مقالة منهجية

جليكونجينيرينج الأيض حمض اللعابي استخدام N-الأسيل-تعديل مانوسامينيس

DOI:

10.3791/55746

⸱

نوفمبر 25, 2017

 , 
1Max von Pettenkofer-Institut & Genzentrum, Virologie, Nationales Referenzzentrum für Retroviren, Medizinische Fakultät, LMU München, 2Institut für Laboratoriumsmedizin, klinische Chemie und Pathobiochemie, Charité - Universitätsmedizin Berlin, 3Institut für Physiologische Chemie, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حمض اللعابي وحدة أحادي نموذجية الموجودة في جليكوكونجوجاتيس. أنها تشارك في عدد كبير تفاعلات الجزيئية والخلوية. هنا نقدم طريقة لتعديل التعبير الحامض اللعابي سطح الخلية باستخدام جليكونجينيرينج الأيضية مع مشتقات N-أسيتيلمانوساميني.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حمض اللعابي (سيا) مكوناً هاما جداً من جليكوكونجوجاتيس، مثل ن-و يا--جليكانس أو جليكوليبيدس. نظراً لموقعها في تيرميني الحد من غير اليغو-والسكريات، فضلا عن الخصائص الكيميائية الفريدة، وحمض اللعابي تشارك في العديد من التفاعلات يجند مستقبلات مختلفة. عن طريق تعديل التعبير عن الحامض اللعابي على سطح الخلية، سيتأثر وبالتالي التفاعلات تعتمد على الحامض اللعابي. وهذا يمكن أن يكون مفيداً للتحقيق في التفاعلات تعتمد على الحامض اللعابي ولديه القدرة على التأثير على بعض الأمراض بطريقة مفيدة. عن طريق التمثيل الغذائي جليكونجينيرينج (MGE)، يمكن أن يكون التضمين التعبير عن الحامض اللعابي على سطح الخلية. هذه الوثيقة، خلايا أو أنسجة الحيوانات كامل حتى يتم التعامل مع تعديل C2 مشتقات N-أسيتيلمانوساميني (مانك). هذه السكريات الأمينية تعمل كجزيئات السلائف حمض اللعابي ولذلك إلى الأنواع الحامض اللعابي المقابلة وأعربت عن جليكوكونجوجاتيس. تطبيق هذا الأسلوب ينتج تأثيرات مثيرة للاهتمام على مختلف العمليات البيولوجية. على سبيل المثال، فإنه يمكن إجراء تخفيض جذري في التعبير عن حمض بوليسياليك (بوليسيا) في تعامل الخلايا العصبية، ومما يؤثر على نمو الخلايا العصبية والتمايز. وهنا نعرض التوليف الكيميائي لاثنين من المشتقات الأكثر شيوعاً-أسيلمانوساميني تعديل C2 N، N-بروبيونيلمانوساميني (مانبروب) فضلا عن ن-بوتانويلمانوساميني (مانبوت)، وكذلك إظهار كيف أن هذه غير الطبيعية ويمكن تطبيق السكريات الأمينية في خلية ثقافة التجارب. التعبير عن الأنواع المعدلة الحامض اللعابي كمياً من كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]) وكذلك تحليل عبر الطيف الكتلي. يتم توضيح آثار على التعبير حمض بوليسياليك عبر وصمة عار الغربية استخدام جسم حمض بوليسياليك متاحة تجارياً.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

حمض اللعابي هو أحادي التي ترد عادة في تيرميني عدم الحد من جليكوكونجوجاتيس، مثل ن-و يا--جليكانس أو جليكوليبيدس. من بين جميع السكريات الأحادية، قد الحامض اللعابي بعض الخصائص الكيميائية الفريدة. أنها العمود الفقري ذرة ج 9، مجموعة كاربوكسيليك في موقف C-1، ديبروتوناتيد ومشحونة سلبا وبالتالي تحت الظروف الفسيولوجية، ووظيفة أمينية في موقف C-5. على الرغم من أن ما يزيد على 50 طبيعيا متغيرات حامض اللعابي اتسمت بتاريخ1، الشكل السائد للحامض اللعابي وجدت في البشر حمض ن-أسيتيلنيورامينيك (Neu5Ac). ثدييات أخرى أيضا مقادير أعلى من N-جليكوليلنيورامينيك الحمضية (Neu5Gc)2،3.

نظراً لموقعها المكشوفة في جليكوكونجوجاتيس، وحمض اللعابي تشارك في عدد كبير من مستقبلات-يجند التفاعلات، مثلاً، ملزمة تعتمد هيماغلوتينين فيروس الإنفلونزا إلى الخلايا المضيفة4. حانمه حامض اللعابي مع الوظائف البيولوجية الهامة، وبخاصة أثناء امبريوجينيسيس وفي الجهاز العصبي، حمض بوليسياليك. حمض بوليسياليك بوليمر ليصل إلى 200 ألفا 2، 8-ترتبط اللعابي الأحماض. الناقل البروتين الرئيسي لحمض بوليسياليك هو جزيء التصاق الخلايا العصبية (نكام). التعبير حمض بوليسياليك ينظم الملكية لاصقة من نكام في هذا التعبير حمض بوليسياليك يقلل الالتصاق ويزيد اللدونة مع الجهاز العصبي5.

سوف تؤثر التغييرات في التعبير عن الحامض اللعابي (بولي) في نهاية المطاف العديد من التفاعلات البيولوجية المختلفة. يمكن استخدام هذا لدراسة العمليات المعروفة اللعابي حمض تعتمد على مستوى جزيئي، للكشف عن التفاعلات جليكوكونجوجاتي الرواية، أو استكشاف النهج العلاجية الممكنة. وهناك أساليب مختلفة المتاحة التي يمكن أن يكون التضمين التعبير عن الحامض اللعابي على سطح الخلية، على سبيل المثال في المعاملة مع الحامض اللعابي محددة جليكوسيداسيس (سياليداسيس)، تثبيط الإنزيمات المشاركة في التركيب الحيوي الحامض اللعابي6 ،،من78، أو هدمت أو تغيير التعبير عن إنزيم رئيسي من الحامض اللعابي الحيوي9.

هو أسلوب تنوعاً آخر تعدل التعبير الحامض اللعابي MGE (الهندسة الأيضية المعروف أيضا oligosaccharide، وزارة التربية والتعليم). هنا، تعامل مع مشتقات مانك غير الطبيعية التي تتحمل تعديلات C2 الأمينية الخلايا أو الأنسجة، أو حتى الحيوانات. يجري السلائف جزيئات للحامض اللعابي، بعد امتصاص الخلوية، النظير مانك هذه الأحماض اللعابي يستقلب إلى غير الطبيعي أحادي الاتجاه ويمكن التعبير عنها في جليكوكونجوجاتيس سياليلاتيد. الخلايا تعامل مع مشتقات مانك تحمل الاليفاتيه C2-التعديلات، مثل مانبروب أو مانبوت، إدراج حمض ن-بروبيونيلنيورامينيك (Neu5Prop) أو حمض--بوتانويلنيورامينيك ن(Neu5But) في جليكوكونجوجاتيس على10 , 11-باستخدام المجموعات الوظيفية التي أدخلت إلى C2-موقف مانك، ويمكن أن يقترن الأحماض اللعابي غير الطبيعية التي تحدث، مثلاً، عن طريق ربط شتاودنغر أو سيكلواديشن الكن أزيد، مع الأصباغ الفلورية، وبالتالي تصور على سطح الخلية12.

التعبير عن هذه الأحماض اللعابي غير الطبيعي له تأثيرات مثيرة للاهتمام في العديد من العمليات البيولوجية، بما في ذلك التهابات الممرض والالتصاق والهجرة للخلايا السرطانية والتصاق الخلايا عامة، فضلا عن الأوعية الدموية والتمايز (للمراجعة انظر: راتيل et al. 13)-من المثير للاهتمام، MGE مع ن-اشيل تعديل مانوسامينيس يمكن أيضا أن تتداخل مع التعبير عن حمض بوليسياليك. حمض بوليسياليك تم إنشاؤه بواسطة بوليسياليلترانسفيراسيس مختلفة اثنين (ST8SiaII و ST8SiaIV). وقد ثبت، تحول دون أن بوليسياليلترانسفيراسي ST8SiaII بالسلائف حمض اللعابي غير طبيعية، مثل مانبروب أو مانبوت،من1415. وباﻹضافة إلى ذلك، وقد ثبت في الخلايا البشرية نيوروبلاستوما أن تطبيق مانبروب أو مانبوت كما يقلل من سياليليشن في مجموع15.

MGE مع N-اشيل تعديل مانوسامينيس هو وسيلة سهلة لتطبيق الأسلوب الذي تم استخدامه بنجاح، ليس فقط في الثدييات وثقافة الخلية البكتيريا بل أيضا في جميع الحيوانات من مختلف الأنواع، مثل ايليجانس كاينورهابديتيس16، الزرد17، أو الفئران18،19،،من2021. خصوصا المشتقات ماناك تحمل التعديلات الاليفاتيه، بما في ذلك مانبروب ومانبوت، ماما السامة للخلايا، حتى في تركيزات ميليمولار في خلية ثقافة متوسطة أو بلازما الدم. وعلاوة على ذلك، فسهلة نسبيا لتوليف.

هنا، يمكننا تقديم تفاصيل عن كيفية استخدام MGE مع ن-أسيتيل تعديل مانوسامينيس. أولاً، يتم شرح التوليف الكيميائي لاثنين من المشتقات مانك الأكثر استخداماً في هذا المجال، مانبروب ومانبوت،. وبعد ذلك، نعرض كيف يمكن تطبيق MGE في تجربة في فيفو . وكمثال على ذلك، اختير خط الخلية نيوروبلاستوما كيلي لإثبات انخفاض التعبير عن حانمه بوليسياليك الغربية لطخة بعد العلاج مع مشتقات مانك. الأحماض اللعابي غير طبيعية على سطح الخلية كمياً من [هبلك] وكذلك تحليل عبر الطيف الكتلي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1-إعداد المخازن المؤقتة والمواد الكاشفة

  1. إعداد حل ميثوكسيد الصوديوم 3 مم
    1. حل ميثوكسيد الصوديوم ملغ 8.1 في الميثانول 50 مل (3 مم) في زجاجة زجاج 100 مل مع شريط إثارة. تخزين في درجة حرارة الغرفة (RT) لعدة أسابيع.
  2. إعداد المخزن المؤقت تريس-HCl
    1. الجمع بين 8.766 ز كلوريد الصوديوم و 157 مغ تريس-HCl 146 مغ يدتا في زجاجة زجاج 100 مل مع شريط ضجة وتذوب في الماء 80 مل.
    2. إضافة هيدروكسيد الصوديوم (1 م، في الماء) أو HCl (20%، في المياه) إلى الحل إثارة، مع مراعاة درجة الحموضة مع مقياس الأس الهيدروجيني، وضبط درجة الحموضة إلى 8.0.
    3. إضافة كمية المياه اللازمة لتحقيق وحدة تخزين نهائي من 100 مل. تصفية الحل باستخدام نظام تصفية عقيمة 0.22 ميكرومتر.
      ملاحظة: سوف تحتوي على 100 مل تريس-HCl المخزن المؤقت 150 مم كلوريد الصوديوم، 10 تريس-HCl، و 5 ملم يدتا (pH 8.0). ويمكن تخزين الحل عند 4 درجة مئوية لعدة أسابيع.
  3. إعداد حل أبروتينين
    1. حل aprotinin ملغ 10 في 1 مل من الماء (1.54 مم). قاسمة الحل أبروتينين إلى 10 × 1.5 مل البلاستيكية أنابيب (100 ميليلتر في كل). تخزين في-20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
  4. إعداد حل ليوبيبتين
    1. حل ليوبيبتين 10 ملغ في 2 مل من الماء (10 مم). قاسمة الحل ليوبيبتين 10 × 1.5 مل البلاستيكية أنابيب. تخزين في-20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
  5. إعداد الحل فلوريد (بمسف) فينيلميثيلسولفونيل
    1. حل 34.8 ملغ بمسف في 2 مل إيثانول (100 ملم). قاسمة الحل بمسف في 10 × 1.5 مل البلاستيكية أنابيب. تخزين في-20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
  6. إعداد حل 1، 2-ديامينو-4، 5-ميثيلديوكسيبينزول-هيدروكلوريد (DMB)
    1. الجمع بين مغ 15.62 DMB، 352 ميليلتر β-ميركابتوثانول، وميليلتر 48 بيكبريتيت الصوديوم-الحل (39 في المائة)، وإضافة 9.6 مل من الماء (6.9 مم DMB و 500 مم β-mercaptoethanol وبيكبريتيت الصوديوم 0.19 في المائة). قاسمة الحل DMB في 40 × 1.5 مل البلاستيكية أنابيب (250 ميليلتر في كل). مخزن محمية من الضوء في-20 درجة مئوية لعدة أسابيع.
  7. إعداد حل حمض (تفا) تريفلورواسيتيك م 1
    1. إضافة ميليلتر 770.3 100% تفا إلى 9.23 مل من الماء في أنبوب بلاستيك 15 مل (1 م). تخزين في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع.
  8. إعداد حل تفا 120 مم
    1. إضافة ميليلتر 92.4 تفا (100 في المائة) إلى 9.91 مل من الماء (120 ملم) في أنبوب بلاستيك 15 مل. تخزين في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع.
  9. إعداد حل هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم) 400 مم
    1. حل 160 مجم هيدروكسيد الصوديوم في 10 مل من الماء (400 ملم) في أنبوب بلاستيك 15 مل. تخزين في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع.
  10. إعداد المخزن المؤقت لتحلل لطخة غربية
    1. حل 5.84 غ كلوريد الصوديوم، 0.1 غ تريس (هيدروكسيميثيل)-أمينوميثان (تريس) و 0.1 غ كاكل2ز 0.95 مجكل2ز 1 X100 تريتون في 100 مل المياه وضبط درجة الحموضة إلى 7.8. مخزن في 4 درجات مئوية. إضافة 100 ميليلتر من كل مثبط البروتياز (أبروتينين وليوبيبتين وبمسف) قبل استخدام المخزن المؤقت تحلل.
  11. إعداد الصوديوم دوديسيل كبريتات polyacrylamide هلام استشراد (الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) المخزن المؤقت
    1. حل 0.3 ز تريس، جليكاين ز 1.5، و 0.1 ز الحزب الديمقراطي الصربي في 100 مل من الماء وضبط درجة الحموضة إلى 7.3. مخزن في الرايت
  12. إعداد المخزن المؤقت لطخة غربية
    1. حل ز 0.3 تريس، جليكاين ز 1.1 في 90 مل من الماء، وإضافة 10 مل الإيثانول. مخزن في الرايت
  13. إعداد لعرقلة الحل
    1. حل ز 1 السلطة الدهون الحليب مجاناً في 25 مل الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). دائماً إعداد جديدة.

2-تجميع مانبروب و ما يتصل نون-الأسيل-تعديل مانوسامينيس

  1. حل 431.2 ملغ هيدروكلوريد مانوساميني في 10 مل 3 مم صوديوم ميثوكسيد الحل في زجاجة زجاج 50 مل مع شريط إثارة.
  2. تبريد المخلوط على الجليد إلى 0 درجة مئوية. أن الحل الذي إثارة، إضافة ببطء dropwise 210 ميليلتر بروبيونيل الكلوريد (2.4 ميللي مول)، أو كلوريد بوتانويل ميليلتر 248 (2.4 ميللي مول) لتجميع مانبروب أو مانبوت، على التوالي. احتضان الخليط إثارة في 0 درجة مئوية ح 4.
  3. نقل الحل في أنبوب بلاستيكي 50 مل. كزة 4-8 ثقوب في غطاء أنبوب بلاستيكي بإبرة رقيقة. سرعة تجميد الحل باستخدام النتروجين السائل وبعد ذلك ليوفيليزي (تجميد جاف) فإنه لمدة 48 ساعة أو حتى أنها قد جفت تماما.
  4. مزيج هلام السليكا 350 غ 60 مع 750 مل الإيثيل وخلات/الميثانول/المياه (15:2:1) (هذا تعليق). تعبئة عمود زجاج (35 ملم وقطرها 70 سم طول) مع تعليق السليكا هلام 60 وتغسل العمود مستعدة مع إضافية 100 مل إيثيل اسيتات/ميثانول/مياه (15:2:1) قبل الاستخدام.
  5. حل المنتجات المجففة من الخطوة 2، 3 (5 غ المجفف المنتج) في 10 مل إيثيل اسيتات/الميثانول/المياه (15:2:1) وتحميل لهم باستخدام ماصة على السيليكا هلام العمود. جمع الكسور 4 مل بعد 500 مل (مانبروب). ملاحظة: سوف الوت مانبوت من العمود بعد ما يقرب من 700 مل.
  6. نقل التيد الكسور في أنابيب بلاستيكية 15 مل. كزة 3-6 فتحات في غطاء أنبوب بلاستيكي بإبرة رقيقة. السريع تجميد الحل باستخدام النتروجين السائل وبعد ذلك ليوفيليزي حتى أنها قد جفت تماما.
    ملاحظة: يمكن تخزين المنتجات المجففة بالتبريد لعدة أشهر في الرايت
  7. التحقق من نقاء المنتجات من الطيف الكتلي (انظر القسم 9).
    ملاحظة: بدلاً من ذلك، النقاء يمكن أيضا التحقق من أن 1ح الرنين المغناطيسي النووي (الرنين المغناطيسي النووي).

3-خلية ثقافة

  1. الثقافة كيلي نيوروبلاستوما الخلايا في المتوسط معهد ميموريال بارك في روزويل (ربمي) التي تحتوي على 10% مصل بقرى الجنين، 100 البنسلين يو، ستربتوميسين 100 ملغ، 2 مم L-الجلوتامين التي تحتوي على 5 مم مانك أو 5 مم مانبروب مم 5 مانبوت، في 37 درجة مئوية و 5% CO2.
    ملاحظة: يتم استخدام الخلايا المستزرعة في المتوسط دون مانك أو نظائرها كعنصر تحكم.
  2. قبل تطبيق مانوسامينيس، فصل الخلايا نيوروبلاستوما كيلي التي تفرخ لهم لمدة 10 دقائق مع التربسين/يدتا (0.25%، 0.02 في المائة، في برنامج تلفزيوني) والاعتماد على استخدام عداد نويباور الدائرة أو الخلية. بذور الخلايا في أرقام محددة استناداً إلى حجم اللوحة/الطبق.
    1. لقياس حمض اللعابي السكريات الأحادية، البذور 1 × 105 خلايا في 500 ميليلتر المتوسطة إلى طبق استنبات الأنسجة 48-جيدا. لتحليل الأحماض بوليسياليك، البذور 1 × 106 خلايا في المتوسط 3 مل على طبق ثقافة خلية قطرها 6 سم. احتضان CO 37 درجة مئوية و 5%2. استبدال المتوسطة كل 24 ساعة.
      ملاحظة: تأثير MGE يزداد مع الوقت الإجمالي للعلاج. لكفاءة الأيض عالية علاج الخلايا لمدة 5-7 أيام.
  3. وبعد العلاج، صب في المتوسط. غسل الأطباق/اللوحات مع برنامج تلفزيوني. فصل الخلايا التي تفرخ لهم لمدة 10 دقائق مع التربسين/يدتا (0.25%، 0.02 في المائة، في برنامج تلفزيوني). تحييد التربسين بإضافة نفس الحجم من مستنبت الخلية إلى خلايا منفصلة. نقل الخلايا المنفصلة في أنابيب بلاستيكية 15 مل. الطرد المركزي في نماذج لمدة 3 دقائق في 500 x ز وتجاهل المادة طافية.
    1. إضافة خلايا 5 مل برنامج تلفزيوني وجهاز الطرد المركزي (راجع الخطوة 3، 3). كرر الإجراء الغسيل مرتين أخريين.
      ملاحظة: يمكن تخزين بيليه خلية غسلها دون المادة طافية في-20 درجة مئوية لعدة أيام. إذا كان تعبير حمض بوليسياليك توضيح الاستمرار في الباب 10.

4-خلية تفسخ لتحليل [هبلك]

  1. إعداد المخزن المؤقت لتحلل [هبلك]
    1. تجمع المخزن المؤقت 5 مل تريس-HCl، 5 ميليلتر aprotinin الحل، 20 ميليلتر ليوبيبتين الحل، والحل بمسف 50 ميليلتر.
      ملاحظة: سوف تحتوي على 5 مل [هبلك] تحلل المخزن المؤقت 150 مم كلوريد الصوديوم، 10 مم تريس-HCl، 5 ملم يدتا، 1.54 ميكرومتر aprotinin، 40 ميكرومتر ليوبيبتين، و 1 مم بمسف (pH 8.0). هذا المخزن المؤقت يجب أن تكون مستعدة دائماً طازجة قبل تحلل الخلية.
  2. إعادة تعليق الخلية التي تم جمعها الكريات (الخطوة 3، 3) كل 500 ميليلتر المثلج [هبلك] تحلل-المخزن المؤقت، وفائقة-sonicate العينات مع إبرة معالج فائقة سونيك ثلاث مرات لمدة 30 ثانية في الاتساع متوسطة-عالية. تبريد العينات في الثلج لمدة 1 دقيقة على الأقل ما بين الدورات.

5-فصل كسر الغشاء

  1. الطرد المركزي في نماذج تفكيك خلية ح 2 000 20 شخص × ز و 4 درجة مئوية. فصل المادة طافية (حوالي 480 ميليلتر)، تمثل البروتينات سيتوسوليك، في أنابيب بلاستيكية 1.5 مل. تحديد تركيز البروتين هذه الكسور باستخدام، مثلاً، في برادفورد أو المقايسة (اتفاق التعاون الأساسي) حمض بيسينتشونينيك.
    ملاحظة: يمكن أن يرتبط تركيز البروتين (حوالي 1 ملغ/مل) من الكسور سيتوسوليك لاحقاً بقياس كميات الأنواع الحامض اللعابي محترمة. بيليه يمثل الكسر الغشاء، الذي يستخدم في الخطوة 6، 1.

6. حموضة التحلل المائي

ملاحظة: يتم تحلل اليغو-والسكريات في أغشية الخلايا بالسكريات الأحادية. علاوة على ذلك، أمكن س-تعديلات السكريات الأحادية هي تحلل، كذلك. وهذا ضروري للتحليل الكمي [هبلك]، لأن الأغلبية الساحقة من الأحماض اللعابي في كسور غشاء مدرجة بطبيعة الحال في جليكوكونجوجاتيس وربما قد تحمل س-أسيتيل أو التعديلات-لاكتوليل س.

  1. إضافة 150 ميليلتر 1 م تفا-حل للكسور غشاء المنفصلين (بيليه من القسم 5). احتضان هذه العينات ح 4 في 80 درجة مئوية مع الهز 200-600 لفة في الدقيقة.
  2. الطرد المركزي العينات لحوالي 30 دقيقة 000 20 شخص × ز و 21 درجة مئوية، استخدام أنابيب التصفية 0.5 مل مع 3 أغشية الاستبعاد كاتشين، حتى يصبح حجم المرحلة العليا أقل من 20 ميليلتر.
    ملاحظة: هذه الخطوة مهمة للتخلص من الحطام الجزيئي أعلى.
  3. نقل المرحلة الدنيا التي تحتوي على جزيئات أصغر حجماً، بما في ذلك الأنواع الحامض اللعابي، في أنابيب بلاستيكية 2 مل. كزة 2-4 ثقوب في أغطية الأنابيب البلاستيكية بإبرة رقيقة. وتجميد العينات باستخدام النتروجين السائل السريع ثم ليوفيليزي عليها بين عشية وضحاها.
    ملاحظة: يمكن تخزين العينات المجففة لعدة أيام في الرايت استبدال غطاء دون ثقوب لتخزين أطول.

7. وسم فلوري

  1. تعليق إعادة العينات المجففة في 10 ميليلتر 120 مم تفا الحل وإضافة 50 ميليلتر DMB الحل. نقل العينات إلى أنابيب الظلام 1.5 مل لحمايتهم من الأشعة فوق البنفسجية.
  2. لمعايير، حل 1 ميليلتر Neu5Ac (60 نانوغرام/ملليلتر، في الماء) أو 1 ميليلتر Neu5Gc (60 نانوغرام/ملليلتر، في المياه) في 10 ميليلتر 120 مم تفا الحل في أنابيب الظلام 1.5 مل. إضافة 50 ميليلتر DMB الحل.
  3. احتضان هذه العينات غشاء الخلية ومعايير ح 1.5 في 56 درجة مئوية محمية من الضوء. بعد التفريخ، إضافة ميليلتر 4 مم 400 حل هيدروكسيد الصوديوم لكل عينة التوقف عن رد فعل وضع العلامات.

8. تحليل [هبلك]

ملاحظة: يتم تحليل عينات المسمى على نظام [هبلك] مزودة بعمود C18 RP (110، حجم جسيمات 3 ميكرومتر، 4.6 × 150 مم)، كاشف الأسفار، وجامع كسر. المذيبات المستخدمة هي الميثانول والاسيتو الانيتريل والمياه. تأكد من ديغا جميع المذيبات قبل القياسات، إذا كان النظام [هبلك] يفتقر ديجاسير داخلية.

  1. تعيين درجة حرارة العمود إلى 40 درجة مئوية وتكوين الكاشف ومضان مع 373 نانومتر للإثارة و 448 nm للانبعاثات، على التوالي. حقن 10 حجم العينة ميليلتر وفصل تحقيقات لمدة 50 دقيقة بمعدل تدفق 0.5 مل/دقيقة مع الميثانول/الاسيتو الانيتريل/المياه (6:8:86) كما الوينت. لتحليل الطيف الكتلي، جمع قمم الفائدة.
    ملاحظة: من المتوقع Neu5Gc إلى النذرة بعد 6-8 دقيقة، Neu5Ac بعد 9-12 دقيقة، Neu5Prop بعد 17-23 دقيقة، و Neu5But بعد 38-44 دقيقة. ويمكن تخزين العينات هورمونات لعدة ح في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
  2. بعد قياس كل عينة، يغسل في عمود 7.5 دقيقة في معدل تدفق 1.0 مل/دقيقة (وحدات تخزين العمود 1.5 ≈) مع الميثانول/الاسيتو الانيتريل/المياه (6:25:69) وإعادة توازن نظام 7.5 دقيقة بمعدل تدفق 1.0 مل/دقيقة مع الميثانول/الاسيتو الانيتريل/المياه (6:8:86).
  3. للتحليل الكمي، حساب المساحة تحت منحنى قمم الحامض اللعابي من اهتمام باستخدام برامج التشغيل من النظام [هبلك] كل منهما22.
    ملاحظة: يمكن أن ترتبط البيانات التي تم الحصول عليها Neu5Ac أو معيار Neu5Gc والتركيزات المقاسة البروتين في الكسور سيتوسوليك (انظر الفرع 5، 1).

9-الكتلي تحليل الحامض اللعابي السكريات الأحادية

ملاحظة: [هبلك] الاحتفاظ بقمم من الفائدة يمكن كذلك تحليلها اللوني السائل (ش) اليكتروسبراي-التأين الكتلي (أي إس أي--مرض التصلب العصبي المتعدد)، بغية التحقق من الأنواع الحامض اللعابي غير طبيعي.

  1. لتحليل الطيف الكتلي، ضخ 20 ميليلتر من العينات التي تم جمعها في نظام كاشف انتقائية LC/قداس (MSD) مع الميثانول 79.9 في المائة، وكحول الأيزوبروبيل 20%، وحمض الفورميك 0.1% الوينت ومعدل التدفق 0.5 مل/دقيقة، 4 كيلو فولت الشعرية الجهد ودرجة حرارة 350 درجة مئوية الشعرية 22 , 23.
  2. في برنامج تقييم نظام LC/MSD كل منهما، حدد ذروة الاهتمام في chromatogram أيون المجموع. عرض الطيف الشامل لذروة حلها. عرض نسبة إيجابية الجماهيري وشحن بين 300 و 700 شخص.
    ملاحظة: الوسم DMB الأحماض اللعابي يؤدي إلى زيادة في الكتلة الجزيئية من 116.2 غ/مول. الأنواع المسماة DMB الحامض اللعابي لها الجماهير الجزيئية التالية: DMB-Neu5Ac = 424.2 غ/مول، DMB-Neu5Gc = 441.8 غ/مول، DMB-Neu5Prop = 436.2 غ/مول، DMB-Neu5But = 453.2 ز/adducts الجزيئية المشتركة هي الاسيتو الانيتريل أو الصوديوم أو كحول الأيزوبروبيل.

10-الغربية وصمة عار تحليل حمض بوليسياليك في خلايا Neuroblastoma كيلي

  1. إعداد خلية ليساتيس
    1. إضافة 1 مل لطخة غربية تحلل المخزن المؤقت إلى حبيبات الخلية من الخطوة 3، 3 ودوامه. احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد. دوامة كل 5 دقائق. الطرد المركزي في النماذج ل 1.5 ح 000 20 شخص × ز و 4 درجة مئوية. جمع المادة التي تحتوي على البروتينات من خلايا ليسيد طافية.
    2. تحديد تركيز البروتين الكسور البروتين، مثلاً، في برادفورد أو المقايسة اتفاق التعاون الأساسي. تمييع العينات لتركيز 1.5 ميكروغرام/ميليلتر في المخزن المؤقت لتحلل بروتين.
    3. إعداد العينات للحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة بإضافة 10 ميليلتر لايملي عينة المخزن المؤقت إلى 90 جزء من البروتين ميليلتر (1.5 ميكروغرام/ميليلتر) وتغلي العينة لمدة 5 دقائق24.
  2. إيمونوبلوتينج
    1. استخدام المواد الهلامية صحيفة بيانات السلامة-اكريلاميد 8% مع جيوب ميليلتر 20-30 والسماكة 0.75 أو 1 ملم. تشغيل الهلام في 25 mA ح 2 في الرايت
    2. بعناية إزالة الغطاء الزجاج من الجل. قطع وتجاهل الجزء العلوي من جل يحتوي على جيوب التحميل. ضع الجل على غشاء النيتروسليلوز (0.2 ميكرومتر)، كانت غارقة في المخزن المؤقت لطخة غربية. نقل البروتينات إلى النيتروسليلوز وفقا لتوصية النظام (مثلاً 250 mA ح 1 في 4 درجات مئوية).
    3. إزالة الغشاء النيتروسليلوز من النظام بلوتينج. وصمة عار وصمة عار مع بونسو الأحمر أن تصور البروتينات. نقل الغشاء النيتروسليلوز إلى غرفة بلاستيكية وإضافة 10 مل عرقلة الحل. احتضانها ح 1 في الرايت أو بين ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية.
    4. صب حل حظر وإضافة جسم [مونوكلونل] مكافحة-بوليسيا 735 (1 ميكروغرام/مل) في برنامج تلفزيوني. احتضان الغشاء ح 1 في الرايت أو بين ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية. وبعد الحضانة، يغسل الغشاء ثلاث مرات على الأقل لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني.
    5. إضافة IgG المضادة الماوس [بولكلونل] جسم الثانوي (1 ميكروغرام/مل) بالإضافة إلى الفجل البيروكسيديز (HRP) أو علامة مضيئة في برنامج تلفزيوني. احتضان الغشاء ح 1 في الرايت وبعد الحضانة، يغسل الغشاء ثلاث مرات على الأقل لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني.
    6. نقل الغشاء على طبق من ذهب تصوير المناسبة. الكشف عن الإشارة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد في الشكل 2تشروماتوجرامس [هبلك] من الفلورسنت المسمى Neu5Ac، ومعايير Neu5Gc. باستخدام الأسلوب هو موضح هنا، المسمى DMB Neu5Gc عادة التيس بين 7-9 دقيقة شطف وقت، و DMB-Neu5Ac بين 10-12 دقيقة. عدة قمم أصغر في chromatogram تظهر عادة بين 2-6 دقيقة. وتمثل هذه القمم DMB الممتص ورد فعل وسيطة25.

ويبين الشكل 3 تشروماتوجرامس الممثل لخلية ليساتيس. تشروماتو...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

إذا كان يتم تحليل المشتقات مانك مركباً كيميائيا، مانبروب ومانبوت عبر الطيف الكتلي، ينبغي تحديد ذروة الجماعي الصحيح فقط لكل العينات. ولذلك، يمكن افتراض المنتجات بدرجة نقاء لأكثر من 99%. تم الكشف عن كميات صغيرة من Neu5Gc، التي عادة ما لم يتم العثور على الخلايا البشرية29، في كسور غشاء الخلايا ليسيد. وهذا يحدث على الأرجح من خلال مسار إنقاذ أن المجندين Neu5Gc من سيالوجليكوكونجوجاتيس المصل البقري الجنين في وسائل الإعلام30. المعاملة مع السلائف الطبيعية تخليق حامض اللعابي الحيوي، م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر نغوين د. ل. لتصحيح التجارب المطبعية المخطوط ومناقشات مثمرة. وعلاوة على ذلك، ونحن نشكر ديرنيدي ياء وحاء زاي نغوين لمساعدتنا في إعداد الفيديو تبادل لإطلاق النار. وقتل معظم مشاهد الفيديو في مختبرات تاوبر ر. ونشكر أيضا معهد ماكس بلانك الغروية والواجهات، وعلى إعطائنا حرية الوصول إلى مرفق الكتلي بهم. وأيد RH DFG (برومواجي).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الخلاياسيجما ألدريتش92110411
RPMI متوسطسيجما ألدريتشR8758
75 مل قوارير زراعة الأنسجةGreiner690175
ألواح 48 بئرا Corning3548
FCSPAAA15-102
قلم / بكتيرياGibco15140-122
TrypsineGibco15400-054
EDTARothX986.1
TrisServa37190.03
SDSRoth2326.2
معدات SDS-PAGE (الخزانات والأواني الزجاجية وما إلى ذلك ، آلةVWRSDS Gel / Blot
AcrylamideRoth3019.1
سلم البروتينفيشر Scientific267620
النيتروسليلوزGEالرعاية الصحية 10600002
بونسو ريدروث5938.2
مسحوق الحليبروثT145.3
ECLMilliporeWBLUF 0500
0.5 مل وحدة تصفية الطرد المركزي مع غشاء 3 كيلو دالتونMerck-MilliporeUFC500324
أنابيب الطرد المركزي 15 ملسيجما ألدريتش (كورنينج)CLS430791-500EA
2-MercaptoethanolSigma-AldrichM6250-10ML
2-PropanolSigma-Aldrich34965-1LHPLC التدرج الصف
4،5-Methylenedioxy-1،2-phenylenediamine dihydrochlorideSigma-AldrichD4784-50MG
48 جيدا ، لوحة زراعة الأنسجة ذات القاع المسطحSigma-Aldrich (Corning)CLS3548-100EA
50 مل أنابيب الطرد المركزيسيجما ألدريتش (كورنينج)CLS430829-500EA
أسيتونيتريلسيجما ألدريتش34967-1LHPLC درجة التدرج
أبروتينين من الرئة البقريةSigma-AldrichA1153-10MGمسحوق مجفف بالتجميد ، 3-8 TITU / mg
كلوريد بوتيريلسيجما ألدريتش109614-250G
C18 عمود RPPhenomenex00F-4435-E0110 Å ؛ 3 µ ؛ م حجم الجسيمات ، 4.6 × 150 مم
D-مانوسامين هيدروكلوريدسيجما-ألدريتشM4670-1G
محلول الملح المخزن بالفوسفات من دولبيكوPAN التكنولوجيا الحيويةP04-36500
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيكسيجما ألدريتشE9884-100G
حمض الفورميكسيجما ألدريتش56302-50ML-GL
محلولحمض الهيدروكلوريكسيجما ألدريتشH1758-100ML36.5-38.0٪ ، في الماء
LeupeptinSigma-AldrichL2884-10MG
ميثانولCarl-RothT169.2HPLC درجة التدرج
N-Acetyl-D-ManosamineSigma-AldrichA8176-250MG
N-Acetylneuraminic acidSigma-AldrichA0812-25MG
N-GlycolylneuraminicSigma-AldrichG9793-10MG
فينيل ميثان سولفونيل فلوريدسيجما ألدريتشP7626-250MG
بروبيونيل كلوريدسيجما ألدريتشP51559-500G
أنابيب القفل الآمن ، 1.5 مل ، كهرماني (حماية من الضوء)Eppendorf
، 1.5 مل ، عديم اللونEppendorf30120086
الصوديوم محلول ثنائي الكبريتيتسيجما ألدريتش13438-1L-R-D40٪ ، في الماء
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتش746398-500G-D
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتش795429-500G-D
محلول هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتش319511-500 مل1.0 م ، في الماء
ميثوكسيد الصوديومسيجما ألدريتش164992-5G
حمض ثلاثي فلورو أسيتيكسيجما ألدريتشT6508-100ML-D
تريس هيدروكلوريدسيجما ألدريتشT5941-100G
التربسين 0.25٪ / EDTA 0.02٪ في PBSPAN BiotechP10-019100
WaterCarl-RothT905.1HPLC درجة التدرج
هلام السيليكا 60Carl-Roth9779.1
HPLCAgilent
نظام ESI-MSDAgilent
صلب acidأنابيب القفل الآمن 30120191

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Angata, T., Varki, A. Chemical diversity in the sialic acids and related alpha-keto acids: An evolutionary perspective. Chem Rev. 102, 439-469 (2002).
  2. Schauer, R., Schoop, H. J., Faillard, H. On biosynthesis of glycolyl group of N-glycolylneuraminic acid. oxidation of N-acetyl group to glycolyl group. Hoppe-Seylers Zeitschrift Fur Physiologische Chemie. 349, (1968).
  3. Irie, A., Koyama, S., Kozutsumi, Y., Kawasaki, T., Suzuki, A. The molecular basis for the absence of N-glycolylneuraminic acid in humans. J Biol Chem. 273, 15866-15871 (1998).
  4. Kelm, S., et al. Use of sialic acid analogues to define functional groups involved in binding to the influenza virus hemagglutinin. Eur J Biochem. 205, 147-153 (1992).
  5. Colley, K. J., Kitajima, K., Sato, C. Polysialic acid: Biosynthesis, novel functions and applications. Crit Rev Biochem Mol Biol. 49, 498-532 (2014).
  6. Rillahan, C. D., et al. Global metabolic inhibitors of sialyl- and fucosyltransferases remodel the glycome. Nat Chem Biol. 8, 661-668 (2012).
  7. Wratil, P. R., et al. A Novel Approach to Decrease Sialic Acid Expression in Cells by a C-3-modified N-Acetylmannosamine. J Biol Chem. 289, 32056-32063 (2014).
  8. Nieto-Garcia, O., et al. Inhibition of the key enzyme of sialic acid biosynthesis by C6-Se modified N-acetylmannosamine analogs. Chem Sci. 7, 3928-3933 (2016).
  9. Keppler, O. T., et al. UDP-GlcNAc 2-epimerase: A regulator of cell surface sialylation. Science. 284, 1372-1376 (1999).
  10. Kayser, H., et al. Biosynthesis of a nonphysiological sialic acid in different rat organs, using N-propanoyl-D-hexosamines as precursors. J Biol Chem. 267, 16934-16938 (1992).
  11. Keppler, O. T., et al. Biosynthetic modulation of sialic acid-dependent virus-receptor interactions of two primate polyoma viruses. J Biol Chem. 270, 1308-1314 (1995).
  12. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. Imaging the glycome. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 12-17 (2009).
  13. Wratil, P. R., Horstkorte, R., Reutter, W. Metabolic Glycoengineering with N-Acyl Side Chain Modified Mannosamines. Angewandte Chemie International Edition. 55, 9482-9512 (2016).
  14. Horstkorte, R., et al. Selective inhibition of polysialyltransferase ST8Siall by unnatural sialic acids. Exp Cell Res. 298, 268-274 (2004).
  15. Gnanapragassam, V. S., et al. Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 9, 10(2014).
  16. Agard, N. J., Prescher, J. A., Bertozzi, C. R. A strain-promoted 3+2 azide-alkyne cycloaddition for covalent modification of blomolecules in living systems. J Am Chem Soc. 126, 15046-15047 (2004).
  17. Dehnert, K. W., et al. Imaging the Sialome during Zebrafish Development with Copper-Free Click Chemistry. ChemBioChem. 13, 353-357 (2012).
  18. Prescher, J. A., Dube, D. H., Bertozzi, C. R. Chemical remodelling of cell surfaces in living animals. Nature. 430, 873-877 (2004).
  19. Neves, A. A., et al. Imaging sialylated tumor cell glycans in vivo. Faseb Journal. 25, 2528-2537 (2011).
  20. Vogt, J., et al. Homeostatic regulation of NCAM polysialylation is critical for correct synaptic targeting. Cell Mol Life Sci. 69, 1179-1191 (2012).
  21. Qiu, L., et al. A novel cancer immunotherapy based on the combination of a synthetic carbohydrate-pulsed dendritic cell vaccine and glycoengineered cancer cells. Oncotarget. 6, 5195-5203 (2015).
  22. Erikson, E., et al. Mouse Siglec-1 Mediates trans-Infection of Surface-bound Murine Leukemia Virus in a Sialic Acid N-Acyl Side Chain-dependent Manner. J Biol Chem. 290, 27345-27359 (2015).
  23. Klein, A., Diaz, S., Ferreira, I., Lamblin, G., Roussel, P., Manzi, A. E. New sialic acids from biological sources identified by a comprehensive and sensitive approach: liquid chromatography-electrospray ionization-mass spectrometry (LC-ESI-MS) of SIA quinoxalinones. Glycobiology. 7, 421-432 (1997).
  24. Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during assembly of head of bacteriophage-T4. Nature. 227, (1970).
  25. Orozco-Solano, M. I., Priego-Capote, F., Luque de Castro, M. D. Ultrasound-assisted hydrolysis and chemical derivatization combined to lab-on-valve solid-phase extraction for the determination of sialic acids in human biofluids by µ-liquid chromatography-laser induced fluorescence. Analytica Chimica Acta. 766, 69-76 (2013).
  26. Hara, S., Takemori, Y., Yamaguchi, M., Nakamura, M., Ohkura, Y. Fluorometric high-performance liquid chromatography of N-acetyl- and N-glycolylneuraminic acids and its application to their microdetermination in human and animal sera, glycoproteins, and glycolipids. Anal Biochem. 164, 138-145 (1987).
  27. İzzetoğlu, S., Şahar, U., Şener, E., Deveci, R. Determination of sialic acids in immune system cells (coelomocytes) of sea urchin, Paracentrotus lividus, using capillary LC-ESI-MS/MS. Fish Shellfish Immunol. 36, 181-186 (2014).
  28. Wolf, S., et al. Chemical Synthesis and Enzymatic Testing of CMP-Sialic Acid Derivatives. ChemBioChem. 13, 2605-2615 (2012).
  29. Sonnenburg, J. L., Altheide, T. K., Varki, A. A uniquely human consequence of domain-specific functional adaptation in a sialic acid-binding receptor. Glycobiology. 14, 339-346 (2004).
  30. Oetke, C., et al. Evidence for efficient uptake and incorporation of sialic acid by eukaryotic cells. Eur J Biochem. 268, 4553-4561 (2001).
  31. Buttner, B., et al. Biochemical engineering of cell surface sialic acids stimulates axonal growth. J Neuro. 22, 8869-8875 (2002).
  32. Kontou, M., Weidemann, W., Bork, K., Horstkorte, R. Biological Chemistry. 390, 575(2009).
  33. Tanaka, F., et al. Expression of polysialic acid and STX, a human polysialyltransferase, is correlated with tumor progression in non small cell lung cancer. Cancer Res. 60, 3072-3080 (2000).
  34. Cheng, B., Xie, R., Dong, L., Chen, X. Metabolic Remodeling of Cell-Surface Sialic Acids: Principles, Applications, and Recent Advances. ChemBioChem. 17, 11-27 (2016).
  35. Collins, B. E., Fralich, T. J., Itonori, S., Ichikawa, Y., Schnaar, R. L. Conversion of cellular sialic acid expression from N-acetyl- to N-glycolylneuraminic acid using a synthetic precursor, N-glycolylmannosamine pentaacetate: inhibition of myelin-associated glycoprotein binding to neural cells. Glycobiology. 10, 11-20 (2000).
  36. Schwartz, E. L., Hadfield, A. F., Brown, A. E., Sartorelli, A. C. Modification of sialic acid metabolism of murine erythroleukemia cells by analogs of N-acetylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta. 762, 489-497 (1983).
  37. Jones, M. B., et al. Characterization of the cellular uptake and metabolic conversion of acetylated N-acetylmannosamine (ManNAc) analogues to sialic acids. Biotechnol Bioeng. 85, 394-405 (2004).
  38. Bayer, N. B., et al. Artificial and Natural Sialic Acid Precursors Influence the Angiogenic Capacity of Human Umbilical Vein Endothelial Cells. Molecules. 18, 2571-2586 (2013).
  39. Schmidt, C., Stehling, P., Schnitzer, J., Reutter, W., Horstkorte, R. Biochemical engineering of neural cell surfaces by the synthetic N-propanoyl-substituted neuraminic acid precursor. J Biol Chem. 273, 19146-19152 (1998).
  40. Laughlin, S. T., Bertozzi, C. R. In Vivo Imaging of Caenorhabditis elegans Glycans. ACS Chem Biol. 4, 1068-1072 (2009).
  41. Laughlin, S. T., Baskin, J. M., Amacher, S. L., Bertozzi, C. R. In vivo imaging of membrane-associated glycans in developing zebrafish. Science. 320, 664-667 (2008).
  42. Chang, P. V., et al. Copper-free click chemistry in living animals. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 1821-1826 (2010).
  43. Gagiannis, D., Gossrau, R., Reutter, W., Zimmermann-Kordmann, M., Horstkorte, R. Engineering the sialic acid in organs of mice using N-propanoylmannosamine. Biochimica Et Biophysica Acta-General Subjects. 1770, 297-306 (2007).
  44. Rong, J., et al. Glycan Imaging in Intact Rat Hearts and Glycoproteomic Analysis Reveal the Upregulation of Sialylation during Cardiac Hypertrophy. J Am Chem Soc. 136, 17468-17476 (2014).
  45. Galuska, S. P., et al. Quantification of Nucleotide-Activated Sialic Acids by a Combination of Reduction and Fluorescent Labeling. Anal Chem. 82, 4591-4598 (2010).
  46. Harms, E., Reutter, W. Half-Life Of N-Acetylneuraminic Acid In Plasma-Membranes Of Rat-Liver And Morris Hepatoma 7777. Cancer Res. 34, 3165-3172 (1974).
  47. Kolarich, D., Lepenies, B., Seeberger, P. H. Glycomics, glycoproteomics and the immune system. Curr Opin Chem Biol. 16, 214-220 (2012).
  48. Preidl, J. J., et al. Fluorescent Mimetics of CMP-Neu5Ac Are Highly Potent, Cell-Permeable Polarization Probes of Eukaryotic and Bacterial Sialyltransferases and Inhibit Cellular Sialylation. Angewandte Chemie-International Edition. 53, 5700(2014).
  49. Macauley, M. S., et al. Systemic Blockade of Sialylation in Mice with a Global Inhibitor of Sialyltransferases. J Biol Chem. 289, 35149-35158 (2014).
  50. Jorge, P., Abdul-Wajid, A. Sialyl-Tn-KLH, glycoconjugate analysis and stability by high-pH anion-exchange chromatography with pulsed amperometric detection (HPAEC-PAD). Glycobiology. 5, 759-764 (1995).
  51. Lin, S. L., Inoue, Y., Inoue, S. Evaluation of high-performance anion-exchange chromatography with pulsed electrochemical and fluorometric detection for extensive application to the analysisof homologous series of oligo- and polysialic acids in bioactive molecules. Glycobiology. 9, 807-814 (1999).
  52. Pan, Y. B., Chefalo, P., Nagy, N., Harding, C., Guo, Z. W. Synthesis and immunological properties of N-modified GM3 antigens as therapeutic cancer vaccines. J Med Chem. 48, 875-883 (2005).
  53. Chefalo, P., Pan, Y. B., Nagy, N., Guo, Z. W., Harding, C. V. Efficient metabolic engineering, of GM3 on tumor cells by N-phenylacetyl-D-mannosamine. Biochemistry. 45, 3733-3739 (2006).
  54. Lee, S., et al. Chemical Tumor-Targeting of Nanoparticles Based on Metabolic Glycoengineering and Click Chemistry. ACS Nano. 8, 2048-2063 (2014).
  55. Koulaxouzidis, G., Reutter, W., Hildebrandt, H., Stark, G. B., Witzel, C. In vivo stimulation of early peripheral axon regeneration by N-propionylmannosamine in the presence of polysialyltransferase ST8SIA2. J Neural Transm. , 1-9 (2015).
  56. Gnanapragassam, V. S., et al. Correction: Sialic Acid Metabolic Engineering: A Potential Strategy for the Neuroblastoma Therapy. PLOS ONE. 11, e0154289(2016).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HPLC

مقالات ذات صلة