نحن تقرير بروتوكولات مزامنة الخلية التي توفر سياق لدراسة الأحداث المتعلقة مراحل محددة من دورة الخلية. وتبين لنا أن هذا النهج مفيد لتحليل تنظيم جينات محددة في دورة الخلية غير المضطربة أو عند التعرض للعوامل التي تؤثر على دورة الخلية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
دراسة الخلية التعبير عن تنظيم دورة الجينات من قبل اثنين من بروتوكولات التزامن الخلية التكميلية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
يمثل برنامج التعبير الجيني لدورة الخلية خطوة حاسمة لفهم العمليات المعتمدة على دورة الخلية ودورها في أمراض مثل السرطان. وينظم تحليل التعبير الجيني خلية تنظيم دورة على تزامن الخلية في مراحل محددة. نحن هنا وصف طريقة باستخدام اثنين من بروتوكولات التزامن التكميلية التي تستخدم عادة لدراسة الاختلاف الدوري للتعبير الجيني خلال دورة الخلية. ويستند كلا الإجراءين على عرقلة عابرة دورة الخلية في نقطة واحدة محددة. بروتوكول التزامن من قبل العلاج هيدروكسي يوريا (هو) يؤدي إلى الاعتقال الخلوي في أواخر G1 / مرحلة مبكرة S، والإفراج عن اعتقال بوساطة هو يوفر السكان الخلوية تتقدم بشكل موحد من خلال S و G2 / M. بروتوكول التزامن من قبل ثيميدين و نوكودازول (ثي-نوك) خلايا كتل العلاج في الانقسام المبكر، والإفراج عن ثي-نوك بوساطة اعتقال يوفر السكان الخلوية متزامنة مناسبة ل G1 المرحلة و S المرحلة إنحاول الدراسات. تطبيق كلا الإجراءين يتطلب رصد ملامح توزيع دورة الخلية، والتي يتم تنفيذها عادة بعد بروديبيوم يوديد (بي) تلطيخ الخلايا وتدفق الخلوي تحليل بوساطة محتوى الحمض النووي. وتبين لنا أن الجمع بين استخدام اثنين من بروتوكولات التزامن هو نهج قوي لتحديد واضح ملامح النسخي من الجينات التي تنظم بشكل مختلف في دورة الخلية ( أي E2F1 و E2F7)، وبالتالي للحصول على فهم أفضل لدورها في دورة الخلية العمليات. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن هذا النهج هو مفيد لدراسة الآليات الكامنة وراء العلاجات القائمة على المخدرات ( أي ميتوميسين C، عامل مضاد للسرطان)، لأنه يسمح للتمييز الجينات التي تستجيب لعامل السمية الجينية من تلك المتضررة فقط من اضطرابات دورة الخلية التي يفرضها الوكيل.
المقدمة
يقترن الانتقال من خلال جميع مراحل دورة الخلية إلى برنامج التعبير الجيني منظم بإحكام. ويعتقد أن هذا التنسيق "داخل وخارج" من النسخ الجيني في جميع أنحاء دورة الخلية لتكون تحت سيطرة النظم التنظيمية النسخي المعقدة، وتنظيم ليس فقط توقيت ولكن أيضا مستويات التعبير الجيني. ومن المعروف أن إزالة الضوابط من مكونات دورة الخلية الرئيسية للمساهمة في تطوير العديد من الأمراض وهو سمة راسخة جيدا من الأورام 1 ، 2 . كشفت التحاليل ترانسكريبتوميك على نطاق الجينوم التي أجريت في الخميرة وخلايا الثدييات أن عددا كبيرا من الجينات تظهر أنماط التعبير الجيني الدوري في دورة الخلية، مما يشير إلى أن الت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الخلوية التزامن والإفراج عن ورصد دورة الخلية التقدم
- Thymidine- و نوكودازول القائم (ثي-نوك) تزامن والإفراج عن خلايا U2OS من ميتوسيس
- إعداد المطلوبة وسط ثقافة الخلية. وتزرع الخلايا U2OS بشكل روتيني في وسط دمم الجلوتامين تكمل مع 10٪ (فول / فول) فبس (اختياري: 1٪ البنسلين / الستربتومايسين). تنفيذ جميع التحضير المتوسطة والتلاعب تحت ظروف معقمة والاحماء تكملة المتوسطة (من الآن فصاعدا المشار إليها باسم "المتوسطة كاملة") إلى 37 درجة مئوية قبل....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تمثيل تخطيطي للبروتوكولات الخاصة بك و هي-هو لتزامن الخلية.
يلخص الشكل 1 الخطوات المطلوبة لتزامن خلية U2OS وجمع العينات اللاحقة من أجل التحقق من التقدم من خلال دورة الخلية وإجراء تحليلات التعبير الجيني.
فوسفهو-H3 و بي تلطيخ هي معايير تقيي.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويتطلب تحليل الجينات المنظمة الدقيقة التي تنطوي على أدوار عابرة ومحددة في دورة الخلية وجود خلية موحدة. يستخدم العديد من الباحثين بشكل روتيني خطوط الخلايا السرطانية الطويلة الأمد لهذه الأغراض، وقد تم تطوير مجموعة متنوعة من الأساليب للحصول على سكان الخلية المتزامنة (أو المتزامنة جزئيا)، بهدف تجميع أكبر عدد ممكن من الخلايا في مراحل دورة الخلية المحددة. وعلاوة على ذلك، بذلت جهود قوية لتحسين وتحسين نهج المزامنة الراسخة. ومع ذلك، فإن جميع بروتوكولات التزامن لها عيوب، يمكن أن تعزى إلى عد.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
ونشكر أعضاء مختبرات زوبياغا ومختبرات ألتمير على المناقشات المفيدة والدعم التقني. وأيد هذا العمل من خلال منح مقدمة من الوزارة الإسبانية (SAF2015-67562-R، مينيكو / فيدر، إي)، وحكومة الباسك (IT634-13 و كك-2015/89)، وجامعة الباسك أوب / إهو ( UFI11 / 20).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، مكمل GutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 61965-059 | |
| FBS ، مؤهل ، معتمد من الاتحاد الأوروبي ، من أمريكا الجنوبية | منشأ Thermo Fisher Scientific | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U / mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| 0.25٪ Trypsin-EDTA (1x) ، الفينول الأحمر | Thermo Fisher Scientific | 25200-072 | |
| ثيميدين | سيجما | T1895-5G | طازج. قد يساعد الاحترار الطفيف في إذابة الثايميدين. |
| Nocodazole | SIGMA | M-1404 | محلول المخزون في DMSO المخزن في -20 & ordm ؛ C في aliquots صغيرة |
| Hydroxyurea | SIGMA | H8627 | |
| Mitomycin C المحضرة حديثا من Streptomyces caespitosus | SIGMA | M4287 | محلول مخزون 1.5 ملي مولار في H2< / sub>O معقم محمي من الضوء ومخزنة في 4 & ordm; C |
| ثنائي ميثيل سلفوكسيد | SIGMA | D2650 | |
| بروبيديوم يوديد | SIGMA | P4170 | محلول مخزون في PBS معقم عند 5 مجم / مل ، مخزن في 4 & ordm ؛ C محمي من الضوء. |
| PBS درجة الحموضة 7.6 | محلية الصنع | ||
| الإيثانول | PANREAC | A3678،2500 | |
| الكلوروفورم | SIGMA | C2432 | |
| سترات الصوديوم | PANREAC | 131655 | |
| تريتون X-100 | SIGMA | T8787 | |
| RNAse A | ثيرمو فيشر العلمي | EN0531 | |
| كاشف | ثلاثي الزولLifeTechnologies | 15596018 | |
| RNeasy Mini kit | QIAGEN | 74106 | |
| النسخ العكسي cDNA عالية السعة | Thermo Fisher Scientific | 4368814 | |
| Anti-Cyclin E1 | إشارات الخلية | 4129 | 1: 1000 تخفيف في 5٪ حليب ، O / n ، 4 & ordm ؛ C |
| المضادة للسيكلين B1 | الأجسام المضادة لخلية | 4135 | 1: 1000 التخفيف في 5٪ حليب ، o / n ، 4 & ordm ؛ C |
| مضاد للبيتا | SIGMA | A-5441 | 1: 3000 تخفيف في 5٪ حليب ، 1 ساعة ، RT |
| Anti-pH3 (Ser 10) antiboty | Millipore | 06-570 | محدد في البروتوكول |
| الثانوي المضاد للأرانب AlexaFluor 488 الجسم المضاد | Invitrogen | R37116 | المحدد في البروتوكول |
| الجسم المضاد الثانوي المضاد للفأر HRP | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | sc-3697 | 1: 3000 تخفيف في 5٪ حليب ، 1 ساعة ، RT |
| Forward E2F1 الجسم المضاد (الإنسان) ؛ TGACATCACCAACGTCCTTGA | Biolegio | مصمم بواسطة أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| الجسم المضاد العكسي E2F1 (الإنسان) CTGTGCGAGGTCCTGGGTC | Biolegio | مصمم بواسطة أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| الجسم المضاد E2F7 الأمامي (الإنسان) GGAAAGCACACACACAACTCT | Biolegio | صممه أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| الجسم المضاد العكسي E2F7 (الإنسان) TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAGA | Biolegio | صممه أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Forward p21Cip1 antibody (human) AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC | Biolegio | صمم بواسطة أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| عكس p21Cip1 الأجسام المضادة (الإنسان) TTTCGACCCTGAGTCTCCAG | Biolegio | صممه أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) الجين | |
| المرجعي للجسم المضاد TBP (البشري) إلى الأمام | Biolegio | مصمم بواسطة أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| الجسم المضاد TBP العكسي (الإنساني) | Biolegio | مصمم بواسطة أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| الجين المرجعي للجسم المضاد Oxa1L (الإنسان) CACTTGCCAGAGATCCAGAAG | Biolegio | صممه أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Reverse Oxa1L الجسم المضاد (الإنسان) CACAGGGAGAATGAGGTTTATAG | Biolegio | مصمم بواسطة أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) | |
| Power SYBRGreen PCR Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4368702 | |
| FACS Tubes | Sarstedt | 551578 | |
| MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate | Thermo Fisher Scientific | N8010560 | |
| Corning 100 مم طبق ثقافة معالج TC | Corning Corning | ||
| Costar Cell Culture Plates 6 well | Corning | 3506 | |
| أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المبردة | Eppendorf | 5415 R | |
| جهاز طرد مركزي مبرد على مقاعد البدلاء Jouan CR3.12 | Jouan | 743205604 | |
| NanoDrop Lite مقياس الطيف الضوئي | الحراري العلمي | ND-LITE-PR | |
| BD FACSمقياس التدفق الخلوي BD | Bioscience | ||
| QuantStudio 3 نظام PCR في الوقت | الحقيقي Thermo Fisher Scientific | A28567 |
المراجع
- Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
- Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
- Cho, ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
