مقالة منهجية

تحليل ج- كيت يجند المروج باستخدام الكروماتين مناعي

DOI:

10.3791/55689

⸱

يونيو 27, 2017

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التفاعلات البروتين الحمض النووي ضرورية لعمليات بيولوجية متعددة. خلال تقييم الوظائف الخلوية، وتحليل التفاعلات الحمض النووي البروتين لا غنى عنه لفهم تنظيم الجينات. الكروماتين مناعي (رقاقة) هو أداة قوية لتحليل هذه التفاعلات في الجسم الحي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العمليات الخلوية متعددة، بما في ذلك تكرار الحمض النووي وإصلاح، وإعادة التركيب الحمض النووي، والتعبير الجيني، تتطلب التفاعلات بين البروتينات والحمض النووي. لذلك، الحمض النووي البروتين التفاعلات تنظيم وظائف فسيولوجية متعددة، الفيزيولوجية المرضية، والبيولوجية، مثل تمايز الخلايا، تكاثر الخلايا، ومراقبة دورة الخلية، واستقرار الكروموسوم، وتنظيم الجينات الوراثية، وتحول الخلايا. في خلايا حقيقيات النواة، يتفاعل الحمض النووي مع بروتينات هيستون و نونهيستون ويكثف إلى لونين. العديد من الأدوات التقنية يمكن استخدامها لتحليل التفاعلات الحمض النووي البروتين، مثل الكهربائي (هلام) التنقل التحول الفحص (إمزا) و دناز I البصمة. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات تحليل التفاعل البروتين الحمض النووي في المختبر ، وليس ضمن السياق الخلوي. الكروماتين مناعي (رقاقة) هو الأسلوب الذي يلتقط البروتينات في مواقع محددة الحمض النووي ملزمة لها، مما يسمح لتحديد التفاعل الحمض النووي البروتينs داخل سياق الكروماتين. ويتم ذلك عن طريق تثبيت التفاعل الحمض النووي البروتين، تليها مناعي من البروتين من الفائدة. في وقت لاحق، والموقع الجيني الذي كان ملزما البروتين إلى يتميز. هنا، نحن تصف ومناقشة رقاقة وإظهار قيمته التحليلية لتحديد عامل النمو تحويل β (تغف-β) التي يسببها ملزمة لعامل النسخ SMAD2 إلى عناصر ملزمة سماد (سب) داخل منطقة المروج من التيروزين- بروتين كيناز كيت (c-كيت) مستقبلات يجند عامل الخلايا الجذعية (سف).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في نواة حقيقيات النوى، يتفاعل الحمض النووي مع بروتينات هيستون والبروتينات غير المهيأة ويتم تكثيفها في لونين. في السياق الفسيولوجي، الفيزيولوجي المرضي، والخلية البيولوجية، يتم التحكم في الوظائف الخلوية مكانيا وبشكل مؤقت بواسطة التعبير الجيني المنسق بالكروماتين. التفاعلات الحمض النووي البروتين لها دور أساسي في تنظيم العمليات الخلوية، مثل تكرار الحمض النووي، وإعادة التركيب، والإصلاح، فضلا عن التعبير البروتين. ولذلك، فإن تحليل التفاعلات الحمض النووي البروتين هو أداة لا غنى عنها في تقييم التعبير الجيني ووظيفة الخلية.

هناك العديد من التقنيات لتقييم التفاعلات الحمض ا....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الحلول

  1. إعداد الحلول التالية جديدة لكل تجربة.
    1. للحصول على حل التثبيت ، وإعداد 37٪ الفورمالديهايد وتخزينه في رت. تمييع في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس) إلى تركيز النهائي من 1.42٪.
      تنبيه: يتم تصنيف الفورمالديهايد على أنها مهيجة، تآكل، الطفرات، مسخ، ومسببة للسرطان. لا يبتلع. لا تتنفس الغاز / الأبخرة / بخار / رذاذ. في حالة عدم كفاية التهوية، ارتدي معدات ملائمة للتنفس. تجنب ملامسة الجلد والعينين. الابتعاد عن....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ربط يجف-β1 يجند إلى مستقبلات المعقدة مماثلة ينتج في سيرين فسفرة من عوامل النسخ SMAD2 / 3، تليها ارتباطها مع الوسيط المشترك، SMAD4. ترانزوكاتس مجمع سماد إلى النواة. يمكن تغف-β تنظيم النسخ الجيني، إما مباشرة عن طريق سماد ملزمة ل سبس داخل المناطق التنظيمية من الجينات المستهدفة، أو بشكل غير مباشر من خلال التعبير سمد بتنظيم المنشطات النسخي أو المكثفات التي تنظم في وقت لاحق التعبير عن الجين من الفائدة 10 . لاختبار ما إذا كان يجند .......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا التقرير، ونحن نبرهن على تغف-β1 ملزمة من SMAD2 إلى سب داخل المروج يج-كيت و TGF- β1 التي يسببها ملزمة STAT3 إلى تسلسل الاعتراف بها داخل الجين يجند-β1 يجند. علينا أن نظهر السيتوكين الناجم عن ملزمة كل من عوامل النسخ باستخدام لونين مناعي.

الكروماتين مناعي هو أداة قوية لإثبات ملزمة مباشرة من البروتين من الاهتمام إلى الحمض النووي، لتوصيف المحفزات التي تحفز البروتين ملزم الحمض النووي، وتوصيف تسلسل الحمض النووي الذ.......

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل جامعة تكساس مركز مد أندرسون للسرطان، هيوستن، تكس (صناديق بدء التشغيل، بب).

....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خلايا HepG2ATCCHB-8065
خلايا Hep3BATCCHB-8064
TGF- & beta ؛ 1R& D Systems101-B1تستخدم بتركيز 10 نانوغرام / مل
إشارات خلية الأجسام المضادة للأجسام المضادة SMAD25339الكمية المستخدمة / IP: 3 & micro ؛ ز
إشارات خليةالأجسام المضادة المضادةل STAT3 4904الكمية المستخدمة / IP: 3 & micro ؛ ز
ChIP-IT Protein G الخرز المغناطيسيالنشط53033
كوكتيل مثبط البروتيازالنشط37490
تقنية إشارات خليةالمكورات10011
التمهيدي الأمامي PCR: PAI-1التسلسل: 5'-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3 '
التمهيدي العكسي PCR: PAI-1التسلسل: 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'
التمهيدي المتسلسل الأمامي: تسلسل SCF: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3'  
برايمر عكسي PCR: تسلسل SCF: 5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'
برايمر المتسلسل المتسلسل الأمامي: TGF- & beta ؛ 1 (STB-1)التسلسل: 5'-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3'  
التمهيدي العكسي PCR: TGF- & beta ؛ 1 (STB-1)التسلسل: 5 '-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3'  
برايمر المتسلسل المتسلسل الأمامي: TGF- & beta ؛ 1 (STB-2)التسلسل: 5 '-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3'        
التمهيدي العكسي PCR: TGF- & beta ؛ 1 (STB-2)التسلسل: 5'-TGCCACTGTCTGGAGAGGGTGTC-3'    
تقنية تقنية الدقيقة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the bi....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

c KIT DNA SMAD2 TGF STAT3

مقالات ذات صلة