يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

غشاء الدماغ تجزئة: أ

10K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55661

⸱

مايو 12, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Unitat de Farmacologia, Departament Patologia i Terapèutica Experimental, Facultat de Medicina, IDIBELL, Universitat de Barcelona, L'Hospitalet de Llobregat, 2Institut de Neurociències, Universitat de Barcelona, 3Center for Neurosciences of Coimbra, Institute of Biochemistry, Faculty of Medicine, University of Coimbra

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نقدم بروتوكول غشاء الدماغ الدماغ الذي يمثل إجراء قوي لعزل البروتينات التي تنتمي إلى مقصورات متشابك مختلفة.

الملخص

تقييم تكوين البروتين متشابك وظيفة تشكل تحديا هاما في علم الأعصاب. ومع ذلك، فإنه ليس من السهل لتقييم العصبي الذي يحدث داخل المشابك لأنه ينظم للغاية من التفاعلات البروتين البروتين الحيوي والأحداث الفسفرة. وبالتالي، عندما يتم استخدام أي طريقة لدراسة انتقال متشابك، والهدف الرئيسي هو الحفاظ على هذه التعديلات الفسيولوجية عابرة. هنا، نقدم بروتوكول غشاء الدماغ الدماغ الذي يمثل إجراء قوي لعزل البروتينات التي تنتمي إلى مقصورات متشابك مختلفة. وبعبارة أخرى، يصف البروتوكول منهجية الكيمياء الحيوية لتنفيذ تخصيب البروتين من المشابك قبل المشبكي، بعد المشبكي، ومقصورات إكستراسينابتيك. أولا، يتم الحصول على سينابتوسوميس، أو محطات متشابك، من الخلايا العصبية التي تحتوي على جميع المقصورات متشابك عن طريق التدرج السكروز متقطع. من الجدير بالذكر، ونوعية هذا الإعداد الغشاء سنابتيك الأولي هو جritical. وفي وقت لاحق، يتم تحقيق العزلة من المقصورات سوبسينابتيك مختلفة مع ذوبان الضوء باستخدام المنظفات معتدلة في ظروف درجة الحموضة التفاضلية. هذا يسمح للفصل بواسطة التدرج و إيسوبيكنيك الطرد المركزي. وأخيرا، يتم التحقق من صحة تخصيب البروتين في المقصورات سوبسينابتيك مختلفة ( أي ما قبل ، وبعد و إكستراسينابتيك الكسور الغشاء) عن طريق تحليل إمونوبلوت باستخدام علامات البروتين متشابك تتميز جيدا ( أي سناب -25، بسد-95، و سينابتوبهيسين، على التوالي)، وبالتالي تمكين تقييم مباشر للتوزيع متشابك من أي بروتين الخلايا العصبية معينة.

المقدمة

ويعتمد انتقال متشابك على السلامة الجسدية للالمشبك، وهو المفهوم الذي كان من المتوخى في وقت مبكر من عام 1897 من قبل فوستر و شيرينغتون 1 . وبالتالي، فهم توزيع المكونات العصبية الرئيسية (على سبيل المثال، القنوات الأيونية، ومستقبلات، وما إلى ذلك ) ضروري لتوضيح وظيفة متشابك، سواء في الظروف الطبيعية والمرضية. وقد ساهم المجهر الإلكتروني (إم) بشكل كبير في فكرة التركيبية الحالية للنماذج العصبية المركزية الجهاز العصبي المركزي (نس). في مثل هذه الطريقة، وقد حددت إم بدقة الاختلافات بين كثافة ما قبل وبعد المشبكي، والتي يتم فصلها عن طريق شق من مسافة موحدة بدلا (~ 25 نانومتر) 2 . ومن المثير للاهتمام، فإن الجهاز بعد المشبكي يظهر سماكة مستمرة نسبيا، والإلكترون الكثيفة تحت غشاء البلازما، ما يسمى كثافة بوستسينابتيك، أو بسد 2 . على العكس من ذلك، في جهاز بريسينابتيك، نوتيسابل يتم ترتيب شبكة سيتوماتريكس متقطع فقط تحت غشاء البلازما، وهو أمر ضروري لمحاذاة والالتحام من الحويصلات متشابك لغشاء البلازما منطقة نشطة 3 . وبالتالي، إم يشكل النهج التجريبي الذهبي لمسح توزيع البروتينات ضمن مشابك سنابسس المحفوظة هيكليا. ومع ذلك، فإن المعلومات التي تقدمها ميكروغرافس الإلكترون هو ثابت. في الواقع، وتراكم الأدلة تبين أن في المشابك العصبية الحيوية ديناميكية للغاية، وبالتالي تشهد تغييرات هيكلية دراماتيكية على انتقال متشابك المستدام. وبالإضافة إلى ذلك، فإن التشكل وتكوين نقاط الاشتباك العصبي يمكن أن تتغير في مختلف مناطق الجهاز العصبي المركزي وعلى التنمية، والنضج، والشيخوخة، وتطوير الظروف العصبية. عموما، بروتوكول يركز على عزل البروتينات التي تنتمي إلى مقصورات متشابك مختلفة في الظروف الفسيولوجية يمثل أداة قيمة لدراسة أكثر شمولا من عمل متشابك.

لاس = "jove_content"> هنا، نحن تصف هذا النوع من النهج التجريبي التكميلي، والذي يسمح للإثراء البيوكيميائي التحضيري للمقصورات غشاء متشابك مختلفة، وهي مجالات غشاء خارج، قبل و بعد المشبكي. هذه الطريقة غشاء تجزئة، وصفها أولا فيليبس وآخرون . (2001) 4 ، على التحول الحموضة الذي يضعف التفاعلات اللاصقة التي تحدث داخل الجهاز قبل وبعد المشبكي. أولا، باستخدام المنظفات معتدلة في الرقم الهيدروجيني 6.0، فمن الممكن تمييز مفترق الملتصقة التي تحمل الجهاز قبل وبعد المشبكي والتي يتم الحفاظ عليها من المجال غشاء إكستراسينابتيك، الذي هو سولوبيليزد، وبالتالي يمكن استخراجها من الاتصالات متشابك. في وقت لاحق، ورفع الرقم الهيدروجيني من 6.0 إلى 8.0 في وجود المنظفات معتدل يضعف قوة تقاطع الملتصقة التي تحافظ على منطقة نشطة قبل المشبكية ملزمة بشدة إلى كثافة ما بعد المشبكي. وبالتالي، فإن حجرة بريسينابتيك هو ذلكلوبيليزد ويمكن فصلها عن كثافة ما بعد المشبكي، والتي يتم الحفاظ عليها في الغالب لأن تركيز المنظفات المستخدمة لا يعزز لها الانحلال 4 . ومن المثير للاهتمام، وكفاءة تجزئة، في نهاية المطاف أعلى من 90٪، ويمكن التأكد من علامات مختلفة سوبسينابتيك: ط ) سينابتوسومال المرتبطة البروتين 25 (سناب -25)، من منطقة نشطة قبل المشبكي. إي) سينابتوفيسين، من جزء إكستراسينابتيك ( أي خارج المنطقة النشطة بما في ذلك ميكروسوميس). و 3 ) بروتين كثافة بعد المشبكي 95 (بسد-95)، من كثافة ما بعد المشبكي. والجدير بالذكر أن هذا الأسلوب تجزئة غشاء الدماغ قد استخدمت بنجاح. وفقا لذلك، كان من الممكن تحديد بدقة توطين المشبكي لمستقبلات مختلفة، مثل مستقبلات ألفا أمينو 3-هيدروكسي -5-ميثيل -4-إيزوكسازوليبروبيونيك (أمبا) 5 ، مستقبلات أدينوسين A 1 (A 1 R) 6 ،أدينوسين مستقبلات 2A (A 2A R) 7 ، أدينوسين ثلاثي الفوسفات (أتب) P2 مستقبلات 8 ، النيكوتينيك أسيتيل كوليني مستقبلات 9 ، ومستقبلات باركنسون المرتبطة GPR37 10 . ومع ذلك، فإن عددا من القيود قد تعيق التقييم الصحيح للتوزيع متشابك لبروتين الخلايا العصبية معينة. وهكذا، في هذا الإجراء، ونحن ليس فقط وصف كامل للبروتوكول بأكمله، ولكن نحن أيضا تسليط الضوء على بعض النقاط الحرجة التي ينبغي النظر فيها، مثل كمية كبيرة نوعا ما من الأنسجة اللازمة، وانخفاض العائد البروتين، والشرط الإلزامي للتحقق من كفاءة كل فصل قبل تنفيذ التجربة المحددة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وتمت الموافقة على جميع الإجراءات التجريبية على الحيوانات من قبل لجنة جامعة برشلونة للاستخدام الحيواني والرعاية (سييا)، امتثالا للمبادئ التوجيهية الموصوفة في دليل رعاية الحيوانات المختبرية واستخدامها 11 وبعد الجماعة الأوروبية، القانون 86/609 / كس، فيلاسا، والتوجيهات. وهكذا، يتم وضع الفئران في أقفاص قياسية، مع ليبيتوم الوصول إلى الغذاء والماء، ويتم الحفاظ عليها تحت ظروف قياسية تسيطر عليها (12 ساعة الظلام / دورة الضوء بدءا من 7:30 صباحا، 22 درجة مئوية درجة الحرارة، و 66٪ الرطوبة).

1. الحصول على الفأر الدماغ سينابتوسوميس باستخدام متدرج السكروز التدرج

ملاحظة: تم الإبلاغ عن هذه الطريقة سابقا 10 .

  1. إعداد العازلة العزلة الطازجة (يب)، ودرجة الحموضة 7.4. 2 M السكروز. 1 M السكروز / 0.1 ملي كاكل 2 ؛ و 0.1 ملي كاكل 2 (انظر الجدول 1 ). هدئ الحلول على الجليد.
  2. ساكريفيس خمسة الفئران عن طريق خلع عنق الرحم. قطع رأس وإزالة بسرعة الدماغ من كل حيوان. تشريح منطقة الدماغ من الفائدة (أي الحصين، 0.25-0.35 غرام من الأنسجة الطازجة) ووضعه في 5 مل بوتر-إلفهجيم أنبوب زجاجي على الجليد مع 1 مل من يب.
  3. تجانس الأنسجة باستخدام النمام المجانسة (10 السكتات الدماغية في 700-900 دوران في الدقيقة)، ويفضل في حمام الجليد لمنع عينة الاحتباس الحراري.
  4. وضع الأنسجة المتجانسة (1 مل) في أنبوب 15 مل تحتوي على 6 مل من 2 M السكروز و 2.5 مل من 0.1 ملي كاكل 2 في 4 درجات مئوية. مزيج ببطء عن طريق قلب الأنبوب.
    ملاحظة: إضافة الكالسيوم ضروري للحفاظ على التفاعلات اللاصقة بين العضيات وبالتالي للحفاظ على بنية "كثافة" مختلفة.
  5. وضع الحل في أنبوب الطرد المركزي 12 مل وإضافة ببطء 2.5 مل من 1 M السكروز / 0.1 ملي كاكل 2 على رأس كل أنبوب لتشكيل التدرج السكروز.
    ملاحظة: تسمية الموقف سf واجهة التدرج على أنبوب الطرد المركزي باستخدام علامة دائمة.
  6. وزن وتوازن أنابيب الطرد المركزي مع الحل يب داخل الدعم الصلب المقابلة ومع أغلق إغلاقها.
  7. أجهزة الطرد المركزي أنابيب لمدة 3 ساعات في 100،000 x ز و 4 درجة مئوية باستخدام يتأرجح دلو الدوار الطرد المركزي. ملء كامل الدوار مع جميع الصلب يدعم (حتى فارغة، إذا لزم الأمر).
  8. تجاهل الطبقة العليا التي تحتوي على الميلين. مع ماصة باستور، وجمع حلقة بيضاء بين 1.25-M و 1-M البيني السكروز المقابلة لجزء سينابتوسوم.
  9. تمييع سينابتوسوميس مع 9X حجمها باستخدام يب في أنبوب الطرد المركزي.
  10. وزن وتوازن أنابيب الطرد المركزي مع الحل يب داخل الدعم الصلب المقابلة ومع أغلق إغلاقها.
  11. أجهزة الطرد المركزي أنابيب لمدة 30 دقيقة في 15،000 × ز و 4 درجات مئوية باستخدام يتأرجح دلو الدوار الطرد المركزي.
  12. تجاهل طاف و ريسوسبيند ثه بيليه مع 1.1 مل من الحل يب. جمع 100 ميكرولتر من هذا الحل سينابتوسومال وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 11،000 x ز و 4 درجة مئوية.
  13. ريسوسبيند بيليه سينابتوسومال في 5٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم (سدز) وتخزين هذه العينة في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: هذه العينة سوف تتوافق مع إجمالي جزء سينابتوسوم لمزيد من التحليل لطخة غربية. يمكن أن يتم تجميد جزء سينابتوسومال المتبقية (~ 1 مل) إما في -20 درجة مئوية حتى استخدام أو معالجتها لتجزئة سوبسينابتيك لاحق. متشابك سينابتوسوم أو تنقيبات النقاء تمثل ما بين 1 و 2٪ من إجمالي حجم الحصين 12 .

2. قبل، وبعد- إكستراسينابتيك العزلة

  1. إعداد 2X العازلة الانحلال الطازجة، ودرجة الحموضة 6.0. 1X العازلة الانحلال، ودرجة الحموضة 6.0. العازلة الانحلال، ودرجة الحموضة 8.0. و 0.1 ملي كاكل 2 (انظر الجدول 1 ). هدئ الحلول على الجليد.
    ملاحظة: يجب أن يكون الرقم الهيدروجيني من هذه الحلول أكوراتيلy تعديل لتحقيق تجزئة سوبسينابتيك جيدة.
  2. تمييع ببطء 1-مل معلق جزء سينابتوسومال (انظر الخطوة 1.12) مع 5 مل من 0.1 ملي كاكل 2 .
  3. إضافة نفس الحجم (5 مل) من الجليد الباردة 2X العازلة الانحلال، ودرجة الحموضة 6.0، واحتضان لمدة 50 دقيقة على الجليد تحت التحريض عالية في كوب على الجليد.
    ملاحظة: في حين أن 1٪ من تريتون X-100 عند الرقم الهيدروجيني 6.0 يذوب جميع البروتينات غشاء البلازما، فإنه يحافظ على البروتينات داخل الاتصالات متشابك أو تقاطعات ( أي الهياكل ما قبل والمشبكي) 4 .
  4. وضع الحل في أنبوب الطرد المركزي. تزن وتتوازن الأنابيب مع أحجام معادلة من 0.1 ملي كاكل 2 و 2 X حل العازلة الذوبان، ودرجة الحموضة 6.0، في إطار الدعم الصلب المقابلة ومع اغطية إغلاقها.
  5. الطرد المركزي أنابيب لمدة 30 دقيقة في 40،000 × ز و 4 درجات مئوية باستخدام يتأرجح دلو الدوار الطرد المركزي. يمثل طاف الناتجة الجزء إكستراسينابتيك،و بيليه يتوافق مع تقاطعات متشابك ( أي، قبل و بعد الكسور المشابك).
  6. تركيز طاف تحتوي على جزء إكستراسينابتيك إلى حجم 200 ميكرولتر النهائي باستخدام أنبوب تصفية 15 مل 10K الطرد المركزي في 4000 x ج و 4 ºC.
  7. يعجل الناتجة ركز خارج المشعاع المركزة (200 ميكرولتر) مع 5 وحدات التخزين (1 مل) من قبل المبردة (-20 درجة مئوية) الأسيتون بين عشية وضحاها في -20 درجة مئوية.
  8. في اليوم التالي، الطرد المركزي وجزء إكستراسينابتيك لمدة 30 دقيقة في 18،000 x ز و -15 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي، تجاهل الأسيتون طاف وتجفيف بيليه لإزالة أي أثر من الأسيتون.
  9. وأخيرا، ريسوسبيند بيليه تحتوي على البروتينات إكستراسينابتيك مع 200 ميكرولتر من 5٪ سدز. يصوتن بيليه، إذا لزم الأمر.
  10. دون تعطيل ذلك، بعناية غسل بيليه تحتوي على الكسور قبل والمشبكي مع 2 مل من 1X العازلة الانحلال، ودرجة الحموضة 6.0. تجاهل المخزن المؤقت.
  11. إعادة تعليقبيليه مع 10 مل من 1X العازلة الانحلال، ودرجة الحموضة 8.0، وذلك باستخدام ماصة باستور الزجاج.
    ملاحظة: في حين 1٪ من تريتون X-100 في الرقم الهيدروجيني 8.0 سولوبيليزس التخصص بريسينابتيك، فإنه يحافظ على كثافة بعد المشبكي غير قابلة للذوبان 4 .
  12. احتضان تعليق لمدة 50 دقيقة على الجليد تحت التحريض عالية في كوب على الجليد.
  13. وضع الحل في أنبوب الطرد المركزي. وزن وتوازن الأنابيب مع حل العازلة حل 1X، ودرجة الحموضة 8.0، في إطار الدعم الصلب المقابلة ومع اغطية إغلاقها.
  14. الطرد المركزي أنابيب لمدة 30 دقيقة في 40،000 × ز و 4 درجات مئوية باستخدام يتأرجح دلو الدوار الطرد المركزي. وطاف الناتجة يتوافق مع جزء بريسينابتيك وبيليه إلى جزء بوستسينابتيك.
  15. معالجة طاف تحتوي على جزء بريسينابتيك، كما هو موضح في الخطوات 2.6-2.9.
  16. ريسوسبيند الكرية التي تحتوي على جزء بوستسينابتيك مع 200 ميكرولتر من 5٪ سدز. يصوتن بيليه، طf المطلوبة.

3. تحليل العينات بواسطة إمونوبلوت للتحقق من صحة تجزئة الغشاء

  1. تحديد كمية البروتين في كل جزء ( أي، الكلي، خارج، قبل وبعد الكسور متشابك) باستخدام فحص البروتين حمض بيشينشونينيك.
  2. خذ 20 ميكروغرام من البروتين من كل جزء وتمييع إلى حجم النهائي من 50 ميكرولتر في SDS- بولي أكريلاميد هلام الكهربائي (سدز-بادج) العازلة عينة. يغلي لمدة 5 دقائق في 100 درجة مئوية.
  3. فصل البروتينات بواسطة سدز-بادج الكهربائي 10٪، مع 4٪ تركيز جل تحت ظروف الحد. إليكتروفوريز في الجهد المستمر من 80 V حتى يدخل صبغ الهلام السفلي ومن ثم زيادة الجهد إلى 120 V.
  4. نقل البروتينات إلى غشاء بفدف ومنع مع يب حجب الحل لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة تحت الهز المستمر.
  5. احتضان غشاء بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية مع الأجسام المضادة الأولية المشار إليها ( أي مكافحة سناب -25،ومكافحة بسد-95، ومكافحة سينابتوفيسين، أو مكافحة GPR37) المخفف في يب حجب الحل تحت اهتزاز المستمر.
  6. غسل الغشاء ثلاث مرات (10 دقيقة لكل منهما) مع يب غسل الحل للقضاء على الأجسام المضادة الأولية غير منضم.
  7. احتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المشار إليها لمدة 90 دقيقة في ظروف مظلمة في درجة حرارة الغرفة تحت الهز المستمر.
  8. غسل الغشاء ثلاث مرات (10 دقيقة لكل منهما) مع يب غسل الحل للقضاء على الأجسام المضادة الثانوية غير منضم.
  9. احتضان الغشاء مع الركيزة تشيميلومينسنت (إعداد مزيج تحت الظروف المظلمة وبعد نسبة 1: 1 من الحل A و B المقدمة من قبل الشركة المصنعة).
  10. تحليل الغشاء في جهاز الكشف تشيميلومينسنت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد استخدمت المنهجية وصفها إلى حد كبير لتحليل سوبسينابتيك من البروتينات العصبية بشكل عام وللعزلة والتوصيف البيوكيميائية لمستقبلات متشابك 5 ، 6 ، 7 ، 8 ، 9 على وجه الخصوص. ومن المثير للاهتمام، والنتيجة ممثل المعروضة هنا تظهر فائدة هذا الإجراء التجريبي لتحليل توزيع الحصين تحت المشبكي من ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يشكل البروتوكول المقدم هنا أداة كيميائية حيوية قوية لدراسة التوزيع تحت المشبكي لبروتينات معينة داخل أي منطقة دماغية. ومع ذلك ، هناك بعض العيوب المتأصلة في هذه التقنية التي تستحق تسليط الضوء عليها هنا. على سبيل المثال ، أحد القيود الرئيسية هو الكمية الكبيرة نسبيا من الأنسجة اللازمة لتنقية كمية معقولة من البروتين من أجل إجراء تحليل اللطخة المناعية لجميع الكسور تحت المشبكي. قد تكون هذه المشكلة مرتبطة بحقيقة أن نقاط الاشتباك العصبي (أي الجسيمات العصبية) تمثل 1-2٪ فقط من إجمالي حجم الحصين12. ف...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وقد حظي هذا العمل بدعم من وزارة الاقتصاد والتجارة في كارلوس الثالث (SAF2014-55700-P، و PCIN- 2013-019-C03-03، و PIE14 / 00034)، و المعهد الدولي للثقافة والفنون (أكرا-أكاديميا-2010) )، و أجنتشاب فور إنوفاتي باب ويتنشاب إن تيشنولوجي (سبو-140028) إلى فك أيضا، X. M، ف-D، و فك تنتمي إلى "نيوروفارماكولوغي آند ألم" مجموعة أبحاث معتمدة (جينيراليتات دي كاتالونيا، 2014 سغر 1251) . وأيد العمل أيضا من قبل "برنامج بيسكيسادور فيسيتانت إسبيسيال-سينسيا سيم فرونتيراس" من كابيس (البرازيل) إلى فك

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
السكروزالبنكرياس Quí ميكا SL ، برشلونة ، إسبانيا1،316،211،211
CaCl2< / sub>البنكرياس Quí ميكا SL ، برشلونة ، إسبانيا2،112،211،210
MgCl2< / sub>· ؛ 6H2Oالبنكرياس Qu í ميكا SL ، برشلونة ، إسبانيا1،313،961،210
مجموعة كوكتيل مثبطات البروتياز IIIMillipore ، دارمشتات ، ألمانيا535140
Trizma BaseSigma ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةT1503
Tris-HClالبنكرياس Qu & iacute ؛ ميكا SL ، برشلونة ، إسبانيا1،236،541،209
Triton X-100Sigma ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةX100
SDSSigma ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةL3771
GlycerolSigma ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةG5516
Bromophenol BluePancreac Qu & iacute ؛ ميكا SL ، برشلونة ، إسبانيا1،311،651،604
DithiothreitolSigma ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةD0632
Tween 20Sigma ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكيةP2287
حليب
الدسم NaClالبنكرياس Qu í. ميكا SL ، برشلونة ، إسبانيا1،216،591،211
KClالبنكرياس Quí. mica SL, Barcelona, Spain1,314,941,210
KH2PO4Merck4873
Na2HPO4Pancreac Quí ميكا SL ، برشلونة ، إسبانيا1،316،781،211
أساسي 20 درجة حموضةCrison ، Alella ، إسبانيا
Polytron VDI 12 الخالط القابل للتكيفVWR ، Radnor ، PA ، الولايات المتحدة الأمريكية.
أنابيب فائقة الوضوح (14 × 89 مم)أنابيب Beckman Coulter ، Hospitalet de Llobregat ، Barcelona344059بالكامل تقريبا عند استخدامها لمنع الانهيار بسبب الطرد المركزي الفائق.
الطرد المركزي Amicon Ultra-15 Ultracel -10KMerck Millipore ، دارمشتات ، ألمانياUFC901008
الطرد المركزي 5430REppendorf ، هامبورغو ، ألمانيا
Optima L-90K Ultra CentrifugeBeckman Coulter ، Hospitalet de Llobregat ، Barcelona
Sonifier 250Branson ، Danbury ، كونيتيكت
Amersham Imager 600GE Healthcare Europe GmbH ، برشلونة ، إسبانيا
زجاج Pasteur Pippetes القابل للتصرف 230 ممVWR ، رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية612-1702
ميزان مضغوط EK-610A & د ، طوكيو ، اليابان
بيرس & تجارة. مجموعة فحص البروتين BCAبيرس التكنولوجيا الحيوية ، روكفورد ، إلينوي ، الولايات المتحدة الأمريكية
SuperSignal west pico chemiluminescent الركيزةThermo Fisher Scientific Inc. ، Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية
GR 200 Precision BalanceA & D ، طوكيو ، اليابان
Anti-GPR37تم إنتاج الأجسام المضادة محلية الصنع المضادة ل GPR37 والتحقق من صحتها في مختبر فرانسيسكو سيرويلا.الأجسام المضادة الأولية المستخدمة بتركيز نهائي قدره 0.250 مو ؛ جم / مل
مضاد ل SNAP-25 ، مضاد ل PSD-95 ، مضاد للسينابتوفيسينAbcam ، كامبريدج ، المملكة المتحدةالأجسام المضادة الأولية المخففة 1: 10،000
الماعز المترافق المضاد للفأر IgGThermo Fisher Scientific ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية.الجسم المضاد الثانوي المخفف 1: 10،000
الماعز المترافق المضاد للأرانب IgGThermo Fisher Scientific ، والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية.الجسم المضاد الثانوي المخفف 1: 30,000
جاف خالي منيجب ملء مرشحات أجهزة HRP HRP

المراجع

  1. Foster, M., Sherrington, C. S. Part III: The Central Nervous System. A Text Book of Physiology. , Macmillan: London. (1897).
  2. Peters, A., Palay, S. L., Webster, H. D. F. The fine structure of the nervous system. , Oxford University Press. New York. (1991).
  3. Harris, K. M., Weinberg, R. J. Ultrastructure of Synapses in the Mammalian Brain. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 4, 005587-005587 (2012).
  4. Phillips, G. R., et al. The presynaptic particle web: ultrastructure, composition, dissolution, and reconstitution. Neuron. 32, 63-77 (2001).
  5. Pinheiro, P. S., et al. Solubilization and immunological identification of presynaptic alpha-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors in the rat hippocampus. Neurosci. Lett. 336, 97-100 (2003).
  6. Rebola, N., Pinheiro, P. C., Oliveira, C. R., Malva, J. O., Cunha, R. A. Subcellular localization of adenosine A(1) receptors in nerve terminals and synapses of the rat hippocampus. Brain Res. 987, 49-58 (2003).
  7. Rebola, N., Canas, P. M., Oliveira, C. R., Cunha, R. A. Different synaptic and subsynaptic localization of adenosine A2A receptors in the hippocampus and striatum of the rat. Neuroscience. 132, 893-903 (2005).
  8. Rodrigues, R. J. Dual Presynaptic Control by ATP of Glutamate Release via Facilitatory P2X1, P2X2/3, and P2X3 and Inhibitory P2Y1, P2Y2, and/or P2Y4 Receptors in the Rat. J. Neurosci. 25, 6286-6295 (2005).
  9. Garção, P., Oliveira, C. R., Cunha, R. A., Agostinho, P. Subsynaptic localization of nicotinic acetylcholine receptor subunits: a comparative study in the mouse and rat striatum. Neurosci. Lett. 566, 106-110 (2014).
  10. Lopes, J. P., et al. The role of parkinson's disease-associated receptor GPR37 in the hippocampus: functional interplay with the adenosinergic system. J. Neurochem. 134, 135-146 (2015).
  11. Clark, J. D., Gebhart, G. F., Gonder, J. C., Keeling, M. E., Kohn, D. F. Special Report: The 1996 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. ILAR J. 38, 41-48 (1997).
  12. Rusakov, D. A., Harrison, E., Stewart, M. G. Synapses in hippocampus occupy only 1-2% of cell membranes and are spaced less than half-micron apart: a quantitative ultrastructural analysis with discussion of physiological implications. Neuropharmacology. 37, 513-521 (1998).
  13. Zeng, Z., Su, K., Kyaw, H., Li, Y. A novel endothelin receptor type-B-like gene enriched in the brain. Biochem. Biophys. Res. Commun. 233, 559-567 (1997).
  14. Bodenmuller, H., Schilling, E., Zachmann, B., Schaller, H. C. The neuropeptide head activator loses its biological acitivity by dimerization. EMBO J. 5, 1825-1829 (1986).
  15. Rezgaoui, M., et al. The neuropeptide head activator is a high-affinity ligand for the orphan G-protein-coupled receptor GPR37. J. Cell Sci. 119, 542-549 (2006).
  16. Gandìa, J., Fernández-Dueñas, V., et al. The Parkinson's disease-associated GPR37 receptor-mediated cytotoxicity is controlled by its intracellular cysteine-rich domain. J. Neurochem. 125, 362-372 (2013).
  17. Meyer, R. C., Giddens, M. M., Schaefer, S. A., Hall, R. A. GPR37 and GPR37L1 are receptors for the neuroprotective and glioprotective factors prosaptide and prosaposin. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110, 9529-9534 (2013).
  18. Takahashi, R., Imai, Y. Pael receptor, endoplasmic reticulum stress, and Parkinson's disease. J. Neurol. 250, 9(2003).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

المقاصير التشابكيةعزل الجسيمات التشابكيةالطرد المركزي بتدرج السكروزتحليل اللطخة المناعيةإثراء البروتينتشريح الحصينالمؤشرات التشابكيةالإذابة التفاضلية للأس الهيدروجيني
غشاء الدماغ تجزئة: أ
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.