مقالة منهجية

آثار متمكنة من البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) على عملية الشفاء من الأوتار أخيل مقطعة للفئران: وصف منهجية

8.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55759

⸱

مارس 19, 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Experimental Surgery, GIGA-R & Credec, University of Liège, 2Laboratory of Connective Tissues Biology, GIGA-R, University of Liège, 3Department Argenco, University of Liège, 4Department of Clinical Biology, University Hospital of Liège, University of Liège, 5Physical Medicine and Sport Traumatology Department, FIFA Medical Center of Excellence, University Hospital of Liège, University of Liège

في هذه المقالة

ملخص

ويصف هذا البروتوكول عملية التقييم لشفاء الأوتار في الفئران التي قد تم حقن البلازما الغنية متمكنة الصفائح الدموية (PRP) أو المحلول الملحي بعد إزالة جزء من وتر أخيل. يتم تقييم التقدم المحرز في شفاء الأربطة في العديد من النقاط الزمنية باستخدام أنواع مختلفة من التحليل.

الملخص

توضح هذه المقالة الإجراءات التجريبية المستخدمة لمراقبة إذا كان الحزب الثوري يمكن أن تؤثر تأثيراً إيجابيا على وتر الشفاء. هناك 4 خطوات رئيسية لمتابعة: الحث على آفة في وتر أخيل؛ إعداد الحزب الثوري وحقن عليه (أو المحلول الملحي)؛ إزالة الوتر؛ وإجراء تقييمات خاصة بالنشاط الحيوي والجزيئية وغذائها. في كل خطوة، وجميع الإجراءات والأساليب يرد بالتفصيل، حيث أنها يمكن أن تتكرر بسهولة.

وكانت الأوتار أخيل مقطعة جراحيا (إزالة مقطع طويل 5 مم). وبعد ذلك، تم حقن الحزب الثوري أو المحلول الملحي لدراسة ما إذا كان الحزب الثوري له أثر إيجابي على الشفاء من الوتر. ثلاث مجموعات من الحيوانات 40 (استخدمت في هذه الدراسة مجموعة فئران 120) تم تقسيمها إلى مجموعات فرعية 2: مجموعة حقن PRP وحقنه مالحة التحكم في المجموعة. كانت التضحية الفئران في زيادة النقاط الزمنية (المجموعة ج: 5 أيام؛ المجموعة الثانية: 15 يوما؛ المجموعة جيم: 30 يوما)، وأزيلت الأوتار. 90 الأوتار خضع لاختبار النشاط الحيوي قبل إجراء تحليل ترانسكريبتوميك وقدمت 30 الأوتار المتبقية إلى التحليل النسيجي.

المقدمة

تخثر الدم والعمليات التحريضية وأدوار التحوير الحصانة من الصفائح الدموية هي معروفة جيدا1. في الآونة الأخيرة، وقد ثبت أن لها أيضا خصائص التصالحية2،3. والواقع أن مختلف العوامل السيتوكينات والنمو (VEGF، PDGF، TGF-ب، ومنتدى إدارة الإنترنت-الأول، وهجف) تم إصدارها من الصفائح الدموية أثناء تحبب. تعزيز عوامل النمو هذه الأوعية والأنسجة يعيد البناء، والجرح الشفاء (العظام، الجلد، والعضلات، ووتر)2. سينتريفوجينج الدم الذاتي تنتج الصفيحات الغنية البلازما (PRP) التي تحتوي على تركيزات عالية من الصفائح الدموية تبعاً لأسلوب العزل (بين 3 و 10 مرات الدم تركيزات خط الأساس). وفي الواقع، لا يمكن توفير مختلف تقنيات إعداد الحزب الثوري منتج نهائي متطابقة. وحتى الآن، كان هناك لا الدولي الاتفاق العام بشأن هذه المسألة. عموما، يمكن أن يكون الحزب الثوري خياراً جذاباً علاجية لعلاج الحالات العضلية الهيكلية المزمنة، مثل تيندينوباثي، والتهاب اللفافة، وهشاشة العظام، و نقابية4. أنها استخدمت للمرة الأولى في جراحة الفم وزراعة الأسنان4 تحسين وتسريع العظام الشفاء بعد وضع زرع الأسنان. في هذه الدراسة، ونحن تصف أسلوب استنساخه يسمح اكتساب الحزب الثوري للتجارب الحيوانية4.

منذ آفات الأوتار هي كثيرا ما لوحظ في الرياضيين والعمال المادية، تعزيز عملية الشفاء ومما يقلل من الوقت للتعافي باهتمام كبير5. طرق العلاج الجديدة التي تقوم بتطوير وكثيراً ما تنطوي على استخدام عوامل النمو، وإدارة الحزب الثوري وسيلة بسيطة وكسبها لتقديم مزيج من عوامل النمو الذاتية4.

أظهرت العديد من الدراسات في المختبر أو الحيوان أن إدارة بلازما تحتوي على مستوى عال من الصفائح الدموية، عن طريق الإفراج عن الوسطاء البيولوجية، يمكن أن تحفز إصلاح الوتر والرباط بالإفراج عن الوسطاء البيولوجي6 ،7،،من89. وعلاوة على ذلك، أظهرت دراسات أخرى أن الحزب الثوري الشعبي يمكن أن تحفز النوع الأول والثالث الكولاجين التوليف في وتر الخلايا9،،من1011. كما قيل أن الحزب الثوري الشعبي يمكن إنقاص تفعيل مصفوفة ميتالوبروتيناسيس (يتولى) وللحد من تدهور المصفوفة. يمكن أن تنتج الخلايا التي تشارك في عملية التهاب MMP-9، التي تلعب دوراً في إعادة الأنسجة عرض (الفسيولوجية وباثولوجي) الناجم عن التهاب12.

وبناء على هذه المعلومات، افترضنا أن حقنه PRP واحد في مقطعة الأوتار أخيل من الفئران يمكن أن يحسن عملية الانتعاش والقوة الميكانيكية لإصلاح الأنسجة. هذا هو اختبار قياس خصائص النشاط الحيوي الأوتار الشفاء أثناء عملية الاسترداد، وإجراء التحليلات الجزيئية والنسيجي لتقييم الكولاجين يعيد البناء في الأنسجة المكونة حديثا. وكان هدف الدراسة لمراقبة إذا حقنه واحدة من الحزب الثوري متمكنة يمكن أن تؤثر على الشفاء من مقطعة الأوتار أخيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الرعاية والمعالجة للحيوانات أجريت وفقا لدليل للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية أعدتها "الأكاديمية الوطنية للعلوم"، ونشرت بالمعاهد الوطنية للصحة (USA). وتلت التشريعات الأوروبية والوطنية بعناية.

1-إعداد الحيوان

  1. استخدام 132 الفئران سبراغ داولي شهرا 2-الذكور وزنها 320-450 غ (120 الفئران للتجريب) و 12 من الفئران لأخذ عينات من الدم، الرقم 1. استناداً إلى ديل13، 15 من الفئران لكل مجموعة كان كافياً بالنسبة قوة 0.8 (80% فرصة إيجاد دلالة إحصائية، في حالة وجود تأثير المحدد).
  2. منزل جميع الفئران في أقفاص الكلاسيكية في ظروف عزلة في منشأة تقليدية مزودة بمحطة متغيرة. التحريض على تربية في رف IVC (قفص فردي التهوية)، مع منتدى جنوب المحيط الهادئ (الحرة محددة الممرض) الفئران المشتراة على وجه التحديد.
  3. استخدام الشروط السكنية التالية: تتراوح درجة الحرارة بين 19-24 درجة مئوية؛ الرطوبة النسبية: 40-60 في المائة؛ التهوية: التردد لتجديد الهواء: 10-15 كل ح؛ دورة الضوء/الظلام: ح 12-12 ح.
  4. تعقيم جميع المعدات كاجينج واستخدام الأسرة المشع. عناصره تنفيذ تخصيب القفص عن طريق وضع علب الكرتون العقيمة والمناشف داخل الأقفاص.
  5. السماح بالوصول إلى المنطقة تحت شروط مقيدة: جديدة مختبر بونيه معطف، قناع، والقفازات، والأحذية، والشعر عند المدخل.
  6. القيام برصد الصحة مستعمرة على الحيوانات الحارس محبوسين في الفراش القذرة على أساس سنوي، وفقا للتوصيات14 فيلاسا للمرافق التقليدية. المحمضة إبقاء الحيوانات أربع أو خمس في قفص، مع المناسبة المشع النظام الغذائي وتوفير المياه libitum الإعلانية. رصد يوميا.
  7. نقل الفئران التي انتخبت للتدخل الجراحي في تصفية الأقفاص أعلى في غرف العمليات الجراحية ح 2 قبل الجراحة.

2-الجراحة

  1. إعداد الأدوات الجراحية: مقص، المشبك والمشابك مرقئ اثنين وحامل إبرة بشكل جيد. وخلال جميع الإجراءات، ارتداء قفازات وقناع وغطاء محرك السيارة ومعطف معمل.
  2. تقسيم الفئران عشوائياً إلى مجموعتين (الحزب الثوري والمحلول الملحي).
  3. إخراج الفئران من قفصة وتزن عليه. استخدام ترقيم العلامات الإذن للتعرف على الفئران. لتجنب جفاف العينين، ضع واتيردروبس على القرنية.
  4. تخدير الفئران إينترابيريتونيلي مع إكسيلازيني (10 مغ/كغ وزن الجسم) والكيتامين (80 ملغ/كغ وزن الجسم). لتأكيد أنيسثيتيزيشن، وضع الحيوانات تحت الرصد والتحقق من وجود أي ردود الفعل العين القلب والجهاز التنفسي.
  5. حقن 50 ميليلتر من البوبرينورفين تحت الجلد (0.01-0.05 مغ/كغ كل ح 8-12) في منطقة الرقبة كمسكن لألم.
  6. يحلق أطرافهم هند الأيسر مع ماكينة حلاقة كهربائية وتطهير أنه مع 3 دعك حل إيزو-تدين/الكحول (المخفف 01:10) بالتناوب ومكان الفئران على وسادة دافئة (20 درجة مئوية) تحت مجهر تشريح. وضع الفئران في استلقاء جانبية مع المحطة ليتم تشغيلها في وضع متفوقة. يجري في مخلب مع الملقط الجراحي.
  7. باستخدام المقص، جعل شق جانبية صغيرة (20-25 مم) في الجلد المحيطة بوتر أخيل الأيسر، وتشريح اللفافة استخدام مقص جيد لفضح وتر أخيل المعقدة (الشكل 2a).
  8. إزالة وتر بلانتاريس مع زوج من المقص (الشكل 2).
  9. قطع وتر أخيل مستعرضة 5 مم الدانية للإدراج الشوكة وإزالة جزء طويل 5 ملم باستخدام مقص. لا خياطة الوتر (الشكل 2 ج، 2d).
  10. خياطة اللفافة ثم الجلد مع الغزل ريسوربابل القيام خياطة عفريت (خياطة مستمرة). يمكن استخدام خيوط شعيرات، فضلا عن منع فتل من الجلد في الشق الجراحي.
  11. ضع الفئران تحت مصباح تدفئة حتى استيقظ ثم ثم ضع الفئران مرة أخرى في قفص (58 × 38 سم) (بيني الملاحظة: تفرض لا التثبيت).

3-PRP إعداد15

  1. تخدير الفئران المانحين مع إكسيلازيني (10 مغ/كغ وزن الجسم) والكيتامين (80 ملغ/كغ وزن الجسم) عن طريق الحقن داخل. ويتم حقن PRP ح 2 بعد دون أي إعادة-مخدر.
  2. حقن 50 ميليلتر من البوبرينورفين تحت الجلد كمسكن لألم.
  3. جمع الدم كله (20 مل كل فأر، ونزيف النهائي) بثقب القلب في أنابيب معقمة تحتوي على 3.2% مخزنة سترات الصوديوم (م 0.109، تخثر الدم). ثم euthanize في الفئران بحقن إينتراكاردياك.
  4. للحصول على الحزب الثوري، الطرد المركزي الدم لمدة 10 دقيقة في 150 × ز ودرجة حرارة الغرفة. تؤدي هذه الخطوة الأولية انخفاض سرعة الطرد المركزي مرحلتين متميزتين: مرحلة أقل تتألف من خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) التي تستأثر بنحو 80-90 في المائة الحجم الإجمالي، ومرحلة أعلى يتألف من البلازما الغنية بالصفائح الدموية (PRP) (عادة 10-20% الدم عينة).
  5. جمع الحزب الثوري (المرحلة العليا) في أنبوب بلاستيكي ثانوية استخدام ماصة نقل بلاستيك لطف. كما الواجهة بين الحزب الثوري وخلايا الدم الحمراء فضفاضة جداً، لا "الماصة؛" قريبة جداً إلى الواجهة. عند التعامل معها بشكل صحيح، تلويث كرات الدم الحمراء في الحزب الثوري ينبغي أن يكون أقل 0.05 × 103 خلايا/ميليلتر. تجاهل المرحلة الدنيا المتبقية وأنابيب جمع الدم الأولية.
  6. تحديد حجم تجمع الحزب الثوري وقياس الصفيحات في هو محلل الدم. تكون هذه القيم المطلوبة لإجراء العمليات الحسابية لضبط تركيز الصفائح الدموية في الخطوة التالية. عدد خلايا الدم أيضا مفيدة لتقييم التلوث المحتملة مع كرات الدم الحمراء وتركيز الكريات البيضاء. الصفائح الدموية في الحزب الثوري في هذه المرحلة هو عادة 1 – 1.5 x106/µL.
  7. إجراء الطرد المركزي ثاني للحزب الثوري الشعبي لمدة 10 دقيقة في 1,000 س ز ودرجة حرارة الغرفة. تؤدي هذه الخطوة الطرد المركزي عالية السرعة بيليه الصفيحات فضفاضة والمادة طافية يتألف من البلازما الصفائح الدموية-الفقراء ذاتي (تعادل القوة الشرائية). استخدام القيم التي تم تحديدها في الخطوة 3، 6، حساب حجم المادة طافية لإهمالها للتركيز الحزب الثوري والتوصل إلى تركيز نهائي 2.5 x106/µL.
  8. بلطف بجمع المادة طافية (تعادل القوة الشرائية) في أنبوب بلاستيكي ثانوية استخدام ماصة نقل بلاستيك، ترك حوالي ثلثي حجم النهائي المحسوبة في الخطوة 3، 7. كما بيليه فضفاض، كمية كبيرة من الصفائح الدموية يتم فقدان عندما يتم تجاهل تعادل القوة الشرائية، ومن ثم يحتمل أن يقلل التركيز النهائي المطلوب.
  9. ريسوسبيند بيليه الصفيحات مع المادة طافية المتبقية بعناية قبل لطيف بيبيتينج المتكررة. قياس عدد الصفائح الدموية في هذا الحزب الثوري مركزة. إذا لزم الأمر، إضافة إلى حجم مناسب ذاتي تعادل القوة الشرائية للوصول إلى تركيز الهدف النهائي.
    ملاحظة: استخدم PRP ضمن ح 3 من إعداد.
  10. إضافة 50 ميليلتر من كاكل2 (11 mEq 10 مل) كل مل من الحزب الثوري لتنشيط الصفائح الدموية.
  11. حقن 50 ميليلتر من الحزب الثوري الطازجة أو المحلول الملحي بإبرة ز 21 مباشرة في موقع خياطة العملية حوالي 1 ساعة بعد إعداد. وخلال هذا الوقت، يبقى الحزب الثوري في درجة حرارة الغرفة.
  12. رصد الانتعاش وظيفية من الفئران عن كثب خلال الأيام بعد الجراحة، وقبل إزالة وتر أخيل.

4-إزالة العرقوب واختبار النشاط الحيوي16

  1. 5 أو 15 أو 30 يوما بعد5، وزن الفئران. ثم تخدير مع إكسيلازيني (10 مغ/كغ وزن الجسم) والكيتامين (80 ملغ/كغ وزن الجسم) عن طريق الحقن داخل.
  2. حقن 50 ميليلتر من البوبرينورفين تحت الجلد كمسكن لألم. إزالة الوتر قبل التضحية بالحيوان للحفاظ على الظروف الفسيولوجية لأطول فترة ممكنة.
  3. يحلق أطرافهم هند الأيسر ومكان الفئران تحت مجهر تشريح. وضع الفئران في استلقاء جانبية مع المحطة ليتم تشغيلها في وضع متفوقة. عقد الكف مع الأصابع.
  4. إجراء شق صغير (10 مم) في موقع العملية السابقة ويمدد حتى يتم كشف سوراليس الرؤوس.
  5. لإزالة العرقوب الشفاء، قص عظم العقب مستعرضة 5-10 ملم القاصي إلى تمسكه العرقوب. ثم تشريح جزء من سوراليس الرؤوس، التي أرفقت بوتر أخيل (الشكل 3b). الجزء العضلات قد تكون كبيرة بما يكفي لتناسب في البرد-الفك (الشكل 3 ج-د). ضع العينة فورا في البرد-الفك باستخدام الملقط (3e الشكل).
  6. بعد إزالة مجمع العضلات والعظام-وتر، euthanize الفئران بحقن إينتراكاردياك مع نيمبوتال (200 مغ/كغ). تأكيد وفاة بتقدير عدم وجود ضربات القلب والتنفس لمدة 15 دقيقة.
  7. ضع وحدة العضلات في الفك العلوي (3e الشكل) وإغلاقه ووضعه رأسياً في عالمي اختبار الجهاز (106.2 kN، الشكل 3 ألف). ثم إصلاح العظام بين المشابك أقل من الجهاز (3f الشكل).
  8. إضافة النيتروجين السائل في كلا من أحواض الفك العلوي تجميد العضلات، حتى وهو أمر من حجم أغلظ من الوتر ولا تشوه أثناء اختبار الشد.
  9. عندما تصل إلى منطقة تجميد الحدود المشبك المعدني، وبدء اختبار الشد، حتى الوتر سوف تحافظ على هيكلها. تعيين معدل النزوح من الجهاز بسرعة ثابتة من 1 مم/s حتى تمزق. سجل في نهاية المطاف قوة الشد (إقليم اتحادي) النظر في نيوتن (N) على جهاز كمبيوتر.
  10. لحساب مساحة مقطعية، مكان اثنين من الكاميرات متعامدة على بعضها البعض، تشكل على شكل بيضاوي الشكل، والتقاط الصور.
  11. لحساب الفرق في مساحة مقطعية الأوتار الشفاء، تطبيع إقليم اتحادي لوحدة مساحة (ن كل ملليمتر مربع)، الذي يمثل الضغط الميكانيكي من ذوي الخبرة بالانسجة.

5. تحليل النسيجي

ملاحظة: الأوتار 15 لكل مجموعة خضعت للتحليل النسيجي.

  1. بعد إزالتها، تغرق العرقوب فورا في بارافورمالدهيد 4% للحفاظ على هيكلها (1 مم أنسجة يتم إصلاح كل ساعة، حتى وقت التثبيت يختلف تبعاً لحجم الوتر).
  2. استبدال بارافورمالدهيد واسطة الإيثانول 70% وتترك العينة لليلة واحدة على الأقل في هذا الحل.
  3. ضع الوتر في حاوية بلاستيكية صغيرة ذات ثقوب ومكان تلك الحاوية في محلول إيثانول 70% طازجة ح 1.
  4. كرر مكان الحاوية في الإيثانول 95% حاء – 1.
  5. كرر مكان الحاوية في الإيثانول 100% حاء – 1.
  6. كرر مكان الحاوية في زيلين نفط 100% حاء – 1.
  7. الآن مكان الحاوية البلاستيكية، التي تحتوي على الوتر، في البارافين السائل (56 درجة مئوية) وترك الأمر بين عشية وضحاها.
  8. باستخدام محطة تضمين (مجهزة بالشمع المنصهر وصفيحة ساخنة، وصفيحة باردة)، اختر قالب معدني الذي يناسب عينة الأنسجة، وملء مع البارافين السائل قليلاً حيث أنه يغطي القاعدة.
    ملاحظة: توجيه العينة للحصول على المقاطع العمودية في مبضع.
  9. عندما يتم وضع العينة بشكل صحيح، تملأ القالب مع البارافين السائل ووضعه على آلة التبريد. ندعه يبرد لمدة 15 دقيقة على الأقل.
  10. إزالة من كتلة البارافين ووضعه على الجليد لمدة 30 دقيقة على الأقل.
  11. إعداد العديد من الشرائح الزجاجية النظيفة ووضع بعض قطرات من المياه عليها.
  12. في مبضع، قص القطع في الأقسام من 5 ميكرومتر (فقط استخدام مقاطع من الجزء الأوسط من الوتر) ووضع المقطع على شريحة.
  13. ضع الشرائح في فرن تدفئة في 65 درجة مئوية لعدة دقائق، حتى البارافين يبدأ فقط لإذابة للسندات الأنسجة للزجاج.
  14. ضع الشرائح التي تحتوي على مقاطع البارافين في حامل شريحة.
  15. الآن ديبارافينيزي وترطيب الأنسجة بوضعه في الحمامات المتعاقبة التالية:
    8 دقيقة في زيلين نفط (حمام 1)
    4 دقيقة في زيلين نفط (حمام 2)
    2 دقيقة في الإيثانول 100%
    2 دقيقة في الإيثانول 95%
    2 دقيقة في الإيثانول 70%
    2 دقيقة في المياه.
  16. الهيماتوكسيلين ويوزين تلطيخ، وضع الأنسجة في الحلول التالية.
    1. تزج الأنسجة ل 8 دقيقة في حل الهيماتوكسيلين (مونوهيدرات الهيماتوكسيلين ز 1، ز 0.2 الكويتي3، 50 غ AIK (هكذا4)2.12H2س؛ الغليسرين 200 مل؛ ضبط إلى 1 لتر بالماء المقطر).
    2. تزج الأنسجة لمدة 8 دقائق تحت ماء الصنبور الجاري.
    3. تزج الأنسجة لمدة 30 ق في حل ويوزين (0.25% ثم في 100 مل ماء المقطر الذي يحتوي على 200 ميليلتر من حمض الخليك غير مخفف).
    4. تزج الأنسجة لمدة 2 دقيقة تحت ماء الصنبور الجاري.
  17. "تلوين" ماسون تريتشرومي، اتبع الخطوات التالية.
    1. بعد الإماهة، وضع المقاطع في حاوية مع الشب الحديد (0.5 غ (NH4) Fe (هكذا4)2.12H2س في 10 مل ح2س) وإغلاق الحاوية. الحرارة التسجيل 3 دقيقة في 280 ث في فرن ميكروويف.
    2. ندعه يبرد لمدة دقيقة وثم شطفة بالمياه.
    3. وضع المقاطع في حاوية مغلقة مع الحل توضع في ريجو (0.5 ز توضع حله في 50 مل ح2س عند 50 درجة مئوية، ثم إضافة الإيثانول 95% 5 مل و 5 مل الغليسرين)، الحرارة النسبة 90 s في 280 جورج
    4. شطفة بالمياه.
    5. وضع المقاطع في محلول حمض البكريك (في درجة الإشباع في الميثانول) لمدة 3 دقائق، وشطف لمدة 5 دقائق تحت ماء الصنبور الجاري وثم وضعه في المياه لبضع ثوان.
    6. الآن وضع المقاطع في فوكسين حمض (0.5 ز في 50 مل ح2س يحتوي على 0.25 مل حمض الخليك غير مخفف) 5 s وشطف تحت حنفية الماء الجاري حتى تختفي الصبغة.
    7. احتضان المقاطع في حل حامض فوسفوموليبديك (0.5 ز في 50 مل ح2س) لمدة 5 دقائق، ووضعها لبضع ثوان في المياه.
    8. وضع المقاطع في حل الضوء الأخضر (0.5 ز في 50 مل ح2س يحتوي على 0.25 مل حمض الخليك غير مخفف) لمدة 5 دقائق أخرى ووضعه تحت حنفية الماء الجاري حتى تختفي الصبغة.
  18. الآن يذوي الأنسجة مرة أخرى.
    1. تزج القسم لمدة 1 دقيقة في الإيثانول 70%.
    2. تزج القسم لمدة 1 دقيقة في الإيثانول 95%.
    3. تزج القسم لمدة 1 دقيقة في الإيثانول 100%.
    4. تزج القسم لمدة 1 دقيقة في زيلين نفط (حمام 1).
    5. تزج القسم لمدة 1 دقيقة في زيلين نفط (حمام 2).
    6. إزالة المقاطع دون إزالة زيلين نفط أكثر من اللازم ووضع قطره من تصاعد المتوسطة العينة.
    7. وضع ساترة على أعلى (بدون إثارة أي فقاعات) وأتركها تتصلب على الأقل 2 ح.
    8. يتحلل 5 أقسام نسيجية (كل منها وتر مختلفة) لكل مجموعة في 6 N HCl ح 3 وتحديد تركيز الكولاجين عن طريق قياس برولين كمؤشر في 5 ميكرومتر أونستينيد أقسام.
  19. تطبيع النتائج حسب منطقة مقطع باستخدام البرنامج الخاص بالشركة المصنعة.
  20. وصمة بعض الأبواب مع "الضوء الأخضر وصمة عار" لتصور وتحديد كمية الكولاجين فيبريلار بمساعدة الحاسوب التحليل.
  21. مسح المقاطع وتحويل الصور في ظلال رمادي باستخدام البرمجيات [ايرفنفيو]. استخدام البرنامج لشبه الكمي (مثلاً، واحد الكمية).

6-الجزيئية التقييم

  1. بعد تمزق وتر، التي تحدث أثناء اختبار الميكانيكية، أخذ العينات، والأداة تجميدها في نيتروجين سائل، وتخزينها في-80 درجة مئوية (الحزب الثوري والمحلول الملحي)17.
  2. استخدام أدوات "مجموع الجيش الملكي النيبالي" تجارية لعزل الحمض النووي الريبي إجمالي17.
  3. قياس التعبير عن الكولاجين (العمود الأول والعمود الثالث)، "ميتالوبروتيناسيس مصفوفة" (MMP-2 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-3 ونظام التمثيل التناسبي المختلط-9)، وتينومودولين (تنمد) RT-PCR17،18.
  4. تطبيع مستويات التعبير مرناً لمستويات 28S19.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

النتائج التي يتم التعبير عنها ك ± متوسط الانحراف المعياري للوسط وقورنت مع تحليل التباين (ANOVA). اتجاهين ANOVA و وظيفة المخصص اختبار دي Scheffé، وهو اختبار حدودي، واستخدمت.

كانت قوة الشد النهائي (إقليم اتحادي) المطلوبة لإثارة تمزق الأوتار أخيل غير مضرورة من الفئران ± 42.0 5.7 N (n = 10). قوة الشد زيادة كبيرة (ف < 0.0001) في كلتا المجموعتين بعد يوم 5. المقارنة بين كلا الفريقين، إقليم اتحادي كان أعلى في مجموعة الحزب الثور...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

الصفائح الدموية ضرورية للمرحلة المبكرة التحريضية لوتر عملية الشفاء. عند هذه الصفائح معرضة بربط الأنسجة أو العوامل التي تسبب تخثر الدم، أنها ستفرج عن عوامل النمو التي تخزن في حبيبات α. نتيجة لهذا التفاعل، والجزيئات المصفوفة خارج الخلية سينثيتيزيد وتتكاثر الخلايا الوسيطة. الصفائح الدموية لها أيضا بنشاط تشيموتاكتيك على خلايا السلف في الدورة الدموية، تعزيز الأوعية ويحفز التمايز الخلوي6،20.

تم اختبار النشاط الحيوي باستخدام جهاز لقط صنعت خصي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

وأعلن لا تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

هذه الدراسة وأيده ستاندار دو لييج، ومنح لوجون-ليتشين الأموال Frédéricq ليون.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Xylazine (Xyl-M)VMDلا يوجدمخدر
Ketamin (J & eacute; tamine 1000 CEVA)CEVA Sant & eacute; AnimalenoneAnesthetic
Buprenorphin (Vetergé sic Multidosis)ALSTOEnoneمسكن للألم
iso-BetadineMEDA-Pharmanoneخيوط مطهرة
قابلة للامتصاص Vicryl 6/0Johnson & amp جونسون
نيمبوتالسيفا سانت & إيكوت. Animalenoneمخدر
ParaformaldehydeSigma-AldrichP6148يحافظ على بنية الأنسجة
الأيزوبروبانول 100٪VWR20،922،364
الإيثانول 95٪VWR20،823،362
الزيلينVWR28973.363
البارافينVWRLEIC3950.1006
الهيماتوكسيلينMillipore1.15938.0025تلوين
EosinMillipore1.15935.0100Colorant
EukittSigma-Aldrich3989تصاعد متوسط
CaCl2

المراجع

  1. Kaux, J., Degrave, N., Crielaard, J. Platelet rich plasma traitement des tendinopathies chroniques? Revue de la littérature. Platelet rich plasma treatment of chronic tendinopathies? Review of literature. J. Traumatol. du Sport. 24, 99-102 (2007).
  2. Anitua, E., et al. Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. J. Orthop. Res. 23, 281-286 (2005).
  3. Bosch, G., et al. Effects of platelet-rich plasma on the quality of repair of mechanically induced core lesions in equine superficial digital flexor tendons: A placebo-controlled experimental study. J. Orthop. Res. 28, 211-217 (2010).
  4. Kaux, J. F., Drion, P., Croisier, J. L., Crielaard, J. M. Tendinopathies and platelet-rich plasma (PRP): From pre-clinical experiments to therapeutic use. J. Stem Cells Regen. Med. 11, P7-P17 (2015).
  5. Maffulli, N., Wong, J., Almekinders, L. C. Types and epidemiology of tendinopathy. Clin. Sports Med. 22, 675-692 (2003).
  6. Molloy, T., Wang, Y., Murrell, G. The roles of growth factors in tendon and ligament healing. Sports Med. 33, 381-394 (2003).
  7. Lyras, D. N., et al. The effect of platelet-rich plasma gel in the early phase of patellar tendon healing. Arch. Orthop. Trauma Surg. 129, 1577-1582 (2009).
  8. Aspenberg, P., Virchenko, O. Platelet concentrate injection improves Achilles tendon repair in rats. Acta Orthop. Scand. 75, 93-99 (2004).
  9. Visser, L. C., et al. Growth Factor-Rich Plasma Increases Tendon Cell Proliferation and Matrix Synthesis on a Synthetic Scaffold: An In Vitro Study. Tissue Eng. Part A. 16, 1021-1029 (2010).
  10. Zhang, J., Wang, J. H. -C. Platelet-Rich Plasma Releasate Promotes Differentiation of Tendon Stem Cells Into Active Tenocytes. Am. J. Sports Med. 38, 2477-2486 (2010).
  11. Kajikawa, Y., et al. Platelet-rich plasma enhances the initial mobilization of circulation-derived cells for tendon healing. J. Cell. Physiol. 215, 837-845 (2008).
  12. Pasternak, B., Aspenberg, P. Metalloproteinases and their inhibitors-diagnostic and therapeutic opportunities in orthopedics. Acta Orthop. 80, 693-703 (2009).
  13. Dell, R. B., Holleran, S., Ramakrishnan, R. Sample size determination. ILAR J. 43, 207-213 (2002).
  14. Mähler Convenor, M., et al. FELASA recommendations for the health monitoring of mouse, rat, hamster, guinea pig and rabbit colonies in breeding and experimental units. Lab. Anim. 48, 178-192 (2014).
  15. Kaux, J. -F., et al. Étude comparative de cinq techniques de préparation plaquettaire (platelet-rich plasma). Pathol. Biol. 59, 157-160 (2011).
  16. Wieloch, P., Buchmann, G., Roth, W., Rickert, M. A cryo-jaw designed for in vitro tensile testing of the healing Achilles tendons in rats. J. Biomech. 37, 1719-1722 (2004).
  17. Kaux, J. -F., et al. Vascular Endothelial Growth Factor-111 (VEGF-111) and tendon healing: preliminary results in a rat model of tendon injury. Muscles. Ligaments Tendons J. 4, 24-28 (2014).
  18. Docheva, D., Hunziker, E. B., Fässler, R., Brandau, O. Tenomodulin is necessary for tenocyte proliferation and tendon maturation. Mol. Cell. Biol. 25, 699-705 (2005).
  19. Lambert, C. A., Colige, A. C., Munaut, C., Lapière, C. M., Nusgens, B. V. Distinct pathways in the over-expression of matrix metalloproteinases in human fibroblasts by relaxation of mechanical tension. Matrix Biol. 20, 397-408 (2001).
  20. Nurden, A. T., Nurden, P., Sanchez, M., Andia, I., Anitua, E. Platelets and wound healing. Front. Biosci. 13, 3532-3548 (2008).
  21. Woodall, J., Tucci, M., Mishra, A., Benghuzzi, H. Cellular effects of platelet rich plasma: a study on HL-60 macrophage-like cells. Biomed. Sci. Instrum. 43, 266-271 (2007).
  22. Taylor, D. W., Petrera, M., Hendry, M., Theodoropoulos, J. S. A systematic review of the use of platelet-rich plasma in sports medicine as a new treatment for tendon and ligament injuries. Clin. J. Sport Med. 21, 344-352 (2011).
  23. Mazzocca, A. D., et al. The positive effects of different platelet-rich plasma methods on human muscle, bone, and tendon cells. Am. J. Sports Med. 40, 1742-1749 (2012).
  24. McCarrel, T. M., Minas, T., Fortier, L. A. Optimization of leukocyte concentration in platelet-rich plasma for the treatment of tendinopathy. J. Bone Joint Surg. Am. 94 (1-8), e143(2012).
  25. Boswell, S. G., et al. Increasing platelet concentrations in leukocyte-reduced platelet-rich plasma decrease collagen gene synthesis in tendons. Am. J. Sports Med. 42, 42-49 (2014).
  26. Virchenko, O., Aspenberg, P. How can one platelet injection after tendon injury lead to a stronger tendon after 4 weeks?: Interplay between early regeneration and mechanical stimulation. Acta Orthop. 77, 806-812 (2006).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة