مقالة منهجية

تحليل ج- كيت يجند المروج باستخدام الكروماتين مناعي

DOI:

10.3791/55689

⸱

يونيو 27, 2017

 ,  , 
1Department of Gastroenterology, Hepatology and Nutrition, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التفاعلات البروتين الحمض النووي ضرورية لعمليات بيولوجية متعددة. خلال تقييم الوظائف الخلوية، وتحليل التفاعلات الحمض النووي البروتين لا غنى عنه لفهم تنظيم الجينات. الكروماتين مناعي (رقاقة) هو أداة قوية لتحليل هذه التفاعلات في الجسم الحي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العمليات الخلوية متعددة، بما في ذلك تكرار الحمض النووي وإصلاح، وإعادة التركيب الحمض النووي، والتعبير الجيني، تتطلب التفاعلات بين البروتينات والحمض النووي. لذلك، الحمض النووي البروتين التفاعلات تنظيم وظائف فسيولوجية متعددة، الفيزيولوجية المرضية، والبيولوجية، مثل تمايز الخلايا، تكاثر الخلايا، ومراقبة دورة الخلية، واستقرار الكروموسوم، وتنظيم الجينات الوراثية، وتحول الخلايا. في خلايا حقيقيات النواة، يتفاعل الحمض النووي مع بروتينات هيستون و نونهيستون ويكثف إلى لونين. العديد من الأدوات التقنية يمكن استخدامها لتحليل التفاعلات الحمض النووي البروتين، مثل الكهربائي (هلام) التنقل التحول الفحص (إمزا) و دناز I البصمة. ومع ذلك، فإن هذه التقنيات تحليل التفاعل البروتين الحمض النووي في المختبر ، وليس ضمن السياق الخلوي. الكروماتين مناعي (رقاقة) هو الأسلوب الذي يلتقط البروتينات في مواقع محددة الحمض النووي ملزمة لها، مما يسمح لتحديد التفاعل الحمض النووي البروتينs داخل سياق الكروماتين. ويتم ذلك عن طريق تثبيت التفاعل الحمض النووي البروتين، تليها مناعي من البروتين من الفائدة. في وقت لاحق، والموقع الجيني الذي كان ملزما البروتين إلى يتميز. هنا، نحن تصف ومناقشة رقاقة وإظهار قيمته التحليلية لتحديد عامل النمو تحويل β (تغف-β) التي يسببها ملزمة لعامل النسخ SMAD2 إلى عناصر ملزمة سماد (سب) داخل منطقة المروج من التيروزين- بروتين كيناز كيت (c-كيت) مستقبلات يجند عامل الخلايا الجذعية (سف).

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في نواة حقيقيات النوى، يتفاعل الحمض النووي مع بروتينات هيستون والبروتينات غير المهيأة ويتم تكثيفها في لونين. في السياق الفسيولوجي، الفيزيولوجي المرضي، والخلية البيولوجية، يتم التحكم في الوظائف الخلوية مكانيا وبشكل مؤقت بواسطة التعبير الجيني المنسق بالكروماتين. التفاعلات الحمض النووي البروتين لها دور أساسي في تنظيم العمليات الخلوية، مثل تكرار الحمض النووي، وإعادة التركيب، والإصلاح، فضلا عن التعبير البروتين. ولذلك، فإن تحليل التفاعلات الحمض النووي البروتين هو أداة لا غنى عنها في تقييم التعبير الجيني ووظيفة الخلية.

هناك العديد من التقنيات لتقييم التفاعلات الحمض النووي البروتين في المختبر ، مثل الكهربائي (هلام) التنقل التحول الفحص (إمزا) و دناز I البصمة 1 ، 2 . ومع ذلك، فإن هذه التقنيات لا تحليل التفاعل الحمض النووي للبروتين داخل لون الكروماتين والسياق الخلوي. تشيب iسا الذي يلتقط البروتينات ملزمة إلى مواقع محددة الحمض النووي ملزمة وبالتالي يسهل تحديد التفاعلات الحمض النووي البروتين داخل سياق لونين. وقد تم تطوير هذه التقنية في الأصل من قبل جيمور وليس لتقييم الحمض النووي الريبي بوليميراز إي ملزمة لجينات محددة في القولونية و دروسوفيلا ميلانوغاستر 3 ، 4 . ويتم ذلك عن طريق تثبيت المجمعات الحمض النووي البروتين، تليها أداء استخراج الكروماتين وقص الحمض النووي في ~ 200 زوج قاعدة (شظايا) شظايا. وفي وقت لاحق، يتم عزل البروتين المرتبط الحمض النووي من الفائدة التي كتبها إمونوبرسيبيتاتيون. بعد عكس الارتباط الحمض النووي البروتين، يتم تنقية الحمض النووي وتحليلها. ويمكن استخدام عدة طرق لتحليل مواقع ارتباط البروتين وتعتمد على تسلسل الحمض النووي من موقع ربط البروتين داخل الجين الهدف 5 . في الحالات التي يعرف فيها تسلسل الحمض النووي، بول القياسيةيمراس سلسلة ردود الفعل (ير) يمكن تطبيقها، وذلك باستخدام أزواج التمهيدي محددة يحيط موقع ملزمة معروفة. الكمي في الوقت الحقيقي ير (كرت-ير) ويمكن أيضا أن تستخدم 6 . في الحالات التي يكون فيها التسلسل غير معروف، يمكن دمج رقاقة مع ميكروأرس الحمض النووي (رقاقة على رقاقة)، ​​تسلسل الحمض النووي (تشيب-سيق)، أو تقنيات الاستنساخ 7 ، 8 ، 9 .

مسار تغف-has لديه وظائف قوية قمع الورم وهو المسار الرئيسي في تمايز الخلايا. يتم تفعيلها من خلال ربط يجند-β1 يجند إلى مجمع مستقبلات مماثلة لها، مما أدى إلى سيرين فسفرة من عوامل النسخ SMAD2 / 3. بعد ارتباطها مع الوسيط المشترك، SMAD4، ترانزموكتس سماد معقدة إلى النواة ويربط سب في منطقة المروج من الجينات المستهدفة، حيث ينظم الجينات التي تسيطر على دورة الخلية، موت الخلايا المبرمج، و ديفيرنتياتي الخليةعلى. الاستجابة النسخي للتحفيز تغف-is هو نوع الخلية والسياق محددة 10 . في الآونة الأخيرة، وصفنا حلقة ردود فعل إيجابية بين تغف-β ومسار C-كيت 11 . في هذا النموذج، تغف-β1 المنشط SMAD2 يربط إلى ج- كيت يجند المروج ويحفز التعبير عنها وإفرازها. في وقت لاحق، يجند C-كيت ينشط مستقبلات C-كيت بطريقة السيارات و شبه كرينيك. ج-كيت تنشيط مستقبلات النتائج في STAT3 تير 705- الفسفرة عبر JAK1 / 2. بعد STAT3 التنشيط والترجمة النووية، STAT3 يربط الجين يجف-β1 يجند وينظم التعبير عنها.

هنا، علينا أن نبرهن على الدور الأساسي لتحليل رقاقة لتحديد SMAD2 ملزمة إلى ج-كيت مستقبلات يجند المروج وتحديد محول إشارة (و) المنشط (من) النسخ 3 (STAT3 ملزمة ل تغف-β1- الجينات).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد الحلول

  1. إعداد الحلول التالية جديدة لكل تجربة.
    1. للحصول على حل التثبيت ، وإعداد 37٪ الفورمالديهايد وتخزينه في رت. تمييع في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس) إلى تركيز النهائي من 1.42٪.
      تنبيه: يتم تصنيف الفورمالديهايد على أنها مهيجة، تآكل، الطفرات، مسخ، ومسببة للسرطان. لا يبتلع. لا تتنفس الغاز / الأبخرة / بخار / رذاذ. في حالة عدم كفاية التهوية، ارتدي معدات ملائمة للتنفس. تجنب ملامسة الجلد والعينين. الابتعاد عن غير متوافقة، مثل العوامل المؤكسدة، عوامل الحد، الأحماض، القلويات، والرطوبة.
    2. لالجليسين حل حل الإصلاح، وإعداد 0.125 M الجلايسين في حل برنامج تلفزيوني 1X وتخزينه في رت.
    3. للحصول على حل كشط الخلية، وإعداد حل برنامج تلفزيوني 1X في د 2 O وتخزينه على الجليد. مباشرة قبل الاستخدام، إضافة بروتيناز مثبط فينيلميثيلسولفونيل فلوريد (بمسف) رأوا تركيز النهائي من 0.5 ملم.
      تنبيه: يتم تصنيف بمسف على أنها تآكل وسامة. وارتداء الملابس الواقية واستخدامها في منطقة التهوية.
    4. مباشرة قبل استخدام العازلة تحلل الخلية (20 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 85 ملي بوكل، و 0.5٪ NP40)، إضافة 1X بروتياز المانع كوكتيل (بيك، حل المخزون 100X في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (دمسو): 104 ملم 4- 2-أمينو إيثيل) البنزين سلفونيل فلوريد هيدروكلوريد (أبسف)، 80 ميكرومتر أبروتينين، 4 مم بيستاتين، 1.4 ملم E-64، 2 ملي ليوبتين، و 1.5 ملي بيبستاتين A) و 0.5 ملي بمسف.
    5. مباشرة قبل استخدام العازلة تحلل النوى (50 ملي تريس كل، ودرجة الحموضة 8.0، 10 ملي إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض (إدتا)، و 1٪ سدز)، إضافة 1X الموافقة المسبقة عن علم و 0.5 ملي بمسف.

2. تثبيت الخلية والقص

  1. تنمو الخلايا إلى التقاء 70-80٪ على 10 سم لوحات زراعة الأنسجة. تحفيز الخلايا في الأهداف التجريبية.
  2. إزالة المتوسطة زراعة الأنسجة، إضافة 5 مل من حل التثبيت، واحتضانالخلايا لمدة 10 دقيقة في رت على منصة الهز.
  3. إزالة الحل التثبيت وغسل الخلايا مرتين مع 10 مل من الجليد الباردة 1X بس.
  4. إزالة برنامج تلفزيوني 1X، إضافة 5 مل من الجلايسين حل حل الإصلاح، واحتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في رت على منصة الهز.
  5. إزالة الحل إصلاح وقف الجلايسين وغسل الخلايا مرتين مع 10 مل من الجليد الباردة 1X بس.
  6. إزالة برنامج تلفزيوني 1X، إضافة 2 مل من محلول كشط الخلية، وحصاد الخلايا باستخدام مكشطة الخلية. نقل الخلايا المحصودة إلى أنبوب مخروطي على الجليد.
  7. الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في 600 x ج و 4 درجة مئوية.
  8. إزالة طاف، ريسوسبيند بيليه في 1 مل من 1X خلية تحلل العازلة، واحتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة. بدلا من ذلك، المفاجئة تجميد بيليه في النيتروجين السائل وتخزينه في -80 درجة مئوية.
  9. مرة واحدة يتم معلق بيليه في العازلة تحلل الخلية، ونقل تعليق الخلية إلى الخالط دونس الجليد الباردة و دونس لمدة 10 السكتات الدماغية باستخدام بيستل من نوع Be لتعطيل الخلية.
  10. نقل تعليق الخلية إلى أنبوب ميكروسنتريفوج وأجهزة الطرد المركزي العينات لمدة 10 دقيقة في 2400 x ج و 4 درجات مئوية.
  11. تجاهل طاف، ريسوسبيند بيليه في 350 ميكرولتر من نوى الهضم العازلة، واحتضان العينات لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  12. إضافة نوكلياز الميكروية (1 U / ميكرولتر) ومزيج من فورتيكسينغ. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 5-20 دقيقة. مزيج من عينات كل 2 دقيقة عن طريق انعكاس.
    ملاحظة: الوقت وتركيز انزيم تختلف بين خطوط الخلايا، وربما تتطلب التحسين في حالات القص الأنزيمي دون الأمثل.
  13. بدلا من ذلك، تحقيق الكروماتين القص بواسطة سونيكاتيون باستخدام سونيكاتورس المتاحة تجاريا.
    ملاحظة: سوف تتطلب ظروف سونيكيشن الأمثل. يتم توفير بروتوكول المثال الأمثل أدناه باستخدام حجم عينة من 300 ميكرولتر وقوة معالجة العينة من 25٪.
    1. بعد الخطوة 2.10، تجاهل طاف و ريسوسبيند nبيليه النووي في 1.0 مل من العازلة القص التجاري.
    2. قسامة 300 ميكرولتر من بيليه النووي معلق في ثلاثة 1.7 مل أنابيب ميكروسنتريفوج. وضعها على الجليد.
    3. القص 3 أليكوتس من لونين ثابت في 25٪ الطاقة باستخدام 3 ظروف مختلفة لتحديد ظروف سونيكيشن الأمثل:
      5 نبضات قدرها 20 ثانية لكل منها، مع 30 ثانية على الجليد بين كل نبضة.
      10 نبضات من كل 20 ثانية، مع 30 ثانية على الجليد بين كل نبضة.
      20 نبضة من كل 20 ثانية، مع 30 ثانية على الجليد بين كل نبضة.
    4. تابع الخطوة 2.15، كما هو موضح أدناه.
  14. بعد الحضانة مع نوكلياز ميكروكوكال، إضافة 7 ميكرولتر من الجليد الباردة 0.5 M إدتا لوقف رد الفعل.
  15. الطرد المركزي العينات مع الحمض النووي قص لمدة 10 دقيقة في 16،200 x ج و 4 درجة مئوية.
  16. نقل طاف التي تحتوي على الحمض النووي التي تم إنشاؤها إلى أنبوب ميكروسنتريفوج جديدة. قسامة 50 ميكرولتر في أنبوب ميكروسنتريفوج منفصلة لتأكيد سوالقص المتقطع من الحمض النووي (القسم 3). استخدام حجم المتبقية على الفور ل إمونوبريسيانتاتيون (القسم 4) أو تخزينه في -80 درجة مئوية.

3. تأكيد كفاءة القص

  1. إضافة 150 ميكرولتر من نوكليس خالية من د 2 O و 10 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم إلى قسامة 50 ميكرولتر من لونين قص من الخطوة 2.16.
  2. احتضان العينات في 65 درجة مئوية لمدة 4 ساعات لعكس كروسلينكس.
  3. إضافة 2 ميكرولتر من ريبونوكلياز A (10 ميكروغرام / ميكرولتر) واحتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
  4. إضافة 10 ميكرولتر من بروتين K (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر) واحتضان العينات في 42 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
  5. لتنقية الحمض النووي، إجراء استخراج الفينول / الكلوروفورم 12 .
    1. إضافة نوكليس خالية من المياه إلى الحجم النهائي من 200 ميكرولتر. إضافة 200 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: الكحول الإيزوامل (25: 24: 1) لعينة ودوامة لمدة 20 ثانية.
    2. الطرد المركزي، إلى، الغرفة، تيمبيراتور لمدة 5 دقائق في 16،000 x ز. إزالة بعناية المرحلة المائية العليا ونقله إلى أنبوب جديد. تأكد من عدم حمل أي الفينول خلال بيبتينغ.
    3. إضافة 0.1 مجلدات من 3 M خلات الصوديوم (نه 4 أواك)، ودرجة الحموضة 5.2، وتخلط عن طريق عبها أنبوب عدة مرات مع إصبع. إضافة 2.5 مجلدات من الايثانول الجليد البارد 100٪ ومزيج من فورتيكسينغ لمدة 5 ثوان. احتضان العينة O / N عند -20 درجة مئوية، أو لمدة 1 ساعة على الأقل في -80 درجة مئوية.
    4. الطرد المركزي العينة لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية و 16،000 x ج بيليه كدنا.
    5. إزالة بعناية طاف دون تعطيل بيليه. إضافة 1 مل من رت، 70٪ من الإيثانول وعكس الأنبوب عدة مرات.
    6. الطرد المركزي العينة لمدة 2 دقيقة في 4 درجات مئوية و 16،000 x ز. إزالة بعناية طاف.
    7. تجفيف بيليه لمدة 5-10 دقيقة في رت. ريسوسبيند بيليه في 30 ميكرولتر من د 2 O.
  6. استخدام قسامة 5 و 10 ميكرولتر من الحمض النووي المنقى للهلام الكهربائي مع 1٪ تايهلام الاغاروز.
    ملاحظة: نتائج القص الكروماتين الناجحة في نمط الحمض النووي 200-1500 بب. إذا كان القص غير ناجحة، وتحديد ظروف القص الأمثل للخلايا محددة عن طريق تعديل وقت حضانة الخطوة القص (الخطوة 2.12) إلى 5 و 10 و 15 دقيقة.
  7. استخدام العينة المتبقية لتحليل تركيز الحمض النووي للعينة. عكس حساب تركيز الحمض النووي في عينة الكروماتين القص (الخطوة 2.16). استخدام كميات الحمض النووي نفسه لكل مجموعة علاج لمناعي (القسم 4).

4. مناعي

  1. الجمع بين 10-25 ميكروغرام من كروسينلينك كروسلينكد (الخطوة 2.16) مع 25 ميكرولتر من البروتين الصف رقاقة G الخرز المغناطيسي، 10 ميكرولتر من العازلة التخفيف مناعي (حل المخزون: 0.01٪ سدز، 1.1٪ تريتون X-100، 16.7 ملم تريس-حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.0، 1.2 ملي إدتا، و 167 ملي مول كلوريد الصوديوم)، و 1 ميكرولتر من الموافقة المسبقة عن علم.
  2. بعد 4 ساعات من الحضانة، إضافة 1-10 ميكروغرام من الأجسام المضادة (كونسنتر الأجسام المضادةسوف تختلف أفيون على أساس تقارب الأجسام المضادة. فإنه ينبغي في البداية أن تستخدم في توصيات الشركة المصنعة وتحسينها تجريبيا إذا لزم الأمر) إلى أنبوب ميكروسنتريفوج 1.5 مل وإضافة د 2 O إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر.
    ملاحظة: بدلا من الأسلوب المذكور أعلاه مناعية مباشرة، ويمكن استخدام طريقة إمونوبريسيبياتيون غير المباشرة عن طريق الجمع بين لونين أولا مع الأجسام المضادة، وبعد ذلك إضافة بروتين الخرز المغناطيسي G.
  3. احتضان العينات على نهاية إلى نهاية المدورة لمدة 4-12 ساعة في 4 درجات مئوية.

5. شطف

  1. وضع الأنابيب على موقف المغناطيسي. وبمجرد أن الخرز المغناطيسي المجاميع على جانب الأنبوب، وإزالة بعناية وتجاهل طاف.
  2. غسل الخرز ثلاث مرات مع 800 ميكرولتر من غسل العازلة 1 (0.1٪ سدز، 1٪ تريتون X-100، 2 ملي إدتا درجة الحموضة 8، 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8، و 150 ملي كلوريد الصوديوم). مزيج عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. وضع أنبوب على موقف المغناطيسي aند إزالة بعناية وتجاهل العازلة غسل مرة واحدة في الخرز المغناطيسي المجاميع على جانب الأنبوب.
  3. غسل حبات مرة واحدة مع 800 ميكرولتر من غسل العازلة 2 (0.1٪ سدز، 1٪ تريتون X-100، 2 ملي إدتا؛ الرقم الهيدروجيني 8، 20 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، و 500 ملي كلوريد الصوديوم). مزيج عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. وضع أنبوب على موقف المغناطيسي وإزالة بعناية وتجاهل العازلة غسل مرة واحدة في الخرز المغناطيسي المجاميع على جانب الأنبوب.
  4. ريسوسبيند الخرز في 50 ميكرولتر من شطف العازلة (1٪ سدز و 100 ملي ناهكو 3 ) واحتضان العينات على نهاية إلى نهاية المدورة لمدة 15 دقيقة في رت.
  5. وضع الأنابيب على موقف المغناطيسي، وبمجرد أن الخرز المغناطيسي جمع على جانب الأنبوب، ونقل طاف إلى أنبوب جديد.
  6. إضافة 6 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم، لعكس تشابك، و 2 ميكرولتر من بروتين K (0.5 ميكروغرام / ميكرولتر). بعد خلط العينات، احتضان العينات لمدة 2 ساعة عند 65 درجة مئوية.
  7. لتنقية الحمض النووي، إجراء فنول / كلوروفورم استخراج 12 (الخطوة 3.5)، ثم ريسوسبيند بيليه في 30 ميكرولتر من د 2 O.
    ملاحظة: العينات يمكن تحليلها مباشرة لمواقع البروتين ملزمة (القسم 5) أو يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية.

6. تحليل الموقع الملزم

  1. إجراء تحليل لمواقع ملزمة محددة داخل تسلسل الحمض النووي المعروفة باستخدام ير أو كرت-ير. لتصميم التمهيدي، اتبع ير أو بروتينات ير-ير التقليدية. تصميم الاشعال لتجميع 150-400 بب أمبليكون أن جسور البروتين ملزم موقع الفائدة ( الشكل 1 ).
  2. إعداد ير باستخدام أربعة قوالب الحمض النووي مختلفة لضمان خصوصية: ط) الحمض النووي من إمبونوبريسيبيتاتد رقاقة مع الأجسام المضادة من الفائدة، إي) الحمض النووي من إمبونوبريسيبيتاتد رقاقة مع الأجسام المضادة مفتش غير محددة، إي) دنا المدخلات، و 4) H 2 O ك السيطرة السلبية ل ير لاستبعاد التلوث. في حالة تحفيز المسار، واختيار قالب الخامس باستخدام مجموعة مختلفة من الاشعال محددة لموقع ملزمة معروفة من البروتين إمونوبريسيبيتاتد.
    ملاحظة: في حالة C- كيت يجند تحليل المروج، واستخدام ير التقليدية لإثبات تغف-β التي يسببها سماد ملزمة في سب داخل C- كيت المروج يجند المنطقة. كسيطرة إيجابية، أداء ير على المنشط بلاسمينوجين المانع -1 (باي-1) كهدف معروف من تغف-β الناجم عن سماد ملزمة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ربط يجف-β1 يجند إلى مستقبلات المعقدة مماثلة ينتج في سيرين فسفرة من عوامل النسخ SMAD2 / 3، تليها ارتباطها مع الوسيط المشترك، SMAD4. ترانزوكاتس مجمع سماد إلى النواة. يمكن تغف-β تنظيم النسخ الجيني، إما مباشرة عن طريق سماد ملزمة ل سبس داخل المناطق التنظيمية من الجينات المستهدفة، أو بشكل غير مباشر من خلال التعبير سمد بتنظيم المنشطات النسخي أو المكثفات التي تنظم في وقت لاحق التعبير عن الجين من الفائدة 10 . لاختبار ما إذا كان يجند ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا التقرير، ونحن نبرهن على تغف-β1 ملزمة من SMAD2 إلى سب داخل المروج يج-كيت و TGF- β1 التي يسببها ملزمة STAT3 إلى تسلسل الاعتراف بها داخل الجين يجند-β1 يجند. علينا أن نظهر السيتوكين الناجم عن ملزمة كل من عوامل النسخ باستخدام لونين مناعي.

الكروماتين مناعي هو أداة قوية لإثبات ملزمة مباشرة من البروتين من الاهتمام إلى الحمض النووي، لتوصيف المحفزات التي تحفز البروتين ملزم الحمض النووي، وتوصيف تسلسل الحمض النووي الذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل جامعة تكساس مركز مد أندرسون للسرطان، هيوستن، تكس (صناديق بدء التشغيل، بب).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
خلايا HepG2ATCCHB-8065
خلايا Hep3BATCCHB-8064
TGF- & beta ؛ 1R& D Systems101-B1تستخدم بتركيز 10 نانوغرام / مل
إشارات خلية الأجسام المضادة للأجسام المضادة SMAD25339الكمية المستخدمة / IP: 3 & micro ؛ ز
إشارات خليةالأجسام المضادة المضادةل STAT3 4904الكمية المستخدمة / IP: 3 & micro ؛ ز
ChIP-IT Protein G الخرز المغناطيسيالنشط53033
كوكتيل مثبط البروتيازالنشط37490
تقنية إشارات خليةالمكورات10011
التمهيدي الأمامي PCR: PAI-1التسلسل: 5'-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3 '
التمهيدي العكسي PCR: PAI-1التسلسل: 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'
التمهيدي المتسلسل الأمامي: تسلسل SCF: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3'  
برايمر عكسي PCR: تسلسل SCF: 5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'
برايمر المتسلسل المتسلسل الأمامي: TGF- & beta ؛ 1 (STB-1)التسلسل: 5'-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3'  
التمهيدي العكسي PCR: TGF- & beta ؛ 1 (STB-1)التسلسل: 5 '-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3'  
برايمر المتسلسل المتسلسل الأمامي: TGF- & beta ؛ 1 (STB-2)التسلسل: 5 '-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3'        
التمهيدي العكسي PCR: TGF- & beta ؛ 1 (STB-2)التسلسل: 5'-TGCCACTGTCTGGAGAGGGTGTC-3'    
تقنية تقنية الدقيقة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions. Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).
  2. Garner, M. M., Revzin, A. A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system. Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).
  3. Gilmour, D. S., Lis, J. T. Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes. Proc Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).
  4. Gilmour, D. S. Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster. Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).
  5. Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond. Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).
  6. Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans. Nat Protoc. 3 (4), 698-709 (2008).
  7. Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters. Mol Cell Biol. 21 (20), 6820-6832 (2001).
  8. Weinmann, A. S., Farnham, P. J. Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation. Methods. 26 (1), 37-47 (2002).
  9. Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis. GenesDev. 16 (2), 235-244 (2002).
  10. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. Smad transcription factors. Genes Dev. 19 (23), 2783-2810 (2005).
  11. Rojas, A., et al. A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer. Neoplasia. 18 (6), 371-386 (2016).
  12. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform. CSH Protoc. 2006 (1), (2006).
  13. Dennler, S., et al. Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene. EMBO J. 17 (11), 3091-3100 (1998).
  14. Shi, Y., et al. Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling. Cell. 94 (5), 585-594 (1998).
  15. Seidel, H. M., et al. Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity. Proc Natl Acad Sci USA. 92 (7), 3041-3045 (1995).
  16. Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method. Nat Protoc. 1 (1), 179-185 (2006).
  17. Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions. Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).
  18. O'Neill, L. P., Turner, B. M. Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP. Methods. 31 (1), 76-82 (2003).
  19. Horz, W., Altenburger, W. Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease. Nucleic Acids Res. 9 (12), 2643-2658 (1981).
  20. Chung, H. R., et al. The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data. PLoS One. 5 (12), 15754(2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

c KIT DNA SMAD2 TGF STAT3

مقالات ذات صلة