هنا، ويتبين كيف يمكن في الموقع التقريب التقارب القرب (جيش التحرير الشعبى الصينى) يمكن استخدامها للكشف وتصور التفاعلات البروتين البروتين مباشرة بين أتم و p53 في الثقافات خلية تعليق تتعرض للإجهاد السامة الجينات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الكشف والتصور من المجمعات البروتين الناجم عن الأضرار الحمض النووي في الثقافات خلية تعليق باستخدام التقريب ربط القرب
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
استجابة الحمض النووي الضرر يبرر إصلاح آفات الحمض النووي التي تحدث بشكل عفوي، والناجمة عن الإجهاد السمية الجينية، أو تظهر في سياق فواصل الحمض النووي المبرمج في الخلايا الليمفاوية. الكيناز المتحول (أتم) كيناز (أتم) و كيناز المرتبط ب ATM3 و Rad3 (أتر) والوحدة الفرعية الحفازة للبروتين كيناس المعتمد على الحمض النووي (دنا-يكس) هي من بين الأولى التي يتم تنشيطها عند تحريض تلف الحمض النووي، وهي أجهزة تنظيم مركزية للشبكة التي تتحكم في إصلاح الحمض النووي، موت الخلايا المبرمج، وبقاء الخلية. كجزء من مسار قمعي للورم، أتم و أتر تفعيل p53 من خلال الفسفرة، وبالتالي تنظيم النشاط النسخي من p53. يؤدي تلف الحمض النووي أيضا إلى تشكيل ما يسمى بؤر الإشعاعات المؤينة (إريف) التي تمثل مجمعات استشعار الحمض النووي الضرر وإصلاح البروتينات التي تتراكم في مواقع تلف الحمض النووي، والتي تصور بواسطة المجهر مضان. غير أن التوطين المشترك للبروتينات في إريفس لا يعني بالضرورة دالتفاعلات البروتين البروتين مباشرة، كما أن قرار المجهر مضان محدودة.
في الموقع التقريب التقارب القرب (جيش التحرير الشعبى الصينى) هو أسلوب الرواية التي تسمح التصور المباشر من البروتين البروتين التفاعلات في الخلايا والأنسجة مع خصوصية لم يسبق لها مثيل والحساسية. وتستند هذه التقنية على القرب المكاني للأجسام المضادة المحددة ملزمة للبروتينات ذات الاهتمام. عندما البروتينات استجواب في غضون ~ 40 نانومتر يتم تنشيط رد فعل التضخيم من قبل قليل النوكليوتيدات التي مترافق إلى الأجسام المضادة، ويتم تصور المنتج التضخيم من قبل وضع العلامات الفلورسنت، مما أسفر عن إشارة التي تتوافق مع الموقع تحت الخلوية من البروتينات المتفاعلة. باستخدام التفاعل الوظيفي القائم بين أتم و p53 كمثال على ذلك، هو موضح هنا كيف يمكن استخدام جيش التحرير الشعبى الصينى في الثقافات خلية تعليق لدراسة التفاعلات المباشرة بين البروتينات التي هي جزء لا يتجزأ من استجابة تلف الحمض النووي.
المقدمة
يسبب تلف الحمض النووي سلسلة من التنظيمات العالية من الأحداث التي تنطوي على التفاعلات البروتين البروتين والتغييرات بعد متعدية التي تضمن إصلاح فعال وسريع من الحمض النووي، وبالتالي الحفاظ على السلامة الجينية 1 . عادة، يتم دراسة إصلاح الحمض النووي في الخلايا المعرضة للإشعاع المؤين من خلال رصد تشكيل ما يسمى بؤر الإشعاعات المؤينة (إريف) من قبل (متحد البؤر) المجهر مضان. العديد من إصلاح الحمض النووي والبروتينات الاستشعار عن الضرر الحمض النووي تشكل إريفس، والتي تمثل المجمعات البروتين التي نواة في مواقع الكروماتين الحفاظ على تلف الحمض النووي 2 ، 3 . موقع و....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. علاج الخلايا والحمض النووي الضرر الحث
- ثقافة خلايا الخلايا الليمفاوية الحادة BCR- عبل + B خلايا الخلايا الليمفاوية الحادة B1717 أو سوب-B15 في إدم تستكمل مع 20٪ فس، 50 ميكرومتر β ميركابتويثانول، 2 ملي L- الجلوتامين، و 100 U / مل البنسلين و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين في 37 درجة مئوية في جو من 5٪ كو 2 . عد الخلايا وصفيحة في 2 × 10 6 خلية / مل في لوحات 6 آبار، في 5 مل / جيدا.
ملاحظة: اختياريا، خطوط الخلايا تعليق من أصل مختلف يمكن استخدامها. - لإيقاف ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وقد أظهرت الفسفرة من p53 في بقايا Ser15 أن تعتمد على أتم كيناز النشاط 16 . لإثبات وتأكيد خصوصية تقنية جيش التحرير الشعبى الصينى على الاستعدادات سيتوسبين من الثقافات خلية تعليق، ويظهر أن تحريض تلف الحمض النووي من قبل 2 ساعة العلاج نس من خلايا بكر-عبل + B-آل القبض في المرحلة G1 من دورة الخلية أدى إلى التفاعل المحدد بين أجهزة الصراف الآلي والفوسفو- Ser15-p53، كما هو متوقع. وقد لوحظت إشارات جيش التحرير الشعبى الصينى منقط في نواة.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذا التقرير، يتضح أن جيش التحرير الشعبى الصينى يمكن استخدامها لتحديد وتصور التفاعل المحدد بين البروتينات في الثقافات خلية تعليق. من ملاحظة، بروتوكول الموصوفة هنا لا يقتصر على دراسة المجمعات إصلاح الحمض النووي ولكن ينطبق أيضا على تصور وقياس التفاعلات البروتين البروتين الأخرى في الثقافات خلية تعليق. ويظهر أن أتم كيناز يتفاعل مع p53 فوسفهوريلاتد في G1 - اعتقلت بكر-عبل + B-آل الخلايا عندما تتعرض لعامل الحمض النووي الناجم عن الضرر. سابقا، تم استخدام تقنية جيش التحرير الشعبى الصينى ل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
وتمول البحوث في مختبر غويكيما من خلال برنامج الحوافز البحثية الابتكارية من المنظمة الهولندية للبحث العلمي (منحة فيدي 016126355) و 'ستيكتينغ كينديرف كانكرفريج' كيكا (مشروع 252).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| خط الخلية BV173 | DSMZ | AC-20 | BCR-ABL + خط الخلايا B-ALL |
| SUP-B15 خط الخلية | DSMZ | ACC-389 | BCR-ABL + خط الخلايا B-ALL |
| Iscove's Modified Dulbecco Medium (IMDM) | Gibco (Life Technologies) | 21980-032 | |
| مصل عجل الجنين | Sigma Aldrich | F7524 | lot #: 064M3396 |
| L-glutamine | Gibco (الحياة التقنيات) | 25030-024 | |
| البنسلين / الستربتومايسين | جيبكو (تقنيات الحياة) | 15140-122 | |
| إيماتينيب ميثان سولفونات | LC Laboratories | I-5508 | تذوب في DMSO ، وإعداد محلول مخزون 10 ملي |
| نيوكارزينوستاتين | سيجما ألدريتش | N9162 | مطفرات / ماسخ ، تعامل بعناية |
| KU55933 | Selleckchem | S1092 | يذوب في DMSO ، وقم بإعداد محلول مخزون 5 ملي |
| Starfrost Microscopy Slides | Waldemar Knittel | VA11200 003FKB | |
| مانع سائل القلم PAP | Sigma Aldrich | Z377821-1EA | |
| Cytospin Funnel | Q Path Labonord SAS | 003411324 | |
| Duolink في الموقع Red Starter Kit الماعز / الأرانب | Sigma Aldrich | DUO92105 | متاح لأنواع / مجموعات مختلفة ، متوفر أيضا في FarRED و Orange و Green |
| Golens-anti-ATM | Bethyl Laboratories | A300-136A | PLA-grade ؛ استخدمنا بنجاح الكثير # A300-136A-1 في دراساتنا |
| Rabbit-anti-phospho-Ser15-p53 | Cell Signaling Technology | 9284 | استخدمنا بنجاح الكثير # 9284-4 في دراساتنا |
| Vectashield المضادة للبهتان والمتوسطة التركيب مع DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| Vectashield مضاد للبهتان تصاعد متوسط | Vector Labs | H-1000 | |
| 4٪ paraformaldehyde في PBS | Santa Cruz Biotechnology | sc-281692 | متاح أيضا من العديد من البائعين الآخرين |
المراجع
- Maréchal, A., Zou, L. DNA Damage Sensing by the ATM and ATR Kinases. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (9), a012716(2013).
- Huen, M. S. Y., Chen, J. Assembly of checkpoint and repair machineries at DNA damage sites. Trends Biochem Sci. 35 (2), 101-108 (2....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
