يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الفئران قصيرة محور البطين شرائح القلب للدراسات الكهربية

7.1K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/55725

⸱

يونيو 4, 2017

 ,  , 
1Department of Internal Medicine III, University of Cologne, 2Institute for Neurophysiology, University of Cologne

في هذه المقالة

ملخص

هنا، نحن تصف إعداد شرائح البطين قابلة للحياة من الفئران الكبار واستخدامها للالتسجيلات المحتملة عمل القطب حادة. هذه الاستعدادات متعددة الخلايا توفر الحفاظ عليها في الجسم الحي مثل هيكل الأنسجة، مما يجعلها نموذجا قيما للدراسات الكهربية والدوائية في المختبر .

الملخص

كارديوميوسيتس الفئران استخدمت على نطاق واسع للدراسات في المختبر من علم وظائف الأعضاء القلب واستراتيجيات علاجية جديدة. ومع ذلك، الاستعدادات متعددة الخلايا من كارديوميوسيتس فصلها ليست ممثلة للمجمع في هيكل الجسم الحي من العضلية، غير ميوسيتس والمصفوفة خارج الخلية، مما يؤثر على كل من الخصائص الميكانيكية والكهربية للقلب. هنا نحن تصف تقنية لإعداد شرائح البطين قابلة للحياة من قلوب الماوس الكبار مع الحفاظ عليها في الجسم الحي مثل هيكل الأنسجة، وإثبات مدى ملاءمتها للتسجيلات الكهربية. بعد استئصال القلب، يتم فصل البطينين من الأذينين، بيرفوسد مع كا 2 + خالية من الحل يحتوي على 2،3-بوتانيديون مونوكسيم وجزءا لا يتجزأ من كتلة الاغاروز ذوبان منخفضة 4٪. يتم وضع كتلة على مشراح مع شفرة تهتز، ويتم إعداد شرائح الأنسجة مع سمك 150-400 ميكرون حفظ الاهتزاز الحرةكنسي من شفرة في 60-70 هرتز وتحريك شفرة إلى الأمام ببطء ممكن. سمك شرائح يعتمد على مزيد من التطبيق. يتم تخزين شرائح في الجليد حل تيرود البارد مع 0.9 ملي كا 2 + و 2،3-بيوتانيديون مونوكسيمي (بدم) لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك، يتم نقل شرائح إلى 37 درجة مئوية دمم لمدة 30 دقيقة لغسل بدم. شرائح يمكن استخدامها للدراسات الكهربية مع أقطاب حادة أو صفائف القطب الصغير، لقياسات القوة لتحليل وظيفة مقلص أو للتحقيق في التفاعل من الخلايا الجذعية المستمدة من الخلايا الجذعية المستمدة والأنسجة المضيفة. لتسجيلات القطب حاد، يتم وضع شريحة في طبق الثقافة 3 سم ثقافة على لوحة التدفئة من المجهر المقلوب. يتم تحفيز شريحة مع القطب أحادي القطب، ويتم تسجيل إمكانات العمل داخل الخلايا من العضلية داخل شريحة مع القطب الزجاج حاد.

المقدمة

وقد استخدمت شرائح الأنسجة رقيقة في كثير من الأحيان في العلوم الأساسية منذ ياماموت و مكلوين أظهرت في عام 1966 أن النشاط الكهربائي لشرائح الدماغ والحفاظ عليه في المختبر 1 . ومنذ ذلك الحين، وقد أجريت الدراسات الكهربية والدوائية على شرائح من الدماغ 2 والكبد 3 والرئة 4 وأنسجة عضلة القلب 5 و 6 و 7 . وقد وصفت التسجيلات الأولى المشبك التصحيح في شرائح البطين من قلوب الفئران حديثي الولادة في عام 1990 8 ، ولكن هذه التقنية سقطت في غياهب النسيان لبعض الوقت. بعد أكثر من عقد واحد في وقت لاحق، أنشأت مجموعتنا طريقة جديدة لإعداد الفئران الجنينية 9 ، حديثي الولادة 10 والكبار 11 شرائح القلب. هذه شرائح الأنسجة قابلة للحياة يمكن استخدامها للتجارب الحادة (شريحة الكبارق يمكن زراعتها لعدة ساعات) أو تجارب الثقافة على المدى القصير (الجنينية وشرائح الوليد يمكن زراعتها لبضعة أيام). تظهر شرائح في الجسم الحي مثل الخصائص الكهربية وانتشار الإثارة متجانسة كما تقييمها من قبل إمكانات عمل القطب حاد والتسجيلات مجموعة القطب الصغير 11 . نظرا لمورفولوجيا "ثنائي الأبعاد"، فإنها تسمح بالوصول المباشر لأقطاب التسجيل إلى جميع مناطق البطين، مما يجعلها أداة مثيرة للاهتمام للتحقيقات الكهربية ويثير خيارات تجريبية جديدة بالمقارنة مع قلوب لانجندورفف بيرفوسد كاملة. استجابة المخدرات من شرائح إلى حاصرات قناة أيون مثل فيراباميل (L- نوع كا 2 + مانع القناة)، ليدوكين (نا + مانع القناة)، 4-أمينوبيريدين (غير انتقائي تعتمد على الجهد K + قناة مانع) و لينوبيردين (كنق K + -channel بلوكر) 9 ، 11 تتوافق مع الآثار المعروفة على كارديوميوسيتس فصلها. كشفت قياسات القوة متساوي القياس علاقة إيجابية قوة التردد واقترح بقوة وظيفة مقلص سليمة 10 . وأظهرت هذه النتائج أن شرائح البطين الفئران هي مناسبة كنموذج في المختبر الأنسجة للدراسات الفسيولوجية والدوائية. وعلاوة على ذلك، شرائح البطين من قلوب المتلقي في تركيبة مع تسجيلات قطب حاد أثبتت أن تكون أداة مفيدة جدا لتوصيف التكامل الكهربائي والميكانيكية، فضلا عن نضوج الجنين المزروع 12 ، 13 ، 14 والخلايا الجذعية 15 المستمدة من الخلايا الجذعية.

باختصار، شرائح البطين هي قيمة ونموذج الأنسجة متعدد الخلايا إنشاء جيدا، وينبغي أن تعتبر مكملة ل كارديوميوسيتس فصل وقلوب لانجندورفف بيرفوسدفي أبحاث القلب والأوعية الدموية، مع ميزة كبيرة لتوفير في الجسم الحي مثل هيكل الأنسجة (على النقيض من الخلايا فصل)، وكذلك الوصول المباشر للتكنولوجيات القياس مثل تسجيلات القطب حاد لجميع مناطق القلب (على النقيض من الاستعدادات القلب كله).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

يجب أن يكون التعامل مع الحيوانات مطابقة للمبادئ التوجيهية للجنة رعاية الحيوان المحلية والتوجيه 2010/63 / الاتحاد الأوروبي للبرلمان الأوروبي.

1. إعداد الحلول

  1. إعداد حل تيرود دون كا 2 + (تكوين في مم): كلوريد الصوديوم 136، بوكل 5.4، ناه 2 بو 4 0.33، مغكل 2 1، الجلوكوز 10، هيبيس 5، 2،3-بيوتانيديون مونوكسيمي (بدم) 30. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم عند 4 درجات مئوية.
  2. إعداد حل تيرود مع كا 2 + (تكوين في مم): كلوريد 136، بوكل 5.4، ناه 2 بو 4 0.33، مغكل 2 1، الجلوكوز 10، هيبيس 5، بدم 30، كاكل 2 0.9. ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم في 4 درجات مئوية.
  3. إعداد 4٪ منخفضة تذوب أغاروس: ضع 0.6 غرام ذوبان منخفضة الاغاروز في 15 مل حل تيرود دون كا 2 + . تسخين الخليط في فرن الميكروويف مرتين في 750 واط لمدة 10-15 ثانية حتى يتم حل الاغاروز. الحفاظ على الحل في درجة حرارة ثابتة من 37 &# 176؛ C ويقلب باستمرار.
  4. الحفاظ على تعديل دولبيكو النسر المتوسطة (دمم) دون مصل في 37 درجة مئوية فقاعات مع الكربوجين (5٪ كو 2 ، 95٪ O 2 ).

2. إعداد مشراح

  1. التبديل على مشراح.
  2. ملء غرفة مشراح الخارجي مع الجليد.
  3. ملء الغرفة مشراح الداخلية مع الجليد حل تيرود البارد دون كا 2 + وبشكل مستمر الأوكسجين الحل مع 100٪ O 2 .
  4. وضع شفرة الصلب في حامل شفرة مشراح.

3. الماوس عزل القلب

  1. حقن 2500 U هيبارين تحت الجلد. انتظر 15 دقيقة.
  2. التضحية الحيوان عن طريق خلع عنق الرحم.
  3. فتح الصدر عن طريق القص.
  4. تشريح بعناية التامور باستخدام مقص صغير وملقط # 5.
  5. إدراج قنية في الشريان الأورطي الصاعد وإرواء الشرايين التاجية في الموقع مع الجليد البارد تيرود لالحل دون كا 2 + حتى تتم إزالة الدم المتبقية.
  6. بلطف قلب القلب مع ملقط ومقص ونقل القلب في الجليد الباردة حل تايرود ركب دون كا 2 + .
  7. فصل الأذينين من البطينين مع مشرط أو مقص.

4. تضمين البطينين في 4٪ منخفضة تذوب أغاروس

  1. وضع البطينين مع قمة تواجه صعودا في قالب الاغاروز ( الشكل 1 ). وضع دبوس في منتصف القالب في غرفة البطين الأيسر.
  2. ملء القالب مع الاغاروز ذوبان منخفضة 4٪ عند 37 درجة مئوية، حتى يتم تغطية القلب تماما.
  3. وضع القالب على الجليد لسرعة تصلب أغاروس منع العائمة من الأنسجة.
  4. إزالة كتلة الاغاروز التي تحتوي على البطينين من القالب مع مشرط.
  5. تحويل كتلة رأسا على عقب وملء غرف البطين والفجوة على المؤخر من كتلة الاغاروز، والتي أناs اليسار من قبل دبوس من مولت، مع 4٪ منخفضة تذوب الاغاروز باستخدام حقنة مع 20 G إبرة.
  6. تقليم كتلة أغاروس مع مشرط لتحقيق أسفل مسطح للكتلة ووضع مستقيم من قمة القلب.

5. تشريح الأنسجة البطين

  1. إصلاح كتلة على حامل عينة من مشراح مع قطرة من الغراء سيانوكريلات. تواجه قمة القلب صعودا.
  2. وضع حامل العينة في غرفة العينة الداخلية من مشراح، والتي هي مليئة تيرود الجليد الباردة دون كا 2 + . تغطية تماما كتلة الاغاروز مع حل تيرود ل.
  3. إعداد شرائح محور قصير بسمك 150-400 ميكرون، اعتمادا على مزيد من التطبيق (لتسجيلات قطب حاد 150-200 ميكرون)، والحفاظ على تردد الاهتزاز من شفرة في 60-70 هرتز ونقل شفرة إلى الأمام ببطء ممكن .
  4. استخدام فرشاة غرامة لإزالة بعناية الاغاروز المتبقية من شرائح.
  5. ترانسف بلطفr شرائح مع ماصة باستور في حل تايرود مع 0.9 ملي كا 2 + تهوية مع 100٪ O 2 وتخزينها لمدة 30 دقيقة على الأقل على الجليد للتعافي من إجراء تشريح.
  6. بعد ذلك، والحفاظ على شرائح لمدة 30 دقيقة في دمم عند 37 درجة مئوية، تهوية مع كاربوجين، لغسل بدم قبل مزيد من الاستخدام.

6. إعداد إعداد القطب حاد

  1. قبل التسخين، والتبديل على جميع الأجهزة الكهربائية 30 دقيقة قبل بدء التسجيلات.
  2. وضع 3 سم طبق ثقافة الخلية على لوحة التدفئة وضعت على المجهر المقلوب.
  3. وضع حسب الطلب القطب الكهربائي ( الشكل 2 ) في الطبق وتوصيل أسلاك التأريض من قبل مكبر للصوت والقطب التحفيز.
  4. ربط أنابيب مرنة من نظام نضح إلى الطبق.
  5. ملء خزان نظام نضح مع دمم، تهوية مع كاربوجين.
  6. التبديل على مضخة نضح وتعيين نضح راتي إلى 2-3 مل / دقيقة.
  7. ضبط درجة الحرارة من دمم في الطبق إلى 37 درجة مئوية عن طريق تنظيم سخان التدفق ولوحة التدفئة.

7. عمل التسجيلات المحتملة

  1. وضع شريحة البطين في طبق دمم شغلها.
  2. التحقق من سلامة الهيكلية وجدوى (على أساس وظيفة مقلص) من الأنسجة مع المجهر المقلوب.
  3. ملء القطب الزجاج تسجيل مع 3 M كل.
  4. ملء القطب التحفيز مع دمم.
  5. وضع القطب تسجيل والتحفيز الكهربائي على حاملي القطب.
  6. وضع القطب التحفيز بعناية على شريحة والتبديل على مشجعا الكهربائية. تبدأ مع تردد التحفيز من 1-2 هرتز.
  7. حرك القطب تسجيل مع ميكرومانيبولاتور على موقف تسجيل المقصود.
  8. انخفاض ببطء في تسجيل القطب حتى يلمس طرف الأنسجة.
  9. تطبيق نبض كهربائي مستطيلة قصيرة من خلالتسجيل القطب لاختراق غشاء الخلية.
  10. إعادة بعناية القطب تسجيل حتى يتم ضمان إشارة مستقرة.
  11. بدء تسجيل إمكانات العمل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

احتشاء عضلة القلب يؤدي إلى فقدان لا رجعة فيه تقريبا من العضلية. العلاج استبدال الخلايا باستخدام الخلايا الجذعية المستمدة من الخلايا الجذعية لتجديد القلب الخارجية هو نهج علاجي واعد. التكامل الكهربائي والنضج من الخلايا المزروعة هي حاسمة لسلامة وكفاءة العلاج استبدال الخلايا.

لتقييم التكامل والنضج، قمنا بزرع الخلايا العضلية المستمدة من الخلايا الجذعية ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

شرائح البطين تمكن الكهربية والدراسات الدوائية والميكانيكية مع الحفاظ عليها في الجسم الحي مثل هيكل الأنسجة والوصول المباشر للتكنولوجيا القياس إلى جميع مناطق القلب. وقد أظهرت الخصائص الفسيولوجية العمل المحتملة في الجنينية، حديثي الولادة والشرائح الكبار 9 ، 10 ، 11 . حيوية من شرائح، باستثناء طبقات السطح تضررت مباشرة من قبل إجراء تشريح، وقد أكد من قبل تلطيخ حيوية 9<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

المؤلفين ليس لديهم ما يعلن.

شكر وتقدير

ونحن نقر بالدعم الذي قدمته ورش العمل والمرفق الحيوانى لمعهد الفيزيولوجيا العصبية. وأيد هذا العمل من قبل والتر أوند مارغا بول ستيفتنغ، كولن فورتشن ودويتشه ستيفتنغ فور هيرزفورسشونغ.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Leica VT 1000sLeica Microsystems ، Wetzlar ، ألمانياMicrotome بشفرة اهتزازية.
شفرات الفولاذ المقاوم للصدأكامبدن إنسترومنتس، لوبورو، إنجلترا7550-1-SS
ماصات باستورسيجما ألدريتش ، سانت لويز ، الولايات المتحدة الأمريكيةZ627992
فرشاة دقيقة ، على سبيل المثال < / em> مقاس 6 (4/32 بوصة)VWR ، دولي ، رادنور ، الولايات المتحدة الأمريكية149-2125
طاولةذاتية
الصنع Molt لتضمين البطينين في agaroseذاتي الصنع
1 مل حقنةبيكتون ، ديكنسون. بحيرات فرانكلين ، الولايات المتحدة الأمريكية300013
27 جم × 3/4 بوصة إبربراون ، ميلسونجن ، ألمانيا4657705
20 جم 11/2 بوصة إبر4657519
مقص صغيرWPI ، ساراسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية501263
ملاقط # 5 ، طرف 0.1 × 0.06 ممWPI ، ساراسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية500342
غاز الأكسجين (درجة طبية O2< / sub>)Linde، ميونيخ ، ألمانيا
غاز الكربوجين (95٪ O2< / sub> ، 5٪ CO2)Linde ، ميونيخ ، ألمانيا
NaClSigma-Aldrich ، سانت لويز ، الولايات المتحدة الأمريكية7647-14-5
KClSigma-Aldrich ، سانت لويز ، الولايات المتحدة الأمريكية746436
CaCl2Sigma-Aldrich ، سانت لويز ، الولايات المتحدة الأمريكية746495
KH2PO4Sigma-Aldrich, St. Louise, USANIST200B
HEPESSigma-Aldrich, St. Louise, USA51558
NaHCO3Sigma-Aldrich, St. Louise, USAS5761
D(+)-GlucoseSigma-Aldrich, St. Louise, USAG8270
MgSO4سيجما ألدريتش ، سانت لويز ، الولايات المتحدة الأمريكيةM7506
NaOHسيجما ألدريتش ، سانت لويز ، الولايات المتحدة الأمريكيةS8045
غراء سيانواكريليتHenkel ، D & uuml ؛ سلدورف ، ألمانيا
Agarose Roth منخفض الذوبان، كارلسروه ، ألمانيا6351.2
هيبارين صوديوم -25000 IE / 5 ملRatiopharm ، Ulm ، ألمانيا
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) ، ارتفاع الجلوكوز ، GlutaMAXThermoScientific ، Waltham ، الولايات المتحدة الأمريكية10566016
SEC-10LX مكبر للصوتnpi إلكتروني GmbH ، تام ، ألمانياSEC-10LX
EPC 9HEKA Elektronik GmbH ، لامبريخت ، ألمانيا
Zeiss Axiovert 200Zeiss ، Oberkochen ، ألمانيا
التكبير المنخفضNarashige ، طوكيو ، اليابانNm-3
التكبير العالي ، معالج دقيق ثلاثي المحاورNarashige ، طوكيو ، اليابانMHW-3
مضخةالتروية التمعجيةأنظمة متعددة القنوات ، رويتلينجن ، ألمانياPPS2
2-قناة تحكم في درجة الحرارةأنظمة متعددة القنوات ، رويتلينجن ، ألمانياTCO02
محفز النبض المربعNatus Europe GmbH ، Planegg ، ألمانياالعشب SD9
الشعيرات الدمويةالزجاجية WPI ، ساراسوتا ، الولايات المتحدة الأمريكية1B150F-1
تحضير جهاز

المراجع

  1. Yamamoto, C., McIlwain, H. Electrical activities in thin sections from the mammalian brain maintained in chemically-defined media in vitro. J Neurochem. 13, 1333-1343 (1966).
  2. Colbert, C. M. Preparation of cortical brain slices for electrophysiological recording. Methods Mol Biol. 337, 117-125 (2006).
  3. Ad Graaf, I., Groothuis, G. M., Olinga, P. Precision-cut tissue slices as a tool to predict metabolism of novel drugs. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 3, 879-898 (2007).
  4. Kim, Y. H., et al. Cardiopulmonary toxicity of peat wildfire particulate matter and the predictive utility of precision cut lung slices. Part Fibre Toxicol. 11, 29(2014).
  5. Nembo, E. N., et al. In vitro chronotropic effects of Erythrina senegalensis DC (Fabaceae) aqueous extract on mouse heart slice and pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. J Ethnopharmacol. 165, 163-172 (2015).
  6. Wang, K., et al. Cardiac tissue slices: preparation, handling, and successful optical mapping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 308, H1112-H1125 (2015).
  7. Bussek, A., et al. Tissue slices from adult mammalian hearts as a model for pharmacological drug testing. Cell Physiol Biochem. 24, 527-536 (2009).
  8. Burnashev, N. A., Edwards, F. A., Verkhratsky, A. N. Patch-clamp recordings on rat cardiac muscle slices. Pflugers Arch. 417, 123-125 (1990).
  9. Pillekamp, F., et al. Establishment and characterization of a mouse embryonic heart slice preparation. Cell Physiol Biochem. 16, 127-132 (2005).
  10. Pillekamp, F., et al. Neonatal murine heart slices. A robust model to study ventricular isometric contractions. Cell Physiol Biochem. 20, 837-846 (2007).
  11. Halbach, M., et al. Ventricular slices of adult mouse hearts--a new multicellular in vitro model for electrophysiological studies. Cell Physiol Biochem. 18, 1-8 (2006).
  12. Halbach, M., et al. Electrophysiological maturation and integration of murine fetal cardiomyocytes after transplantation. Circ. Res. 101, 484-492 (2007).
  13. Halbach, M., et al. Time-course of the electrophysiological maturation and integration of transplanted cardiomyocytes. J. Mol. Cell Cardiol. 53, 401-408 (2012).
  14. Halbach, M., et al. Cell persistence and electrical integration of transplanted fetal cardiomyocytes from different developmental stages. Int. J. Cardiol. 171, e122-e124 (2014).
  15. Halbach, M., et al. Electrophysiological integration and action potential properties of transplanted cardiomyocytes derived from induced pluripotent stem cells. Cardiovasc. Res. 100, 432-440 (2013).
  16. Verrecchia, F., Herve, J. C. Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes. Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).
  17. Watanabe, Y., et al. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).
  18. Fleischmann, B. K., et al. Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development. J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).
  19. Peinkofer, G., et al. From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الفئران قصيرة محور البطين شرائح القلب للدراسات الكهربية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.