomics resolves the timing and pattern of insect evolution. Science. 349, 487(2015).
  5. Klingler, M. Tribolium. Curr Biol. 14, 639-640 (2004).
  6. Savard, J., Marques-Souza, H., Aranda, M., Tautz, D. A segmentation gene in tribolium produces a polycistronic mRNA that codes for multiple conserved peptides. Cell. 126, 559-569 (2006).
  7. Yang, X., Zarinkamar, N., Bao, R., Friedrich, M. Probing the Drosophila retinal determination gene network in Tribolium (I): The early retinal genes dachshund, eyes absent and sine oculis. Dev. Biol. 333, 202-214 (2009).
  8. Peel, A. D. Forward genetics in Tribolium castaneum: opening new avenues of research in arthropod biology. J. Biol. 8, 106(2009).
  9. Lynch, J. A., El-Sherif, E., Brown, S. J. Comparisons of the embryonic development of Drosophila, Nasonia, and Tribolium. Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 1, 16-39 (2012).
  10. Schröder, R., Jay, D. G., Tautz, D. Elimination of EVE protein by CALI in the short germ band insect Tribolium suggests a conserved pair-rule function for even skipped. Mech. Dev. 80, 191-195 (1999).
  11. Posnien, N., Schinko, J. B., Kittelmann, S., Bucher, G. Genetics, development and composition of the insect head--a beetle's view. Arthropod Struct. Dev. 39, 399-410 (2010).
  12. Posnien, N., Koniszewski, N. D. B., Hein, H. J., Bucher, G. Candidate gene screen in the red flour beetle Tribolium reveals six3 as ancient regulator of anterior median head and central complex development. PLoS Genet. 7, 1002416(2011).
  13. Angelini, D. R., Smith, F. W., Aspiras, A. C., Kikuchi, M., Jockusch, E. L. Patterning of the adult mandibulate mouthparts in the red flour beetle, Tribolium castaneum. Genetics. 190, 639-654 (2012).
  14. Coulcher, J. F., Telford, M. J. Cap'n'collar differentiates the mandible from the maxilla in the beetle Tribolium castaneum. Evodevo. 3, 25(2012).
  15. Peel, A. D., et al. Tc-knirps plays different roles in the specification of antennal and mandibular parasegment boundaries and is regulated by a pair-rule gene in the beetle Tribolium castaneum. BMC Dev. Biol. 13, 25(2013).
  16. Bucher, G., Klingler, M. Divergent segmentation mechanism in the short germ insect Tribolium revealed by giant expression and function. Development. 131, 1729-1740 (2004).
  17. Handel, K., Basal, A., Fan, X., Roth, S. Tribolium castaneum twist: gastrulation and mesoderm formation in a short-germ beetle. Dev. Genes Evol. 215, 13-31 (2005).
  18. Roth, S., Hartenstein, V. Development of Tribolium castaneum. Development Genes and Evolution. 218, 115-118 (2008).
  19. Schröder, R., Beermann, A., Wittkopp, N., Lutz, R. From development to biodiversity--Tribolium castaneum, an insect model organism for short germband development. Dev. Genes Evol. 218, 119-126 (2008).
  20. Sharma, R., Beermann, A., Schröder, R. The dynamic expression of extraembryonic marker genes in the beetle Tribolium castaneum reveals the complexity of serosa and amnion formation in a short germ insect. Gene Expr. Patterns. 13, 362-371 (2013).
  21. Benton, M. A., Pavlopoulos, A. Tribolium embryo morphogenesis: may the force be with you. Bioarchitecture. 4, 16-21 (2014).
  22. Horn, T., Hilbrant, M., Panfilio, K. A. Evolution of epithelial morphogenesis: phenotypic integration across multiple levels of biological organization. Front. Genet. 6, 303(2015).
  23. Hilbrant, M., Horn, T., Koelzer, S., Panfilio, K. A. The beetle amnion and serosa functionally interact as apposed epithelia. Elife. 5, (2016).
  24. Jacobs, C. G. C. C., vander Zee, M. Immune competence in insect eggs depends on the extraembryonic serosa. Dev. Comp. Immunol. 41, 263-269 (2013).
  25. Jacobs, C. G. C., Spaink, H. P., vander Zee, M. The extraembryonic serosa is a frontier epithelium providing the insect egg with a full-range innate immune response. Elife. 3, (2014).
  26. Jacobs, C. G. C., Rezende, G. L., Lamers, G. E. M., vander Zee, M. The extraembryonic serosa protects the insect egg against desiccation. Proc. Biol. Sci. 280, 20131082(2013).
  27. Lewis, D. L., DeCamillis, M., Bennett, R. L. Distinct roles of the homeotic genes Ubx and abd-A in beetle embryonic abdominal appendage development. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4504-4509 (2000).
  28. Beermann, A., et al. The Short antennae gene of Tribolium is required for limb development and encodes the orthologue of the Drosophila Distal-less protein. Development. , 287-297 (2001).
  29. Grossmann, D., Scholten, J., Prpic, N. -M. Separable functions of wingless in distal and ventral patterning of the Tribolium leg. Dev. Genes Evol. 219, 469-479 (2009).
  30. Angelini, D. R., Smith, F. W., Jockusch, E. L. Extent With Modification: Leg Patterning in the Beetle Tribolium castaneum and the Evolution of Serial Homologs. G3. 2, Bethesda. 235-248 (2012).
  31. Grossmann, D., Prpic, N. -M. Egfr signaling regulates distal as well as medial fate in the embryonic leg of Tribolium castaneum. Dev. Biol. 370, 264-272 (2012).
  32. Emerging Model Organisms: A Laboratory Manual, Volume 2. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. (2010).
  33. Brown, S. J., Mahaffey, J. P., Lorenzen, M. D., Denell, R. E., Mahaffey, J. W. Using RNAi to investigate orthologous homeotic gene function during development of distantly related insects. Evol. Dev. 1, 11-15 (1999).
  34. Tomoyasu, Y., Denell, R. E. Larval RNAi in Tribolium (Coleoptera) for analyzing adult development. Dev. Genes Evol. 214, 575-578 (2004).
  35. Linz, D. M., Clark-Hachtel, C. M., Borràs-Castells, F., Tomoyasu, Y. Larval RNA interference in the red flour beetle, Tribolium castaneum. J. Vis. Exp. , e52059(2014).
  36. Bucher, G., Scholten, J., Klingler, M. Parental RNAi in Tribolium (Coleoptera). Curr. Biol. 12, 85-86 (2002).
  37. Posnien, N., et al. RNAi in the red flour beetle (Tribolium). Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  38. Lorenzen, M. D., et al. piggyBac-mediated germline transformation in the beetle Tribolium castaneum. Insect Mol. Biol. 12, 433-440 (2003).
  39. Berghammer, A. J., Weber, M., Trauner, J., Klingler, M. Red flour beetle (Tribolium) germline transformation and insertional mutagenesis. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  40. Pavlopoulos, A., Berghammer, A. J., Averof, M., Klingler, M. Efficient transformation of the beetle Tribolium castaneum using the Minos transposable element: quantitative and qualitative analysis of genomic integration events. Genetics. 167, 737-746 (2004).
  41. Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum. Development. 142, 2832-2839 (2015).
  42. Richards, S., et al. The genome of the model beetle and pest Tribolium castaneum. Nature. 452, 949-955 (2008).
  43. Kim, H. S., et al. BeetleBase in 2010: revisions to provide comprehensive genomic information for Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 38, 437-442 (2010).
  44. Stappert, D., Frey, N., von Levetzow, C., Roth, S. Genome-wide identification of Tribolium dorsoventral patterning genes. Development. 143, 2443-2454 (2016).
  45. Pavlek, M., Gelfand, Y., Plohl, M., Meštrović, N. Genome-wide analysis of tandem repeats in Tribolium castaneum genome reveals abundant and highly dynamic tandem repeat families with satellite DNA features in euchromatic chromosomal arms. DNA Res. 22, 387-401 (2015).
  46. Vlahović, I., Glunčić, M., Rosandić, M., Ugarković, Đ, Paar, V. Regular higher order repeat structures in beetle Tribolium castaneum genome. Genome Biol. Evol. , (2016).
  47. Keeling, C. I., et al. Draft genome of the mountain pine beetle, Dendroctonus ponderosae Hopkins, a major forest pest. Genome Biol. 14, 27(2013).
  48. Vega, F. E., et al. Draft genome of the most devastating insect pest of coffee worldwide: the coffee berry borer, Hypothenemus hampei. Sci. Rep. 5, 12525(2015).
  49. Cunningham, C. B., et al. The Genome and Methylome of a Beetle with Complex Social Behavior, Nicrophorus vespilloides (Coleoptera: Silphidae). Genome Biol. Evol. 7, 3383-3396 (2015).
  50. Meyer, J. M., et al. Draft Genome of the Scarab Beetle Oryctes borbonicus on La Réunion Island. Genome Biol. Evol. 8, 2093-2105 (2016).
  51. Trauner, J., et al. Large-scale insertional mutagenesis of a coleopteran stored grain pest, the red flour beetle Tribolium castaneum, identifies embryonic lethal mutations and enhancer traps. BMC Biol. 7, 73(2009).
  52. Schmitt-Engel, C., et al. The iBeetle large-scale RNAi screen reveals gene functions for insect development and physiology. Nat. Commun. 6, 7822(2015).
  53. Dönitz, J., et al. iBeetle-Base: a database for RNAi phenotypes in the red flour beetle Tribolium castaneum. Nucleic Acids Res. 43, 720-725 (2015).
  54. Keller, P. J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb. Protoc. 2010, (2010).
  55. Weber, M., Huisken, J. Light sheet microscopy for real-time developmental biology. Curr. Opin. Genet. Dev. 21, 566-572 (2011).
  56. Stelzer, E. H. K. Light-sheet fluorescence microscopy for quantitative biology. Nat. Methods. 12, 23-26 (2015).
  57. Strobl, F., Stelzer, E. H. K. Non-invasive long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos. Development. , 1-8 (2014).
  58. Koniszewski, N. D. B., et al. The insect central complex as model for heterochronic brain development-background, concepts, and tools. Dev. Genes Evol. , (2016).
  59. Gualda, E. J., et al. OpenSpinMicroscopy: an open-source integrated microscopy platform. Nat. Methods. 10, 599-600 (2013).
  60. Pitrone, P. G., et al. OpenSPIM: an open-access light-sheet microscopy platform. Nat. Methods. 10, 598-599 (2013).
  61. Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy. Nat. Methods. 9, 755-763 (2012).
  62. Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging. Nat. Methods. 9, 730-733 (2012).
  63. Chhetri, R. K., et al. Whole-animal functional and developmental imaging with isotropic spatial resolution. Nat. Methods. 12, 1171-1178 (2015).
  64. Brown, S. J., et al. The red flour beetle, Tribolium castaneum (Coleoptera): a model for studies of development and pest biology. Cold Spring Harb. Protoc. 2009, (2009).
  65. Strobl, F., Schmitz, A., Stelzer, E. H. K. Live imaging of Tribolium castaneum embryonic development using light-sheet-based fluorescence microscopy. Nat. Protoc. 10, 1486-1507 (2015).
  66. Engelbrecht, C. J., Stelzer, E. H. Resolution enhancement in a light-sheet-based microscope (SPIM). Opt. Lett. 31, 1477-1479 (2006).
  67. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat. Methods. 9, 671-675 (2012).
  68. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat. Methods. 9, 676-682 (2012).
  69. Pietzsch, T., Saalfeld, S., Preibisch, S., Tomancak, P. BigDataViewer: visualization and processing for large image data sets. Nat. Methods. 12, 481-483 (2015).
  70. Preibisch, S., Saalfeld, S., Schindelin, J., Tomancak, P. Software for bead-based registration of selective plane illumination microscopy data. Nat. Methods. 7, 418-419 (2010).
  71. Preibisch, S., et al. Efficient Bayesian-based multiview deconvolution. Nat. Methods. 11, 645-648 (2014).
  72. Amat, F., et al. Fast, accurate reconstruction of cell lineages from large-scale fluorescence microscopy data. Nat. Methods. 11, 951-958 (2014).
  73. Stegmaier, J., et al. Real-Time Three-Dimensional Cell Segmentation in Large-Scale Microscopy Data of Developing Embryos. Dev. Cell. 36, 225-240 (2016).
  74. Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression. Insect Biochem. Mol. Biol. 38, 749-755 (2008).
  75. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. K. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78, 23705(2007).
  76. El-Sherif, E., Averof, M., Brown, S. J. A segmentation clock operating in blastoderm and germband stages of Tribolium development. Development. , (2012).
  77. Panfilio, K. a, Oberhofer, G., Roth, S. High plasticity in epithelial morphogenesis during insect dorsal closure. Biol. Open. 2, 1108-1118 (2013).
  78. Koelzer, S., Kölsch, Y., Panfilio, K. A. Visualizing late insect embryogenesis: extraembryonic and mesodermal enhancer trap expression in the beetle Tribolium castaneum. PLoS One. 9, 103967(2014).
  79. Nakamoto, A., et al. Changing cell behaviours during beetle embryogenesis correlates with slowing of segmentation. Nat. Commun. 6, 6635(2015).
  80. Horn, T., Panfilio, K. A. Novel functions for Dorsocross in epithelial morphogenesis in the beetle Tribolium castaneum. Development. 143, 3002-3011 (2016).
  81. Benton, M. A., Akam, M., Pavlopoulos, A. Cell and tissue dynamics during Tribolium embryogenesis revealed by versatile fluorescence labeling approaches. Development. 140, 3210-3220 (2013).
  82. van der Zee, M., et al. Innexin7a forms junctions that stabilize the basal membrane during cellularization of the blastoderm in Tribolium castaneum. Development. 142, 2173-2183 (2015).
  83. Macaya, C. C., Saavedra, P. E., Cepeda, R. E., Nuñez, V. A., Sarrazin, A. F. A Tribolium castaneum whole-embryo culture protocol for studying the molecular mechanisms and morphogenetic movements involved in insect development. Dev. Genes Evol. 226, 53-61 (2016).
  84. Sarrazin, A. F., Peel, A. D., Averof, M. A Segmentation Clock with Two-Segment Periodicity in Insects. Science. 336, 338-341 (2012).
  85. Nollmann, F. I., et al. A photorhabdus natural product inhibits insect juvenile hormone epoxide hydrolase. Chembiochem. 16, 766-771 (2015).
  86. Strobl, F., Stelzer, E. H. Long-term fluorescence live imaging of Tribolium castaneum embryos: principles, resources, scientific challenges and the comparative approach. Curr. Opin. Insect Sci. 18, 17-26 (2016).
  87. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Digital scanned laser light-sheet fluorescence microscopy (DSLM) of zebrafish and Drosophila embryonic development. Cold Spring Harb. Protoc. 2011, 1235-1243 (2011).
  88. Reynaud, E. G., Peychl, J., Huisken, J., Tomancak, P. Guide to light-sheet microscopy for adventurous biologists. Nat. Methods. 12, 30-34 (2015).
  89. Cerny, A. C., Bucher, G., Schröder, R., Klingler, M. Breakdown of abdominal patterning in the Tribolium Krüppel mutant jaws. Development. 132, (2005).
  90. Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322, 1065-1069 (2008).
  91. Sulston, I. A., Anderson, K. V. Embryonic patterning mutants of Tribolium castaneum. Development. 122, (1996).
  92. Berghammer, A., Bucher, G., Maderspacher, F., Klingler, M. A system to efficiently maintain embryonic lethal mutations in the flour beetle Tribolium castaneum. Dev. Genes Evol. 209, 382-389 (1999).
  93. Brown, S., et al. Implications of the Tribolium Deformed mutant phenotype for the evolution of Hox gene function. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4510(2000).
  94. Wu, Y., et al. Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 17708-17713 (2011).
  95. Kumar, A., et al. Dual-view plane illumination microscopy for rapid and spatially isotropic imaging. Nat. Protoc. 9, 2555(2014).
  96. McGorty, R., et al. Open-top selective plane illumination microscope for conventionally mounted specimens. Opt. Express. 23, 16142-16153 (2015).
  97. Amat, F., et al. Efficient processing and analysis of large-scale light-sheet microscopy data. Nat. Protoc. 10, 1679-1696 (2015).
  98. Shcherbakova, D. M., Verkhusha, V. V. Near-infrared fluorescent proteins for multicolor in vivo imaging. Nat. Methods. 10, 751-754 (2013).
  99. Supatto, W., McMahon, A., Fraser, S. E., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of collective cell migration during Drosophila gastrulation: multiphoton microscopy and computational analysis. Nat. Protoc. 4, 1397-1412 (2009).
  100. Royer, L. A., et al. Adaptive light-sheet microscopy for long-term, high-resolution imaging in living organisms. Nat. Biotechnol. , (2016).
  101. Keller, P. J., et al. Fast, high-contrast imaging of animal development with scanned light sheet-based structured-illumination microscopy. Nat. Methods. 7, 637-642 (2010).
  102. Caroti, F., Urbansky, S., Wosch, M., Lemke, S. Germ line transformation and in vivo labeling of nuclei in Diptera: report on Megaselia abdita (Phoridae) and Chironomus riparius (Chironomidae). Dev. Genes Evol. 225, 179-186 (2015).
  103. Handler, A. M. Use of the piggyBac transposon for germ-line transformation of insects. Insect Biochem. Mol. Biol. 32, 1211-1220 (2002).
  104. Schulte, C., Theilenberg, E., Müller-Borg, M., Gempe, T., Beye, M. Highly efficient integration and expression of piggyBac-derived cassettes in the honeybee (Apis mellifera). Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 111, 9003-9008 (2014).
  105. Tamura, T., et al. Germline transformation of the silkworm Bombyx mori L. using a piggyBac transposon-derived vector. Nat. Biotechnol. 18, 81-84 (2000).
  106. Marcus, J. M., Ramos, D. M., Monteiro, A. Germline transformation of the butterfly Bicyclus anynana. Proc. R. Soc. B Biol. Sci. 271, 263-265 (2004).
  107. Catteruccia, F., et al. Stable germline transformation of the malaria mosquito Anopheles stephensi. Nature. 405, 959-962 (2000).
  108. Grossman, G. L., et al. Germline transformation of the malaria vector, Anopheles gambiae, with the piggyBac transposable element. Insect Mol. Biol. 10, 597-604 (2001).
  109. Labbé, G. M. C., Nimmo, D. D., Alphey, L. piggybac- and PhiC31-mediated genetic transformation of the Asian tiger mosquito Aedes albopictus (Skuse). PLoS Negl. Trop. Dis. 4, 788(2010).
  110. Patel, N. H. It's a bug's life. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97, 4442-4444 (2000).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Z

مقالات ذات صلة