Method Article

دراسة الخلية التعبير عن تنظيم دورة الجينات من قبل اثنين من بروتوكولات التزامن الخلية التكميلية

DOI:

10.3791/55745

⸱

June 6th, 2017

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease, University of Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن تقرير بروتوكولات مزامنة الخلية التي توفر سياق لدراسة الأحداث المتعلقة مراحل محددة من دورة الخلية. وتبين لنا أن هذا النهج مفيد لتحليل تنظيم جينات محددة في دورة الخلية غير المضطربة أو عند التعرض للعوامل التي تؤثر على دورة الخلية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمثل برنامج التعبير الجيني لدورة الخلية خطوة حاسمة لفهم العمليات المعتمدة على دورة الخلية ودورها في أمراض مثل السرطان. وينظم تحليل التعبير الجيني خلية تنظيم دورة على تزامن الخلية في مراحل محددة. نحن هنا وصف طريقة باستخدام اثنين من بروتوكولات التزامن التكميلية التي تستخدم عادة لدراسة الاختلاف الدوري للتعبير الجيني خلال دورة الخلية. ويستند كلا الإجراءين على عرقلة عابرة دورة الخلية في نقطة واحدة محددة. بروتوكول التزامن من قبل العلاج هيدروكسي يوريا (هو) يؤدي إلى الاعتقال الخلوي في أواخر G1 / مرحلة مبكرة S، والإفراج عن اعتقال بوساطة هو يوفر السكان الخلوية تتقدم بشكل موحد من خلال S و G2 / M. بروتوكول التزامن من قبل ثيميدين و نوكودازول (ثي-نوك) خلايا كتل العلاج في الانقسام المبكر، والإفراج عن ثي-نوك بوساطة اعتقال يوفر السكان الخلوية متزامنة مناسبة ل G1 المرحلة و S المرحلة إنحاول الدراسات. تطبيق كلا الإجراءين يتطلب رصد ملامح توزيع دورة الخلية، والتي يتم تنفيذها عادة بعد بروديبيوم يوديد (بي) تلطيخ الخلايا وتدفق الخلوي تحليل بوساطة محتوى الحمض النووي. وتبين لنا أن الجمع بين استخدام اثنين من بروتوكولات التزامن هو نهج قوي لتحديد واضح ملامح النسخي من الجينات التي تنظم بشكل مختلف في دورة الخلية ( أي E2F1 و E2F7)، وبالتالي للحصول على فهم أفضل لدورها في دورة الخلية العمليات. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن هذا النهج هو مفيد لدراسة الآليات الكامنة وراء العلاجات القائمة على المخدرات ( أي ميتوميسين C، عامل مضاد للسرطان)، لأنه يسمح للتمييز الجينات التي تستجيب لعامل السمية الجينية من تلك المتضررة فقط من اضطرابات دورة الخلية التي يفرضها الوكيل.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يقترن الانتقال من خلال جميع مراحل دورة الخلية إلى برنامج التعبير الجيني منظم بإحكام. ويعتقد أن هذا التنسيق "داخل وخارج" من النسخ الجيني في جميع أنحاء دورة الخلية لتكون تحت سيطرة النظم التنظيمية النسخي المعقدة، وتنظيم ليس فقط توقيت ولكن أيضا مستويات التعبير الجيني. ومن المعروف أن إزالة الضوابط من مكونات دورة الخلية الرئيسية للمساهمة في تطوير العديد من الأمراض وهو سمة راسخة جيدا من الأورام 1 ، 2 . كشفت التحاليل ترانسكريبتوميك على نطاق الجينوم التي أجريت في الخميرة وخلايا الثدييات أن عددا كبيرا من الجينات تظهر أنماط التعبير الجيني الدوري في دورة الخلية، مما يشير إلى أن الت....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الخلوية التزامن والإفراج عن ورصد دورة الخلية التقدم

  1. Thymidine- و نوكودازول القائم (ثي-نوك) تزامن والإفراج عن خلايا U2OS من ميتوسيس
    1. إعداد المطلوبة وسط ثقافة الخلية. وتزرع الخلايا U2OS بشكل روتيني في وسط دمم الجلوتامين تكمل مع 10٪ (فول / فول) فبس (اختياري: 1٪ البنسلين / الستربتومايسين). تنفيذ جميع التحضير المتوسطة والتلاعب تحت ظروف معقمة والاحماء تكملة المتوسطة (من الآن فصاعدا المشار إليها باسم "المتوسطة كاملة") إلى 37 درجة مئوية قبل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمثيل تخطيطي للبروتوكولات الخاصة بك و هي-هو لتزامن الخلية.

يلخص الشكل 1 الخطوات المطلوبة لتزامن خلية U2OS وجمع العينات اللاحقة من أجل التحقق من التقدم من خلال دورة الخلية وإجراء تحليلات التعبير الجيني.

فوسفهو-H3 و بي تلطيخ هي معايير تقيي.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتطلب تحليل الجينات المنظمة الدقيقة التي تنطوي على أدوار عابرة ومحددة في دورة الخلية وجود خلية موحدة. يستخدم العديد من الباحثين بشكل روتيني خطوط الخلايا السرطانية الطويلة الأمد لهذه الأغراض، وقد تم تطوير مجموعة متنوعة من الأساليب للحصول على سكان الخلية المتزامنة (أو المتزامنة جزئيا)، بهدف تجميع أكبر عدد ممكن من الخلايا في مراحل دورة الخلية المحددة. وعلاوة على ذلك، بذلت جهود قوية لتحسين وتحسين نهج المزامنة الراسخة. ومع ذلك، فإن جميع بروتوكولات التزامن لها عيوب، يمكن أن تعزى إلى عد.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونشكر أعضاء مختبرات زوبياغا ومختبرات ألتمير على المناقشات المفيدة والدعم التقني. وأيد هذا العمل من خلال منح مقدمة من الوزارة الإسبانية (SAF2015-67562-R، مينيكو / فيدر، إي)، وحكومة الباسك (IT634-13 و كك-2015/89)، وجامعة الباسك أوب / إهو ( UFI11 / 20).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، مكمل GutaMAXThermo Fisher Scientific61965-059
FBS ، مؤهل ، معتمد من الاتحاد الأوروبي ، من أمريكا الجنوبيةمنشأ Thermo Fisher Scientific10270-106
Penicillin-Streptomycin (10,000 U / mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
0.25٪ Trypsin-EDTA (1x) ، الفينول الأحمرThermo Fisher Scientific25200-072
ثيميدينسيجماT1895-5Gطازج. قد يساعد الاحترار الطفيف في إذابة الثايميدين.
NocodazoleSIGMAM-1404محلول المخزون في DMSO المخزن في -20 & ordm ؛ C في aliquots صغيرة
HydroxyureaSIGMAH8627
Mitomycin C المحضرة حديثا من Streptomyces caespitosusSIGMAM4287محلول مخزون 1.5 ملي مولار في H2< / sub>O معقم محمي من الضوء ومخزنة في 4 & ordm; C
ثنائي ميثيل سلفوكسيدSIGMAD2650
بروبيديوم يوديدSIGMAP4170محلول مخزون في PBS معقم عند 5 مجم / مل ، مخزن في 4 & ordm ؛ C محمي من الضوء.
PBS درجة الحموضة 7.6محلية الصنع
الإيثانولPANREACA3678،2500
الكلوروفورمSIGMAC2432
سترات الصوديومPANREAC131655
تريتون X-100SIGMAT8787
RNAse Aثيرمو فيشر العلميEN0531
كاشفثلاثي الزولLifeTechnologies15596018
RNeasy Mini kitQIAGEN74106
النسخ العكسي cDNA عالية السعةThermo Fisher Scientific4368814
Anti-Cyclin E1إشارات الخلية41291: 1000 تخفيف في 5٪ حليب ، O / n ، 4 & ordm ؛ C
المضادة للسيكلين B1الأجسام المضادة لخلية41351: 1000 التخفيف في 5٪ حليب ، o / n ، 4 & ordm ؛ C
مضاد للبيتاSIGMAA-54411: 3000 تخفيف في 5٪ حليب ، 1 ساعة ، RT
Anti-pH3 (Ser 10) antibotyMillipore06-570محدد في البروتوكول
الثانوي المضاد للأرانب AlexaFluor 488 الجسم المضادInvitrogenR37116المحدد في البروتوكول
الجسم المضاد الثانوي المضاد للفأر HRPسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-36971: 3000 تخفيف في 5٪ حليب ، 1 ساعة ، RT
Forward E2F1 الجسم المضاد (الإنسان)   ؛                                     TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegioمصمم بواسطة أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
الجسم المضاد العكسي E2F1 (الإنسان)                                      CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegioمصمم بواسطة أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
الجسم المضاد E2F7 الأمامي (الإنسان)                                      GGAAAGCACACACACAACTCTBiolegioصممه أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
الجسم المضاد العكسي E2F7 (الإنسان)                                       TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAGABiolegioصممه أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 antibody (human)                                      AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegioصمم بواسطة أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
عكس p21Cip1 الأجسام المضادة (الإنسان)                                      TTTCGACCCTGAGTCTCCAGBiolegioصممه أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site) الجين
المرجعي للجسم المضاد TBP (البشري) إلى الأمام                                        Biolegioمصمم بواسطة أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
الجسم المضاد TBP العكسي (الإنساني)                                        Biolegioمصمم بواسطة أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
الجين المرجعي للجسم المضاد Oxa1L (الإنسان)     CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                                 Biolegioصممه أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L   الجسم المضاد (الإنسان)      CACAGGGAGAATGAGGTTTATAG                               Biolegioمصمم بواسطة أداة PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master MixThermo Fisher Scientific4368702
FACS Tubes Sarstedt551578
MicroAmp Optical 96-Well Reaction PlateThermo Fisher ScientificN8010560
Corning 100 مم طبق ثقافة معالج TCCorning Corning
Costar Cell Culture Plates 6 wellCorning3506
أجهزة الطرد المركزي الدقيقة المبردةEppendorf5415 R
جهاز طرد مركزي مبرد على مقاعد البدلاء Jouan CR3.12Jouan743205604
NanoDrop Lite مقياس الطيف الضوئيالحراري العلميND-LITE-PR
BD FACSمقياس التدفق الخلوي BDBioscience
QuantStudio 3 نظام PCR في الوقتالحقيقي Thermo Fisher ScientificA28567
مجموعة إشارات

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
  2. Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
  3. Cho, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle SynchronizationHydroxyurea TreatmentThymidine NocodazoleFlow Cytometry AnalysisGene Expression AnalysisRNA Extraction ProtocolPropidium Iodide StainingU2OS CellsMitotic Cell ArrestG1 S Boundary

Related Articles