والهدف من هذا البروتوكول هو للتدليل على إعداد والثقافة والعلاج، والمناعية من إكسبلانتس القوقعة الفئران حديثي الولادة. ويمكن استخدام هذه التقنية كأداة في المختبر الفحص في سماع البحوث.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
حديثي الولادة الفئران كوكلار تقنية إكسبلانت باعتبارها
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في حين كان هناك تقدما ملحوظا في سماع البحوث على مدى العقود القليلة الماضية، لا يزال هناك أي علاج لفقدان السمع الحسي العصبي (سنهل)، وهو الشرط الذي ينطوي عادة على الضرر أو فقدان الهياكل الحسية الحسية الدقيقة للأذن الداخلية. ظهرت في المختبر في المختبر وفحص الجسم الحي في السنوات الأخيرة، مما يتيح فرز عدد متزايد من المركبات العلاجية المحتملة مع تقليل الموارد وتسريع الجهود لتطوير علاجات ل سنهل. على الرغم من أن الثقافات المتجانسة لبعض أنواع الخلايا لا تزال تلعب دورا هاما في البحوث الحالية، فإن العديد من العلماء يعتمدون الآن على ثقافات عضلية النمط الأكثر تعقيدا من الأذنين الفئران الداخلية، المعروف أيضا باسم المستكشفات القوقعة. الحفاظ على الهياكل الخلوية المنظمة داخل الأذن الداخلية يسهل التقييم في الموقع من المكونات المختلفة للبنية القوقعة، بما في ذلك خلايا الشعر الداخلية والخارجية، والخلايا العصبية دوامة العقدة، العصبيةإيتس، والخلايا الداعمة. هنا نقدم إعداد والثقافة والعلاج، والمناعية من إكسبلانتس القوقعة الفئران حديثي الولادة. إن الإعداد الدقيق لهذه المستكشفات يسهل تحديد الآليات التي تسهم في سنهل ويشكل أداة قيمة لمجتمع البحث السمعي.
المقدمة
فقدان السمع الحسي العصبي (سنهل) يعكس الأضرار التي لحقت الأذن الداخلية أو الصاعد المسار السمعي. في حين أن فقدان السمع هو العجز الحسي الأكثر شيوعا في البشر 1 ، العلاجات العلاجية لا وجود لها حتى الآن 2 . على الرغم من أن زراعة قوقعة الأذن أو السمع يمكن أن تستعيد درجة معينة من السمع للمرضى الذين يعانون من سنهل شديدة وعميقة، فإن السمع التي تقدمها هذه الأجهزة لا تزال مختلفة جدا عن السمع "الطبيعي"، وخصوصا أثناء محاولات لفهم الكلام في الضوضاء أو للاستماع إلى الموسيقى.
في حين يعتبر انحطاط خلية الشعر منذ فترة طويلة النتيجة ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
تمت الموافقة على بروتوكول الدراسة من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (إاكوك) من ماساتشوستس العين والأذن. وأجريت التجارب وفقا لمدونة أخلاقيات الجمعية الطبية العالمية.
1. إعداد تشريح
- إعداد الجدول الجراحي
- استخدام الايثانول 70٪ لتطهير الجدول الجراحي.
- وضع اثنين من منصات الإعدادية غير معقمة بجوار المجهر.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في حين أن العديد من البروتوكولات تركز على الجهاز من إلكسبلانتس كورتي، يحاول هذا الأسلوب للحفاظ على التشريح من بدوره القوقعة بأكملها، بما في ذلك سغنز. وهذا يعطي الباحثين الفرصة لتحليل آثار علاج معين على نيوريتس و سوماتا من سغنز بالإضافة إلى الجهاز كورتي. إجراء تشريح الذي يحافظ على جزء من موديولوس، كما هو موضح هنا، هو أكثر صعوبة من الناحية الفنية من إكسلانتينغ الجهاز كورتي وحدها. ومع ذلك، فإن منطقة نيوريت و سغن مهم، لأن لوحظت آثار مرضية كبيرة في هذه .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يجب على الباحثين أن يتقنوا تقنية التشريح قبل إجراء التجارب التي تنطوي على إكتشافات قوقعة. وتضرر الخلايا الشعرية عادة أثناء إجراء التشريح في وقت مبكر من منحنى التعلم، وحظة إشكالية خاصة لنزاهتها هي إزالة الغشاء القصبي، الأمر الذي يتطلب أيدي ثابتة، والأدوات المناسبة، والخبرة. لتوفير الوقت والموارد، يجب أن يتم تنفيذ التحكم البصري تحت المجهر تشريح والمناطق التي يحتمل أن تكون ضارة وتجدر الإشارة إلى. بدلا من استخدام الأجسام المضادة الأولية والثانوية مكلفة، الكواشف أرخص مثل فالويدين هي أك.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصمم وغيرها من منح اضطرابات الاتصالات R01DC015824 (كمز) و T32DC00038 (دعم سد)، ومنح وزارة الدفاع W81XWH-15-1-0472 (كمز)، ومؤسسة بيرتاريللي (كمز)، و ومؤسسة نانسي سايلز داي (كمز)، ومركز لور تينيتوس ريزارتش سينتر (كمز). نشكر جيسيكا E. ساغيرز، با للتعليقات الثاقبة على المخطوطة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أمبيسلين ، ملح الصوديوم | Invitrogen | 11593-027 | |
| الجسم المضاد ل CtBP2 ، الفأر (IgG1) | Transduction Laboratories | 612044 | |
| الأجسام المضادة ل Myo7A ، الأرنب | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| الجسم المضاد ل NF-H ، الجسم المضاد للدجاج | EMD Millipore | AB5539 | |
| المضاد ل PSD95 ، الفأر (IgG2a) | الأجسام المضادة شركه. | 75-028 | |
| الجسم المضاد ل TuJ1 ، الفأر | BioLegend | 801202 | |
| خلية Cell-Tak لاصق والأنسجة ، 5 مجم | Corning | 354241 | |
| أنابيب الطرد المركزي CELLSTAR 15 مل ، قاع مخروطي ، تخرج ، | معقم Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR ، 100 × 20 مم | Greiner Bio-One | 664160 | |
| طبق ثقافة الخلية CELLSTAR ، 35 × 10 مم ، 4 حلقات داخلية طبق | Greiner Bio-One | 627170 | |
| CELLSTAR ، 60 × 15 مم | Greiner Bio-One | 628160 | |
| CELLSTAR 50 مل أنابيب الطرد المركزي ، قاع مخروطي ، تخرج ، معقم | Greiner Bio-One | 227261 | |
| شفاف طلاء الأظافر | علوم المجهر الإلكتروني | 72180 | |
| أطباق قاع زجاجية شفافة للجدار (زجاج 40 مم) ، PELCO & reg ؛ ، كم / 20 ، 50 × 7 مم | Ted Pella Inc. | 14027-20 | |
| أغطية ، مستديرة ، زجاجية ، قطر 10 مم ، سمك # 1 ، 0.13 - 0.16 مم | شركة تيد بيلا. | 260368 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| ماء مقطر, 500 مل | Thermo Fisher Scientific | 15230-162 | |
| وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM) ، نسبة عالية من الجلوكوز ، البيروفات ، بدون جلوتامين ، 500 مل | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| Dumont # 4 Fine | Cerps Fine Science | Tools 11241-30 | |
| Dumont # 55 Fine Science Tools | 11295-51 | ||
| الكحول الإيثيلي (EtOH) ، نقي ، 200 دليل ، لا مائي ، & ge ؛ 99.5٪ | سيجما ألدريتش | 459836-1L | |
| مصل الأبقار الجنينية (FBS) ، مناطق مؤهلة ومعتمدة من وزارة الزراعة الأمريكية ، 500 مل | ثيرمو فيشر العلمي | 10437-028 ؛ | Aliquot في أنابيب 50 مل وتخزينها في -20 درجة ؛ C فريزر |
| الماعز المضاد للدجاج -647 الجسم المضاد الثانوي | ثيرمو فيشر العلمي | A-21469 | |
| الماعز المضاد للفأر (IgG) -568 الجسم المضاد الثانوي | ثيرمو فيشر Scientific | A-11004 | |
| الماعز المضاد للفأر (IgG1) -568 الجسم المضاد الثانوي | ثيرمو فيشر العلمي | A-21124 | |
| الماعز المضاد للفأر (IgG2a) -488 الجسم المضاد الثانوي | ثيرمو فيشر العلمي | A-21131 | |
| الماعز المضاد للأرانب -488 الجسم المضاد الثانوي | Thermo Fisher Scientific | R37116 | |
| H2< / sub>O ، معقم ، EmbryoMax Ultra Pure Water ، 500 مل | EMD Millipore | TMS-006-B | |
| محلول الملح المتوازن هانك (HBSS) ، الكالسيوم ، المغنيسيوم ، بدون فينول أحمر ، 500 مل | علبة أدوات Thermo Fisher Scientific | 14025-092 | |
| مع غطاء الفولاذ المقاوم للصدأ | على سفح الجبل الطبية | TechMed4255 | |
| الجزئي (تشريح) سكين – بزاوية 30 درجة ؛ | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| ، VistaVision ، مرمزة بالألوان ، 75 × 25 مم (3 × 1 بوصة) ، بسمك 1 مم ، أبيض ، عبوة من 72 | مكمل غذائي VWR | 16004-382 | |
| N-2 (100X) ، 5 مل | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| NaHCO3< / sub> ، محلول بيكربونات الصوديوم 7.5٪ ، 100 مل | Thermo Fisher Scientific | 25080-094 | |
| هيدروكسيد الصوديوم ، محلول هيدروكسيد الصوديوم ، 1 لتر | Thermo Fisher Scientific | SS266-1 | |
| مصل الحصان العادي (NHS) | مقص التشغيل Invitrogen | 16050130 | |
| Roboz Surgical Instruments Co. | RS-6806 | ||
| بارافورمالدهيد (PFA) ، درجة الكاشف ، بلوري | سيجما-ألدريتش | P6148 | قبل الاستخدام: إنشاء إجراءات تشغيل قياسية بناء على البروتوكولات المتاحة عبر |
| الإنترنت PBS ، درجة الحموضة 7.4 ، 500 مل | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 ؛ | الأوتوكلاف قبل الاستخدام |
| فالويدين ، أليكسا فلور 568 ؛ | الإعدادية Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| ، غير معقمة ؛ | Medline | 05136CS | |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات القفل الآمن ، البولي بروبيلين ، 0.5 مل | Eppendorf | 022363719 | الأوتوكلاف قبل الاستخدام |
| أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ذات القفل الآمن ، البولي بروبيلين ، 1.5 مل | Eppendorf | 022363204 | الأوتوكلاف قبل الاستخدام |
| شفرات المشرط - # 15 | أدوات العلوم الدقيقة | 10015-00 | |
| مقبض مشرط - # 4 | أدوات العلوم الدقيقة | 10004-13 | |
| Stemi 2000-C مجهر ستيريو | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| TCS SP5 مجهر متحد البؤر | Leica | N / A | |
| Triton-X (خافض للتوتر السطحي غير أيوني) | Integra | T756.30.30 | |
| تركيب VectaShield المضاد للبهتان لمختبرات Vector Laboratories | ، Inc. | حقيبة سحاب H-1000 | |
| ، قابلة لإعادة الإغلاق ، 4 × 6 بوصة - 2 مم | 0609132541599 | الانزلاق |
المراجع
- Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf (2000).
- Geleoc, G. S., Holt, J. R. Sound strategies for hearing restoration). Science. 344 (6184), 1241062(2014).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
