مقالة منهجية

عزل بروتينات الشعيرة المتوسطة من أنسجة الفئران المتعددة لدراسة التعديلات المرتبطة بالشيخوخة بعد الترجمة

DOI:

10.3791/55655

⸱

مايو 18, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الطريقة، نقدم الإجراءات البيوكيميائية لعزل سريعة وفعالة من البروتينات خيوط (إف) وسيطة من أنسجة الماوس متعددة. يمكن استخدام إفس معزولة لدراسة التغيرات في التعديلات بعد متعدية من قبل الطيف الكتلي وغيرها من المقايسات الكيميائية الحيوية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الشعيرات المتوسطة (إفس)، جنبا إلى جنب مع خيوط الأكتين والأنابيب الدقيقة، تشكل الهيكل الخلوي - عنصرا هيكليا حاسما في كل خلية. أداء طبيعي توفر إفس الخلايا مع مرونة الميكانيكية والقدرة على الإجهاد، في حين أن خلل هيكلي خلل إف يخل بالصحة الخلوية، وكان مرتبطا مع العديد من الأمراض البشرية. التعديلات بعد متعدية (بتمس) تنظم بشكل حاسم ديناميات إف استجابة للتغيرات الفسيولوجية وتحت ظروف الإجهاد. ولذلك، فإن القدرة على رصد التغييرات في توقيع بتم من إفس يمكن أن تسهم في فهم وظيفي أفضل، وتكييف في نهاية المطاف، من نظام إف كمجيب مجيب أثناء الإصابة الخلوية. ومع ذلك، فإن العدد الكبير من البروتينات إف، التي يتم ترميزها من قبل أكثر من 70 الجينات الفردية ويعبر عنها بطريقة تعتمد على الأنسجة، هو التحدي الرئيسي في فرز الأهمية النسبية لمختلف بتمس. تحقيقا لهذه الغاية، والأساليب التي تمكن من مراقبة بتمس على إف البروتيناتعلى مستوى الكائن الحي، بدلا من أفراد الأسرة المعزولين، أن يسرع التقدم في مجال البحوث في هذا المجال. هنا، نقدم طرق البيوكيميائية لعزل الكلي، المنظفات القابلة للذوبان، وجزء مقاوم للمنظفات من البروتينات إف من 9 أنسجة الماوس المختلفة (الدماغ والقلب والرئة والكبد والأمعاء الدقيقة والأمعاء الغليظة والبنكرياس والكلى، و طحال). نحن أيضا إظهار بروتوكول الأمثل لعزل سريع من البروتينات إف باستخدام مصفوفة ليسينغ والتجانس الآلي من أنسجة الماوس المختلفة. بروتوكول الآلي هو مفيد ل إفس التنميط في التجارب ذات حجم عينة عالية (كما هو الحال في نماذج المرض التي تنطوي على حيوانات متعددة والمجموعات التجريبية). ويمكن استخدام العينات الناتجة عن مختلف التحليلات المصب، بما في ذلك التنميط القائم على الطيف الكتلي بتم. باستخدام هذه الأساليب، ونحن نقدم بيانات جديدة لإظهار أن إف البروتينات في أنسجة الماوس المختلفة (الدماغ والكبد) تخضع لتغييرات موازية فيما يتعلق إكسبريسمستويات سيون و بتمس خلال الشيخوخة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إفس هي عائلة من البروتينات التي في البشر يتم ترميزها من قبل 73 الجينات وتصنيفها إلى ستة أنواع رئيسية: أنواع I-إيف هي السيتوبلازمية (على سبيل المثال كيراتينس الظهارية والشعر (K)، ميوسيت ديسمين، العصبية، الدبقية الليفي الحمضية البروتين (غفاب) و اخرين)؛ النوع الخامس هي اللامين النووي. والنوع السادس هي إفس في عدسة العين 1 . من حيث التنظيم الجزيئي، والبروتينات إف لديها ثلاثة مجالات مشتركة: نطاق "ملف" قضيب ملفوفة للغاية، و "الرأس" و "ذيل" المجالات الكروية. إذا تجمع تيترامرز البروتين لتشكيل السلائف خيوط قصيرة، والتي يتم تضمينها في نهاية المطاف في خيوط ناضجة التي تشكل الهياكل الهيكلية الهيكلية والهياكل النووية الحيوية المشاركة في الحماية الميكانيكية 2 ، والاستشعار الإجهاد 3 ، 4 ، وتنظيم النسخ 5 والنمو، وغيرها من الوظائف الخلوية الحرجة"> 1 ، 6 ، 7 .

وتسلط الضوء على أهمية وظيفية للنظام إف من وجود العديد من الأمراض البشرية الناجمة عن الطفرات الصفر في الجينات إف، بما في ذلك الاعتلال العصبي، اعتلال عضلي، واضطرابات هشاشة الجلد، اختلالات التمثيل الغذائي، ومتلازمات الشيخوخة المبكرة 8 . بعض الطفرات الجينية إف لا تسبب، ولكن تأهب ناقلاتهم إلى تطور المرض، مثل كيراتينس الظهارية بسيطة في أمراض الكبد 9 . ويرجع هذا الأخير إلى وظائف حرجة واقية من الإجهاد إفس في الظهارة. إفس بشكل عام هي من بين البروتينات الخلوية الأكثر وفرة في ظل الظروف القاعدية، ولكن هي أكثر بقوة الناجم خلال أنواع مختلفة من الإجهاد 10 . على سبيل المثال، أظهرت الدراسات الحديثة تقييم التغيرات على نطاق البروتيوم في الديدان الخيطية C. ايليجانس أن إفس متعددة هي أوبريغولاتد للغاية وعرضة لتجميععلى خلال الشيخوخة العضوية 11 ، 12 . منذ الحفاظ على بنية إف المناسبة أمر ضروري للمقاومة الخلوية لمختلف أشكال الإجهاد 10 ، إف التجميع قد تسهم أيضا في الانخفاض الوظيفي خلال الشيخوخة. ومع ذلك، الدراسات على مستوى العضوية فحص البروتينات متعددة الثدييات إف عبر الأنسجة المختلفة التي تمر بالإجهاد غير موجودة.

إفس هي هياكل ديناميكية للغاية التي تتكيف مع تلبية مطالب الخلوية. كيراتينس، على سبيل المثال، الخضوع للدراجات البيولوجية مستقلة بين ذوبان (غير خيطي) وغير قابلة للذوبان (الخيطية) بروتين تجمع 13 . في ظل الظروف الفسيولوجية العادية حوالي 5٪ يمكن استخراج مجموع K8 / K18 تجمع في المنظفات خالية من العازلة، بالمقارنة مع ما يقرب من 20٪ التي يمكن أن تذوب في المنظفات غير الأيونية نونيديت P-40، وهو قابل للمقارنة كيميائيا كيميائيا ل تريتون- X100 14 ، 15 . خلال الانقسام هناك زيادة ملحوظة في الذوبان من نوع بسيط K8 الظهارية و K18 14 ، وهو أقل وضوحا في كيراتينس البشرة ولكن أكثر وضوحا في فيمنتين والنوع الثالث من البروتينات إيف الثالث 15 ، 16 . يتم تنظيم خصائص الذوبان من البروتينات إف بإحكام من قبل الفسفرة، وهو مفتاح بعد متعدية تعديل (بتم) لإعادة خيوط الذوبان والذوبان 17 ، 18 ، 19 ، 20 . وتخضع معظم المؤسسات المالية الدولية لتنظيم واسع من قبل عدد من بتمس في المواقع المحفوظة، مما أدى إلى تغييرات وظيفية 17 .

والغرض من هذا الأسلوب هو إدخال المحققين الذين هم جديدون إلى حقل إف إلى الاستخراج البيوكيميائية والأساليب التحليلية لدراسة البروتينات إف عبر أنسجة الماوس متعددة. محددالحليف، ونحن نركز على عزل البروتينات إف باستخدام طريقة استخراج الملح عالية وتقييم التغيرات في بتمس عن طريق الكتلة الطيفية والأجسام المضادة التي تستهدف بتم. هذه الأساليب بناء على الإجراءات المنشورة سابقا 21 ولكن تشمل تعديلات لاستخراج أنواع مختلفة من البروتين إف للكشف عن آلية مشتركة للتنظيم عبر الأسرة إف. على سبيل المثال، K8 أسيتيلاتيون في بقايا يسين معين ينظم تنظيم خيوط، في حين أن هيبيراسيتيلاتيون يعزز K8 عدم القابلية للذوبان وتشكيل الكلي 22 . وقد كشفت الدراسات التنميط البروتينات العالمية الأخيرة بالإضافة إلى ذلك أن معظم البروتينات إف محددة الأنسجة هي أيضا تستهدف الاستمالة وأن معظم إف المواقع تقتصر تقتصر على نطاق قضيب المحفوظة للغاية. وهذا يبرز الحاجة إلى أساليب مناسبة للتنميط العالمي للنظام إف. كما نقدم طريقة سريعة لعزل البروتينات إف من أنسجة متعددة باستخدام التجانس الآلي في أوبتيميزينغ ليسينغ مصفوفة. الاستعدادات الناتجة هي مناسبة لتحليل بتم المصب عن طريق مطياف الكتلة وغيرها من الأساليب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على البروتوكول وأداء وفقا للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (إاكوك) في جامعة كارولينا الشمالية.

1 - الأعمال التحضيرية

  1. إعداد تريتون-X العازلة (1٪ تريتون X-100، 5 ملي إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض (إدتا)، طرح حجم في الفوسفات مخزنة المالحة (بس)، ودرجة الحموضة 7.4). لجعل 500 مل: ضجة 5 مل كل من تريتون X-100 و 500 ملي إدتا إلى 490 مل من برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4. مخزن تريتون-X حل العازلة في 4 درجات مئوية.
  2. إعداد عالية الملح العازلة (10 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.6، 140 ملي كلوريد الصوديوم، 1.5 M بوكل، 5 ملي إدتا، 0.5٪ تريتون X-100، طرح حجم في المقطر المزدوج (د) H 2 O). لجعل 500 مل: ضجة 10 مل من 0.5 M تريس هكل (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 14 مل من 5 M كلوريد الصوديوم، 55.9 غرام بوكل، 5 مل من 0.5 M إدتا، و 2.5 مل من تريتون X-100، وضبط حجم إلى 500 مل باستخدام الماء المقطر المزدوج). تخزين محلول العازلة عالية الملح في 4 درجات مئوية.
  3. فقط قبل الاستخدام، تكملة كمية مناسبة من تريتون-X والعازلة الملح عالية ( على سبيل المثال 1 مل لكل عينة الأنسجة 25 ملغ) مع البروتيني أو البروتيني / فوسفاتيز كوكتيل المانع وتجاهل أي المخزن المؤقت غير المستخدمة التي تحتوي على مثبطات.
  4. إعداد 5 ملي إدتا في برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 7.4. لجعل 500 مل: ضجة 5 مل من 0.5 M إدتا إلى 495 مل من برنامج تلفزيوني 1X، ودرجة الحموضة 7.4.
  5. عزل أجهزة الماوس المختلفة (الدماغ والقلب والرئة والكبد والبنكرياس والقولون والأمعاء والكلى والطحال) باستخدام البروتوكولات المعتمدة التي تتوافق مع المبادئ التوجيهية البيطرية والمعايير المؤسسية 23 . يجب أن يستغرق إجراء جمع الأنسجة لا يزيد عن 5 دقائق للحفاظ على الحمض النووي الريبي وسلامة البروتين من الأنسجة الغنية بالبروتياز (على سبيل المثال يجب معالجة البنكرياس أولا).
  6. قطع كمية صغيرة من الأنسجة (~ 5-20 ملغ) ومكان في حل تخزين الحمض النووي الريبي، لاستخراج الحمض النووي الريبي اللاحق، والتوليف [كدنا]، والكمية في الوقت الحقيقي تحليل ير للتعبير الجين إف. وضع رنا أنابيب حل التخزين مع الأنسجة في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها واتبع بروتوكول الشركة المصنعة لمزيد من sتوريج والعزلة الخطوات.
  7. قطع بقية الأنسجة إلى شظايا أصغر (على سبيل المثال 0.5 سم) ومكان في كريوفيال. المفاجئة تجميد وتخزين قارورة في -80 درجة مئوية أو النيتروجين السائل لتخزين على المدى الطويل.

2. إف تحليل التعبير الجيني

  1. استخراج الحمض النووي الريبي من الأنسجة المحفوظة في كاشف حل تخزين الحمض النووي الريبي. استخدام أي طريقة مناسبة / المفضل استخراج الحمض النووي الريبي وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
  2. تحديد تركيز الحمض النووي الريبي واستخدام 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لتوليد [كدنا] باستخدام مجموعة النسخ العكسي مناسبة وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
  3. باستخدام إنشاء [كدنا] والفأرة إذا وضعت الاشعال الجينات الخاصة تصل ردود الفعل قر، بما في ذلك ثلاثة مكررات التقنية من كل عينة، فضلا عن التحكم فارغة وفقا لبروتوكول الشركة الصانعة.
  4. كوانتييفي إف التعبير الجيني كما تغير أضعاف مقارنة ظروف مختلفة ( مثل الشباب مقابل الأنسجة القديمة).

3. Pجبر مجموع الأنسجة المحللات ل إمونوبلوت

  1. التجانس 25 ملغ من الأنسجة في 1 مل من 2X غير تخفيض سدز عينة عازلة. حذف بروموفينول صبغ أزرق من العينة العازلة إذا كان فحص البروتين اللونية هو أن يتم تنفيذها لتحديد تركيز البروتين.
  2. إضافة 5٪ (الخامس / الخامس) من 2-ميركابتويثانول (2-مي) لجعل عينات مخفضة. إلى 200 ميكرولتر من العينات غير خفض، إضافة 10 ميكرولتر من 2-مي.
  3. تحديد تركيز البروتين باستخدام المنظفات والحد من وكيل فحص البروتين متوافق. إذا تم تضمين صبغ بالفعل في العازلة العينة، ويمكن تقدير كمية البروتين بعد تشغيل هلام عبر عدد من التقنيات، بما في ذلك كوماسي مقرها وصمة عار 24 .
  4. دوامة جميع العينات والحرارة في 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  5. أداء النشاف الغربية تحت كل من الحد والحد من الظروف. غشاء التعرض لفترة وجيزة (<1 دقيقة) للكشف عن الأنواع أحادية، وأطول (> 1 دقيقة) للكشف عن المجمعات كتلة الجزيئية العالية كونتينانوغرام إذا البروتينات. إذا رصد التجميع، فحص كامل هلام / غشاء (بما في ذلك قيعان الآبار هلام).
  6. تشغيل هلام متواز وصمة عار مع وصمة عار البروتين كما تحكم تحميل 24 . في نماذج الأمراض أو التجارب إصابة مجموع البروتين وصمة عار ينبغي أن تستخدم التحكم في التحميل، بدلا من إمونوبلوتس للبروتينات "التدبير المنزلي" (على سبيل المثال أكتين، غابد) لأن هذا الأخير يتغير تحت ظروف الإجهاد المختلفة.

4. إعداد منظفات قابلة للذوبان وعالية الملح مقتطفات من الأنسجة الخاصة الأنسجة

  1. إضافة 1 مل من العازلة الباردة تريتون X-100 الجليد في الخالط أنبوب زجاجي ووضعه على الجليد.
  2. إزالة قطعة صغيرة من الأنسجة (~ 25 ملغ) من تخزين النيتروجين السائل ووضع مباشرة في الخالط الزجاج. استخدام بيتيترافلوروثيلين مدقة إلى التجانس (50 السكتات الدماغية) وتجنب صنع فقاعات. الحفاظ على الخالط و ليسيت البرد في جميع الأوقات.
  3. نقل المحللة إلى ميكر 1.5 ملأنبوب أوسنتريفوج على الجليد وأجهزة الطرد المركزي في 20،000 x ج لمدة 10 دقيقة في جهاز للطرد المركزي قبل المبردة (4 درجات مئوية).
  4. جمع جزء طاف في أنبوب منفصل. هذا هو جزء تريتون X للذوبان، والتي يمكن استخدامها ل إمونوبريسيبيتاتيون (الملكية الفكرية) وتحليل تجمع المنظفات القابلة للذوبان من البروتينات إف. لاحظ أن الخطوات 4،1-4،4 قد تتكرر لتحقيق استخراج إف الأنظف من أنسجة المخ.
  5. إضافة 1 مل من العازلة عالية الملح إلى بيليه الأنسجة، ونقل إلى الخالط نظيفة و دونس 100 السكتات الدماغية. نقل جناسة العودة إلى أنبوب ميكروسنتريفوج ووضع أنبوب على شاكر الدورية في الغرفة الباردة لمدة 1 ساعة.
  6. أجهزة الطرد المركزي المتجانسة في 20،000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف.
  7. إضافة 1 مل من الجليد الباردة بس / إدتا العازلة إلى بيليه وتجانس بيليه (20 السكتات الدماغية) في الخالط نظيفة كخطوة تنظيف النهائي *. نقل إلى أنبوب جديد وأجهزة الطرد المركزي في 20،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية للحصول على إف البروتين-مستخلص ملح مرتفع غني (هس).
    * اختياريا، دوامة بدلا من التجانس في هذه الخطوة.
  8. تجاهل طاف وتذوب الكريات في 300 ميكرولتر من العازلة عينة سدز غير خفض التي تم تسخينها مسبقا. تفريق بيليه في البداية بيبتينغ و فورتيكسينغ، ثم تسخين العينات لمدة 5 دقائق في 95 درجة مئوية.
  9. دوامة والماصة حسب الحاجة لضمان يذوب بيليه. قد يستغرق عدة دقائق لحل كامل الكريات.
  10. تخزين جميع العينات في -20 درجة مئوية حتى التحليل.

5. الآلي تحلل الأنسجة إذا إفراز البروتين في التجارب ذات الحجم الكبير

  1. لاستخراج الحمض النووي الريبي، مكان العازلة تحلل (600 ميكرولتر العازلة لكل 25 ملغ من الأنسجة) في أنبوب يحتوي على ليسينغ مصفوفة D (يستخدم كرات السيراميك الصغيرة) والنبض مرتين لمدة 25 ثانية في ليسر الأنسجة. فصل المحللة من المصفوفة بواسطة الطرد المركزي في 20،000 زغ والانتقال إلى الخطوة التالية في العزلة.
  2. لاستخراج البروتين، مكان الحقدعلى X-100 (أو سدز العازلة عينة إذا إعداد المحللة الكلي) في أنبوب ليسينغ مع ليسينغ مصفوفة سس (استخدام واحد حبة الفولاذ المقاوم للصدأ). بعد اختبار المصفوفات المتعددة، تم اختيار هذا لأنه ينتج إف مقتطفات البروتين التي هي في نوعية مماثلة كوسيلة التقليدية دونسينغ. لاحظ أن الطريقة الآلية ليست الأمثل للبنكرياس والطحال، وينبغي استخدام بروتوكول التجانس القياسية لهذه الأنسجة.
  3. للمضي قدما في إعداد استخراج الملح عالية، وإزالة حبة من الفولاذ المقاوم للصدأ من الأنبوب باستخدام المغناطيس، وأجهزة الطرد المركزي أنابيب في 20،000 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  4. تابع الخطوة 4.4 (أعلاه) للبروتوكول اليدوي.
  5. تخزين جميع العينات في -20 درجة مئوية حتى التحليل.

6. إمونو-إثراء من بعد ترانزلاتيونالي تعديل البروتينات إف

  1. إعداد بست عازلة (0.02٪ توين -20 في برنامج تلفزيوني). لجعل 50 مل، إضافة 10 ميكرولتر من توين 20 إلى 50 مل من برنامج تلفزيوني، ودرجة الحموضة 7.4.
  2. إعداد الأجسام المضادة بتمحل (1-10 ميكروغرام من الأجسام المضادة في 200 ميكرولتر من بست). بشكل عام، 3 ميكروغرام من الأجسام المضادة / رد فعل هو شرط انطلاق جيدة التي يمكن زيادة الأمثل إذا لزم الأمر.
  3. لكل رد فعل، قسامة 50 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي في أنبوب ميكروسنتريفوج، مكان على المغناطيس ونضح حل التخزين حبة.
  4. تقريب الخرز إلى الأجسام المضادة مناعي عن طريق إعادة تعليق في حل الأجسام المضادة واحتضان على المدورة (نهاية نهاية نهاية، لضمان خلط كميات صغيرة) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
  5. وضع أنابيب على المغناطيس ونضح حل الأجسام المضادة.
  6. شطف الأجسام المضادة مترافق الأجسام المضادة مرة واحدة في 200 ميكرولتر بست وإزالة غسل العازلة.
  7. إضافة 0.6-1 مل من المحللة الأنسجة إلى الخرز، وتخلط بيبتينغ لطيف واحتضان لمدة 3 ساعات على المدورة في غرفة باردة.
  8. وضع أنابيب على المغناطيس، إزالة المحللة، وغسل الخرز خمس مرات مع 200 ميكرولتر من بست. بعد آخر خطوة الغسيل، وجمع الخرز في 100 _6؛ L من برنامج تلفزيوني (لا توين -20) ونقل إلى أنبوب جديد نظيف. وضع أنبوب على المغناطيس.
  9. نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 100 ميكرولتر من العازلة غير الحد من العينة. إزالة 50 ميكرولتر وإضافة 2-مي (5٪) لجعل خفض العينات. تسخين العينات إلى 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
  10. فصل جزء الملكية الفكرية من الخرز على المغناطيس وجمعه في أنبوب جديد.
  11. تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى التحليل.

7. إعداد إف عينات البروتين لتحليل الطيف الكتلي

  1. جدولة التشاور مع خبير بروتيوميكس قبل الشروع في دراسة منذ هناك وقت كبير والتكلفة التي ينطوي عليها تحليل الطيف الكتلي.
  2. اتخاذ الاحتياطات الخاصة لتجنب التلوث. التعامل مع جميع المواد الهلامية مع قفازات نظيفة واحتضان في حاويات نظيفة، وغسلها فقط باستخدام د 2 O (تجنب الصابون).
  3. تشغيل 20-50 ميكرولتر من عينة الصحة والسلامة والبيئة (من القسمين 4 و 5) على هلام سدز-بادج وفقا للظروف القياسية.
  4. وصمة عار مع وصمة عار البروتين لمدة 1 ساعة. شطف عدة مرات و دي وصمة عار في د 2 O بين عشية وضحاها. يجب أن تكون عصابات البروتين إف مرئية بسهولة بعد إزالة تلطيخ.
  5. وضع هلام بين حماة ورقة من البلاستيك والمسح الضوئي وعلامة العصابات التي سيتم استئصال وإرسالها للتحليل.
  6. استئصال العصابات البروتين إف باستخدام الحلاقة نظيفة جديدة.
  7. وضع العصابات هلام في أنابيب ميكروسنتريفوج نظيفة ونقل إلى مرفق مطيافية الكتلة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وهناك طريقة سريعة جديدة لارتفاع استخراج الملح المستندة إلى البروتينات إف من أنسجة الماوس متعددة باستخدام مصفوفة ليسينغ.

تم تعديل الطريقة التقليدية 25 ، 26 من عزل الجزء الأكبر من جزء بروتين خيوط وسيطة من الأنسجة الظهارية هنا لتشمل 9 أجه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الأساليب التي تمكن توصيف البيوكيميائية للبروتينات إف يمكن أن تكون مفيدة لفهم الظواهر الفيزيولوجية المرضية العديدة في نظم الثدييات، لأن البروتينات إف على حد سواء علامات ومغيرات من الإجهاد الخلوي والأنسجة 29 . ويستند المبدأ الكامن وراء الطريقة الحالية على الإجراءات الأولية التي وضعت في 1970s و 1980s لعزل وفصل وإعادة تكوين البروتينات إف من الخلايا والأنسجة، وعموما توظف حلول الملح منخفضة وعالية ومنظف تريتون-X100 25 ،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد نيه منح نيه R01 DK110355، DK093776 [نتس]، DK102450 [نتس]، و P30 DK034987 [إلى ونك تشابل هيل]. المؤلفين أشكر ديكشيتا رامانارايانان للمساعدة مع قر وتجارب لطخة الغربية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Dynabeads Protein GThermoFisher Scientific10009حبات الترسيب
المناعي PBSThermoFisher Scientific10010049للمخازن المؤقتة مجموعة
Purelink RNA المصغرةThermoFisher Scientific12183018استخراج الحمض النووي الريبي من الأنسجة
مجموعة Purelink DNAseThermoFisher Scientific12185010Aعلى عمود هضم
Dynamag-2ThermoFisher Scientific12321Dللاستخدام مع dynabeads
كاشف البقع الزرقاءThermoFisher Scientific24592وصمة عار هلامية متوافقة مع قياس الطيف الكتلي
بيرس ECL الركيزة النشاف الغربيThermoFisher Scientific32106للاستخدام في اللطخة الغربية
طقم نسخ عكسي عالي السعة (cDNAThermoFisher Scientific4368813للاستخدام في تحليل التعبير الجيني
نظام Proflex 3 × 32 جيدا نظام PCRThermoFisher Scientific4484073PCR
غشاء نقل PVDF   ؛ThermoFisher Scientific88520للبقعة الغربية
Power Up SYBR master mixThermoFisher ScientificA25778لتحليل qPCR
محلول RNAlaterThermoFisher ScientificAM7020لتخزين الأنسجة قبل عزل الحمض النووي
الريبي Novex 4-20٪ Tris GlycineGel ThermoFisher ScientificXP04205BOXجل البروتين الجاهز
المضاد للكيراتين 8 الجسم المضاد (TS1)ThermoFisher ScientificMA514428للكشف عن اللطخة الغربية ل K8
Anti-VimentinThermoFisherScientific MA511883للكشف عن اللطخة الغربية للفيمنتين
Tris Glycine Transfer Buffer (25x)ThermoFisher ScientificLC3675للنقل الرطب للمواد الهلامية البروتينية
2x SDS عينة عازلةThermoFisher ScientificLC2676للتحضير عينات هلام البروتين
Tris Glycine SDS Running Buffer (10x)ThermoFisherScientific LC26755لتشغيل المواد الهلامية البروتينية
حبات Lysing - Matrix DMP Biomedicals116913100حبات التحلل وأنابيب المصفوفة لتعطيل الأنسجة واستخراج الحمض النووي الريبي
حبات Lysing - Matrix SSMP Biomedicals116921100حبات التحلل وأنابيب المصفوفة لتعطيل الأنسجة واستخراج البروتين
الطيف الضوئي NanoDrop LiteThermoFisher ScientificND-LITEقياس البروتين والحمض النووي
Precellys 24 الخالطBertinInstruments EQ03119الخالط الآلي للأنسجة
الحمض النوويمغناطيس ) مقياس

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Eriksson, J. E., et al. Introducing intermediate filaments: from discovery to disease. J Clin Invest. 119 (7), 1763-1771 (2009).
  2. Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. J Biol Chem. 290 (28), 17145-17153 (2015).
  3. Perez-Sala, D., et al. Vimentin filament organization and stress sensing depend on its single cysteine residue and zinc binding. Nat Commun. 6, 7287(2015).
  4. Dialynas, G., et al. Myopathic lamin mutations cause reductive stress and activate the nrf2/keap-1 pathway. PLoS Genet. 11 (5), e1005231(2015).
  5. Hobbs, R. P., et al. Keratin-dependent regulation of Aire and gene expression in skin tumor keratinocytes. Nat Genet. , (2015).
  6. Chung, B. M., Rotty, J. D., Coulombe, P. A. Networking galore: intermediate filaments and cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 600-612 (2013).
  7. Gruenbaum, Y., Aebi, U. Intermediate filaments: a dynamic network that controls cell mechanics. F1000 Prime Rep. 6, (2014).
  8. Omary, M. B. "IF-pathies": a broad spectrum of intermediate filament-associated diseases. J Clin Invest. 119 (7), 1756-1762 (2009).
  9. Omary, M. B., Ku, N. O., Strnad, P., Hanada, S. Toward unraveling the complexity of simple epithelial keratins in human disease. J Clin Invest. 119 (7), 1794-1805 (2009).
  10. Toivola, D. M., Strnad, P., Habtezion, A., Omary, M. B. Intermediate filaments take the heat as stress proteins. Trends Cell Biol. 20 (2), 79-91 (2010).
  11. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging. C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  12. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in. C. elegans. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
  13. Windoffer, R., Beil, M., Magin, T. M., Leube, R. E. Cytoskeleton in motion: the dynamics of keratin intermediate filaments in epithelia. J Cell Biol. 194 (5), 669-678 (2011).
  14. Chou, C. F., Riopel, C. L., Rott, L. S., Omary, M. B. A significant soluble keratin fraction in 'simple' epithelial cells. Lack of an apparent phosphorylation and glycosylation role in keratin solubility. J Cell Sci. 105 ( Pt. 2, 433-444 (1993).
  15. Omary, M. B., Ku, N. O., Liao, J., Price, D. Keratin modifications and solubility properties in epithelial cells and in vitro). Subcell Biochem. 31, 105-140 (1998).
  16. Lowthert, L. A., Ku, N. O., Liao, J., Coulombe, P. A., Omary, M. B. Empigen BB: a useful detergent for solubilization and biochemical analysis of keratins. Biochem Biophys Res Commun. 206 (1), 370-379 (1995).
  17. Snider, N. T., Omary, M. B. Post-translational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 163-177 (2014).
  18. Snider, N. T., Weerasinghe, S. V., Iniguez-Lluhi, J. A., Herrmann, H., Omary, M. B. Keratin hypersumoylation alters filament dynamics and is a marker for human liver disease and keratin mutation. J Biol Chem. 286 (3), 2273-2284 (2011).
  19. Eriksson, J. E., et al. Specific in vivo phosphorylation sites determine the assembly dynamics of vimentin intermediate filaments. J Cell Sci. 117 (Pt. 6, 919-932 (2004).
  20. Sahlgren, C. M., et al. Mitotic reorganization of the intermediate filament protein nestin involves phosphorylation by cdc2 kinase). J Biol Chem. 276 (19), 16456-16463 (2001).
  21. Snider, N. T., Omary, M. B. Assays for Posttranslational Modifications of Intermediate Filament Proteins. Methods Enzymol. 568, 113-138 (2016).
  22. Snider, N. T., et al. Glucose and SIRT2 reciprocally mediate the regulation of keratin 8 by lysine acetylation. J Cell Biol. 200 (3), 241-247 (2013).
  23. Danneman, P., Suckow, M. A., Brayton, C., Suckow, M. A. The laboratory mouse. , 2nd edn, CRC Press. (2013).
  24. Weiss, W., Weiland, F., Gorg, A. Protein detection and quantitation technologies for gel-based proteome analysis. Methods Mol Biol. 564, 59-82 (2009).
  25. Achtstaetter, T., Hatzfeld, M., Quinlan, R. A., Parmelee, D. C., Franke, W. W. Separation of cytokeratin polypeptides by gel electrophoretic and chromatographic techniques and their identification by immunoblotting. Methods Enzymol. 134, 355-371 (1986).
  26. Ku, N. O., et al. Studying simple epithelial keratins in cells and tissues. Methods Cell Biol. 78, 489-517 (2004).
  27. Julien, J. P., Mushynski, W. E. Multiple phosphorylation sites in mammalian neurofilament polypeptides. J Biol Chem. 257 (17), 10467-10470 (1982).
  28. Hubbard, B. D., Lazarides, E. Copurification of actin and desmin from chicken smooth muscle and their copolymerization in vitro to intermediate filaments. J Cell Biol. 80 (1), 166-182 (1979).
  29. Ku, N. O., Strnad, P., Bantel, H., Omary, M. B. Keratins: Biomarkers and modulators of apoptotic and necrotic cell death in the liver. Hepatology. 64 (3), 966-976 (2016).
  30. Huiatt, T. W., Robson, R. M., Arakawa, N., Stromer, M. H. Desmin from avian smooth muscle. Purification and partial characterization. J Biol Chem. 255 (14), 6981-6989 (1980).
  31. Zackroff, R. V., Goldman, R. D. In vitro assembly of intermediate filaments from baby hamster kidney (BHK-21) cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (12), 6226-6230 (1979).
  32. Franke, W. W., Schmid, E., Osborn, M., Weber, K. The intermediate-sized filaments in rat kangaroo PtK2 cells. II. Structure and composition of isolated filaments. Cytobiologie. 17 (2), 392-411 (1978).
  33. Small, J. V., Sobieszek, A. Studies on the function and composition of the 10-NM(100-A) filaments of vertebrate smooth muscle. J Cell Sci. 23, 243-268 (1977).
  34. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  35. Steinert, P. M., Idler, W. W., Zimmerman, S. B. Self-assembly of bovine epidermal keratin filaments in vitro. J Mol Biol. 108 (3), 547-567 (1976).
  36. Goldman, R. D., Cleland, M. M., Murthy, S. N., Mahammad, S., Kuczmarski, E. R. Inroads into the structure and function of intermediate filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 14-23 (2012).
  37. Oshima, R. G. Intermediate filaments: a historical perspective. Exp Cell Res. 313 (10), 1981-1994 (2007).
  38. Mashukova, A., Forteza, R., Salas, P. J. Functional Analysis of Keratin-Associated Proteins in Intestinal Epithelia: Heat-Shock Protein Chaperoning and Kinase Rescue. Methods Enzymol. 569, 139-154 (2016).
  39. Schinzel, R., Dillin, A. Endocrine aspects of organelle stress-cell non-autonomous signaling of mitochondria and the ER. Curr Opin Cell Biol. 33, 102-110 (2015).
  40. Taylor, R. C., Berendzen, K. M., Dillin, A. Systemic stress signalling: understanding the cell non-autonomous control of proteostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 211-217 (2014).
  41. Lemieux, G. A., et al. Kynurenic acid is a nutritional cue that enables behavioral plasticity. Cell. 160 (1-2), 119-131 (2015).
  42. Oosten-Hawle, P., Porter, R. S., Morimoto, R. I. Regulation of organismal proteostasis by transcellular chaperone signaling. Cell. 153 (6), 1366-1378 (2013).
  43. Ulgherait, M., Rana, A., Rera, M., Graniel, J., Walker, D. W. AMPK modulates tissue and organismal aging in a non-cell-autonomous manner. Cell Rep. 8 (6), 1767-1780 (2014).
  44. Aynardi, M. W., Steinert, P. M., Goldman, R. D. Human epithelial cell intermediate filaments: isolation, purification, and characterization. J Cell Biol. 98 (4), 1407-1421 (1984).
  45. Shea, J. M., et al. Purification of desmin from adult mammalian skeletal muscle. Biochem J. 195 (2), 345-356 (1981).
  46. Liao, J., Lowthert, L. A., Ghori, N., Omary, M. B. The 70-kDa heat shock proteins associate with glandular intermediate filaments in an ATP-dependent manner. J Biol Chem. 270 (2), 915-922 (1995).
  47. Liao, J., Omary, M. B. 14-3-3 proteins associate with phosphorylated simple epithelial keratins during cell cycle progression and act as a solubility cofactor. J Cell Biol. 133 (2), 345-357 (1996).
  48. Ku, N. O., Fu, H., Omary, M. B. Raf-1 activation disrupts its binding to keratins during cell stress. J Cell Biol. 166 (4), 479-485 (2004).
  49. Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 581-595 (2016).
  50. Agnetti, G., Lindsey, M. L., Foster, D. B. Manual of cardiovascular proteomics. , Springer. (2016).
  51. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
  52. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Rep. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  53. Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24 (5), 535-542 (2013).
  54. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (6), 427-439 (2010).
  55. Creixell, P., Linding, R. Cells, shared memory and breaking the PTM code. Mol Syst Biol. 8, 598(2012).
  56. Minguez, P., et al. Deciphering a global network of functionally associated post-translational modifications. Mol Syst Biol. 8, (2012).
  57. Snider, N. T., Park, H., Omary, M. B. A conserved rod domain phosphotyrosine that is targeted by the phosphatase PTP1B promotes keratin 8 protein insolubility and filament organization. J Biol Chem. 288 (43), 31329-31337 (2013).
  58. Gorospe, J. R., et al. Molecular findings in symptomatic and pre-symptomatic Alexander disease patients. Neurology. 58 (10), 1494-1500 (2002).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Intermediate Filament ProteinsPost translational ModificationsMouse Tissue IsolationAging associated ChangesDetergent Soluble FractionHigh Salt ExtractionAutomated Tissue HomogenizationMass Spectrometry ProfilingImmunoprecipitation AssayWestern Blot Analysis

مقالات ذات صلة