مقالة منهجية

تقنيات المختبر تستخدم للحفاظ على والتمايز بيوتيبس ضمة الكوليرا العوازل السريرية والبيئية

DOI:

10.3791/55760

⸱

مايو 30, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Plymouth State University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتصف هذه المخطوطة تقنيات صيانة الكوليرا فيبريو المناسبة بالإضافة إلى سلسلة من المقايسات الكيميائية الحيوية، وتستخدم بشكل جماعي للتمييز السريع والموثوق به بين السريرية والبيئية V. كوليراي، بيوتيبس، إلى داخل، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، المختبر، الإطار.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البكتيريا السالبة الغرام المائية فيبريو الكوليرا هي العامل المسببة للكوليرا المعدية المعوية المرض. بسبب الانتشار العالمي وشدة هذا المرض، V. وقد تم دراسة الكوليرا على نطاق واسع في كل من البيئة والمختبرات البيئات، التي تتطلب الصيانة المناسبة وتقنيات زراعة. الكلاسيكية و إل تور نوعان بيولوجي رئيسيان يؤلفان V. الكوليرا O1 المصلية، كل منها عرض الخصائص الوراثية والمظهرية فريدة من نوعها التي توفر آليات موثوقة لتوصيف النمط البيولوجي، وتتطلب فوعة متميزة تحفز ظروف زراعة. وبغض النظر عن النمط الحيوي للسلالة المسببة لأي عدوى أو تفشي معين، فإن العلاج المعياري للمرض ينطوي على العلاج بالإماهة المكمل مع نظام من المضادات الحيوية. ومع ذلك، قد يكون تصنيف النمط البيولوجي ضروريا للدراسات المختبرية وقد يكون له تأثيرات أوسع في مجال الطب الحيوي.في أوائل عام 2000 تم التعرف على العزلات السريرية التي تظهر سمات النمط الوراثى والمظاهر الظاهرية من كل من البيوتيب الكلاسيكية و إل تور. وقد تسببت الهجينة التي تم تحديدها حديثا، والتي يطلق عليها اسم متغيرات إل تور، في عزل بيوئي سريري وبيئي ليصبح أكثر تعقيدا من البروتوكولات التقليدية السابقة لتحديد الهوية. بالإضافة إلى وصف V. ( كتكسب و تكبا ) الشاشات الوراثية المستندة إلى ير والفحوصات المظهرية (بوليميكسين B المقاومة، الأيض سترات، النشاط بروتين، النشاط الانحلالي، الحركة، واستقلاب الجلوكوز عبر Voges- بروسكاور مقايسة) تستخدم بشكل جماعي لتمييز و / أو التمييز بين النمط الكلاسيكي والتور بيوتيبس. معا، هذه المقايسات توفر نهجا منهجيا فعالا لاستخدامها كبديل، أو بالإضافة إلى ذلك، مكلفة، والتجارب كثيفة العمالة في تشاراكتريزاتيون أوف V. الكوليرا السريرية (والبيئية) العزلات.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكوليرا مرض في الأمعاء الدقيقة البعيدة الناجمة عن استهلاك المواد الغذائية الملوثة أو المياه التي تحتوي على بكتيريا سلبية الغرام المائية فيبريو الكوليرا . وتشمل أعراض الكوليرا القيء والإسهال المائي الذي لا يمكن السيطرة عليه، مما يؤدي إلى الجفاف الشديد، والذي إذا لم يعالج بشكل صحيح، سيؤدي إلى الوفاة. V. الكوليرا يمكن تقسيمها إلى أكثر من 200 المجموعات المصلية على أساس هيكل سطح الخلية عديد السكاريد O- المستضد. ومع ذلك، أظهرت فقط 2 المجموعات المصلية، O1 و O139، وباء أو جائحة المحتملة 1 ، 2 . وعلاوة على ذلك، كانت المجموعة المصلية O139 معزولة في المقام الأول إلى جنوب شرق آسيا 3 ، 4 ، في حين يتم توزيع المجموعة المصلية O1 في جميع أنحاء العالم. وعلاوة على ذلك، يمكن تقسيم المجموعة المصلية O1 إلى 2 بيوتيبس الرئيسية: الكلاسيكية و إل تور. وكان النمط البيولوجي الكلاسيكي مسؤولا عن أول وباء للكوليرا 6بين عامي 1817 و 1923. الجائحة السابعة الحالية هي نتيجة للنمط الحيوي إل تور، الذي نزح عالميا النمط البيولوجي الكلاسيكي في البيئة 5 ، 6 ، 7 . في الآونة الأخيرة، نشأت سلالات التي تحتوي على الخصائص المميزة لكل من البيوكاليب الكلاسيكية و إل تور 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 ومنذ ذلك الحين كانت تسمى متغيرات الطور 13 ، 17 . وقد أظهرت بعض المتغيرات إل تور قدرات الفوعة مرتفعة مع تطور المرض السريع والحاد أكثر مما لوحظ سابقا، مؤكداوالحاجة إلى نهج أكثر شمولا لتحديد هوية الوكلاء والوقاية من الأمراض والعلاج 8 ، 9 ، 18 . في حين أن تحديد النمط الحيوي لا يملي على الفور العلاج، قد تستفيد المزيد من التقدم في تطوير اللقاحات وكلاء العلاجية في المستقبل من التمييز بيوتيب.

السلسلة الأولى من البروتوكولات المدرجة هنا سوف تمكن المحققين من الحفاظ على V بشكل صحيح. كوليراي، السلالات، إلى داخل، أداة تعريف إنجليزية غير معروفة، المختبر، الإطار. ويتطلب الاتساق والتحليل اللاحق إعداد المخزونات ونمو العزلات التي لا تعتمد على النمط الحيوي. ومع ذلك، على النحو الأمثل للحث على الفوعة التعبير الجيني، مطلوبة بيوتيب تقنيات زراعة مستقلة مستقلة 19 . بالإضافة إلى ذلك، تم إعداد التحضير لمختلف المقايسات الوراثية والبيوكيميائية في هذه المخطوطة.

سرطان الكوليرا (كت) والسمية المشتركة(تكب) هما نوعان من عوامل الفوعة الرئيسية التي يسيطر عليها المنظم الرئيسي توكست في كلا النوعين من V. الكوليرا O1 سيروغروب 20 . كت هو ثنائي السموم يتكون من خمسة كتكس الوحدات الفرعية المحيطة وحدة واحدة كتكسا، وهي المسؤولة عن فقدان بالكهرباء السريع المرتبطة الكوليرا. تكب هو نوع من الطفرة إيف المشفرة من قبل تكب أوبيرون ( تكبابكردستف )، وتشارك في مرفق واستعمار الأمعاء الدقيقة البعيدة. تكبا هو الجين الأول من تكب أوبيرون الذي ترميز وحدات البيلين الفردية الضرورية لبناء بيلوس 8 . يتم حفظ تسلسل الجينات ل كتكسا تماما بين النمط الكلاسيكي و إل تور بيوتيبس ، في حين أن كتسب و تكبا تختلف عبر اثنين من بيوتيبس ولكن يتم حفظها داخل كل النمط الحيوي 8 . يتم حفظ كتكس تماما بين الأنواع الحيوية إلا في اثنين بوسي قاعدة(115 و 203). في النمط الحيوي إل تور، ثيمين يقيم في المواقف الأساسية 115 و 203، في حين أن النمط الحيوي الكلاسيكي يحتوي على السيتوزين في هذه القواعد. يتم حفظ تكبا تماما داخل كل نوع بيوتيب، ولكن تختلف في قواعد متعددة بين الأنماط الحيوية. هذه التمايز الجيني بمثابة علامات تحديد النمط الحيوي الأولي، وبعد تسلسل المنتج تضخيم البوليميراز (ير) المنتج بما في ذلك هذه المواقع، ويمكن مقارنة تسلسل عزل البرية نوع (وت) الكلاسيكية O395 أو وت إل تور N16961 لتحديد الخلفية النمط الحيوي من كت و تكب، على التوالي، في عزل V الكوليرا .

وقد وضعت العديد من البروتوكولات لتمييز الفوارق المظهري بين الكلاسيكية و إل تور بيوتيبس 21 ، 22 ، 23 . بوليميكسين B هو مضاد حيوي الببتيد الذي يضر بسلامة غشاء الخلية الخارجية في البكتيريا سلبية الغرامتيريا، ومقاومة بوليميكسين B يمكن تصور من خلال فحص البوليمكسين B المقاومة 21 . السيترات هو الركيزة الأساسية لدورة كريب، والقدرة على استقلاب سترات كمصدر وحيد الكربون يمكن تحديدها باستخدام فحص الأيض سترات 22 . هابر ترميز منظم عالمي والمنظم النصاب النصاب في V. الكوليرا، هابر، الذي يرتبط إلى مختلف المناطق المروج وينظم الجينات والتعبير أوبيرون 24 . بعض السلالات المسببة للأمراض من ضمة الكوليرا لها طفرة تحول الإطار بشكل طبيعي في الجين هابر التي تسببت في هذا التنظيم تعتمد على الكثافة من الفوعة التعبير الجيني إلى أن تفقد 24 ، 25 . قياس النشاط البروتيني هابر باستخدام وسائل الإعلام آغار الحليب يسمح للباحث لتحديد ما إذا كان عزل معين يحتوي على هابر وظيفية 23 . الانحلال الدم اختبارات الفحص لقدرة سلالة لإفراز الإنزيمات الانحلالية التي تحلل خلايا الدم الحمراء. يمكن أن تصور درجة انحلال الدم على لوحات أجار الدم 23 . وغالبا ما ترتبط الحركة مع الفوعة في ضمة الكوليرا ويمكن تحليلها باستخدام لوحات أجار الحركة 23 . اختبارات فوجيس-بروسكور فحص لقدرة سلالة لتخمر الجلوكوز كمصدر وحيد الكربون وإنتاج أسيتوين ثانوي 21 . مع ظهور المتغيرات إل تور، فمن الصعب التنبؤ نتائج أي فحص المظهري معين دون فحص وراثي واسع، وقبل استنتاج الخلفية بيوتيب من V. العزلات الكوليرا ، فمن المستحسن لأداء هذا التجمع من المقايسات 23 ومقارنة النتائج لسلالات مرجعية كما هو موضح في الجدول 2 .

هنا، قدمنا ​​سلسلة من البروتوكولات، والاستفادة بشكل جماعي من أفوريمنتيونيد وراثي والمظاهر الظاهرية لنهج أكثر شمولا لوصف V. الكوليرا . وعلاوة على ذلك، فقد وصفنا التمايز الجيني والمظاهر الظاهرية من V المعروفة. الكوليرا المتغيرات إل (MQ1795 و با-2163)، بالمقارنة مع السلالات المرجعية النمط البيولوجي تستخدم عادة (وت الكلاسيكية O395، وت إل تور C6706، و وت إل تور N16961؛ الجدول 1 ). وقد ظهرت ظهور المتغيرات إل تور تحديات لموثوقية من قبل واحد فحص بروتوكولات التوصيف النمط البيولوجي مقايسة؛ ومع ذلك، فإن هذا نظام تحديد مقايسة متعددة تسمح لتوصيف أكثر موثوقية من الخامس والبيئية السريرية. عزلة الكوليرا .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يجب أن تؤخذ اعتبارات الوقت لكل فحص كما تتطلب الاستعدادات وسائل الإعلام الفردية أوقات مختلفة. على سبيل المثال، ينبغي السماح لوسائل لوحة أجار الصلبة لتبرد بما فيه الكفاية وجافة (1-2 أيام). يتم تحديد اعتبارات الوقت الإضافي ( أي مستعمرة واحدة ونمو الثقافة بين عشية وضحاها) في كل بروتوكول ويرد في الجدول 2 .

1. إعداد وسائل الإعلام

  1. 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس)
    1. تزن 4.0 غرام كلوريد الصوديوم، 0.1 غرام بوكل، 0.72 غرام نا 2 هبو 4 ، و 0.12 غرام خ 2 بو 4 . الجمع بين المكونات في قارورة إرلنماير 1 لتر، وضبط حجم إلى 500 مل مع الماء منزوع الأيونات، وضبط درجة الحموضة إلى 7.2 باستخدام مقياس الرقم الهيدروجيني وإضافة هكل قطرة قطرة إلى الحل، وتعقيم الأوتوكلاف أو تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. 1X بس يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة إلى أجل غير مسمى.
      تنبيه: حمض الهيدروكلوريك هو حمض مركزة ويجب التعامل معها وفقاإلى اللوائح المؤسسية والمحلية، والولائية، والاتحادية. للحصول على إرشادات التعامل المناسبة، يرجى الرجوع إلى ورقة بيانات السلامة المقدمة من قبل الشركة المصنعة.
  2. لوريا-بيرتاني (لب) مرق
    1. تزن 5.0 غرام تريبتون، 2.5 غرام استخراج الخميرة، و 2.5 غرام كلوريد الصوديوم. الجمع بين المكونات في زجاجة 1 لتر، وضبط حجم إلى 500 مل مع الماء منزوع الأيونات، الأوتوكلاف، وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر. لبيولوجية النمط البيولوجي الفوعة تسبب الظروف، وضبط درجة الحموضة إلى 6.5 باستخدام حمض الهيدروكلوريك قبل التعقيم.
  3. أكي متوسطة تحتوي على 0.03٪ (ث / ت) ناهكو 3
    1. للمكون 1 (وسط أكي): وزن 7.5 غرام من الببتون، 2.0 غرام استخراج الخميرة، و 2.5 غرام كلوريد الصوديوم. الجمع بين المكونات في زجاجة 1 لتر، وضبط حجم إلى 450 مل مع الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف. أكي المتوسطة يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    2. للمكون 2 (ناهكو 3 ): تزن 1.5 غرام ناهكو 3 ، وضبط حجمإلى 50 مل مع الماء منزوع الأيونات في حويصلة معقمة. تصفية تعقيم ناهكو 3 باستخدام فلتر 0.22 ميكرون. ناهكو 3 يجب أن يكون مستعدا على الفور قبل الاستخدام.
    3. الجمع بين العقيم مكونة معقمة إنشاء نسبة 01:10 عن طريق تصفية المكون 2 في المكون 1 قبل استخدامها.
  4. لوريا-بيرتاني (لب) أجار لوحات
    1. تزن 5.0 غرام تريبتون، 2.5 غرام استخراج الخميرة، 2.5 غرام كلوريد الصوديوم، و 7.5 غرام أجار. الجمع بين المكونات في قارورة إرلنماير 1 لتر، وضبط حجم إلى 500 مل مع الماء منزوع الأيونات، الأوتوكلاف، وإعداد في حجم قياسي 100 مم × 15 ملم أطباق بتري معقمة. وسائل الإعلام مطلي يمكن تخزينها ملفوفة في البلاستيك لمدة تصل إلى 6 أشهر، غطاء الجانب حتى في 4 درجات مئوية.
  5. لب أجار لوحات مكملة مع بوليميكسين B
    1. للمكون 1 (لب أجار): تزن 5.0 غرام تريبتون، 2.5 غرام استخراج الخميرة، 2.5 غرام كلوريد الصوديوم، و 7.5 غرام أجار. الجمع بين المكونات في قارورة إرلنمير 1 لتر، وضبط حجم إلى 500 مل وايدي الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف.
    2. للمكون 2 (بوليميكسين B): حل بوليميكسين B في الماء منزوع الأيونات في معقمة أنبوب مل ميكروسنتريفوج 2 مل لتركيز 50،000 وحدة دولية / ميكرولتر وتصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون.
    3. مرة واحدة المكون 1 هو بارد لمسة، ولكن لم تصلب بعد، إضافة العقيم 500 ميكرولتر من المكون 2 إلى المكون 1 خلق تركيز النهائي من 50 وحدة دولية / ميكرولتر وتخلط جيدا. إعداد في الحجم القياسي 100 مم × 15 ملم أطباق بتري العقيمة عن طريق صب وسائل الإعلام أجار مختلطة في أطباق بتري. وسائل الإعلام مطلي يمكن تخزينها ملفوفة في البلاستيك لمدة تصل إلى 3 أشهر، غطاء الجانب حتى في 4 درجات مئوية.
  6. طبق سيترات متوسط ​​أجار متوسط
    1. للمكون 1 (آغار مع الأزرق بروموثيمول): تزن 7.5 غرام أجار و 0.02 غرام من البروموثيمول الأزرق. الجمع بين المكونات في قارورة إرلنمير 1 لتر، وضبط حجم إلى 450 مل مع الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف الخليط.
    2. للمكون 2 (10x فمم): تزن 1.0 g مغسو 4 7H 2 O و 10.0 g حامض الستريك H O و 50.0 g اللامائي K 2 هبو 4 و 17.5 g نانه 4 هبو 4 4H 2 O. الجمع بين المكونات في قارورة إرلنماير 1 لتر، وضبط حجم إلى 500 مل مع الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف أو تصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. 10x فم يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة تصل إلى 6 أشهر.
    3. إضافة 50 مل من المكون 2 إلى المكون 1 وإعداد في الحجم القياسي 100 ملم × 15 ملم أطباق بتري معقمة عن طريق صب وسائل الإعلام أغار مختلطة في أطباق بتري. وسائل الإعلام مطلي يمكن تخزينها ملفوفة في البلاستيك لمدة تصل إلى 6 أشهر، غطاء الجانب حتى في 4 درجات مئوية.
  7. لوحات أغار الحليب
    1. للمكون 1 (الحليب): تزن 8.0 غرام حليب جاف غير حليب فوري في قارورة إرلنماير 1 لتر، وضبط حجم إلى 200 مل مع الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف.
    2. للمكون 2 (أجار مع ضخ الدماغ الدماغ): تزن 3.68 غرام ضخ القلب والقلب و 6.0 غرام أجار. الجمع بين يخدعستيتينتس في 500 مل إرلنمير قارورة، وضبط حجم إلى 200 مل مع الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف.
    3. الجمع بين اثنين من المكونات عن طريق صب المكون 2 في المكون 1، بعد التعقيم وتخلط جيدا. إعداد 150 ملم × 15 ملم أطباق بتري العقيمة. لوحات الحليب يمكن تخزينها لمدة تصل إلى أسبوع واحد ملفوفة في البلاستيك، الجانب الجانب أسفل في 4 درجات مئوية. إعداد 150 ملم × 15 ملم أطباق بتري معقمة عن طريق صب وسائل الإعلام أجار مختلطة في أطباق بتري.
  8. لوحات أجار الحركة
    1. للمكون 1 (لب أجار): تزن 5.0 غرام تريبتون، 2.5 غرام استخراج الخميرة، 2.5 غرام كلوريد الصوديوم، و 2.0 غرام أجار. الجمع بين المكونات في قارورة إرلنمير 1 لتر، وضبط حجم إلى 500 مل مع الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف.
    2. للمكون 2 (1٪ (ث / ت) كلوريد تريفنيلتيترازوليوم؛ تك): تزن 0.25 ز تك. ضبط حجم إلى 25 مل مع الماء منزوع الأيونات في حويصلة معقمة وتصفية تعقيم باستخدام مرشح 0.22 ميكرون. تخزين لمدة تصل إلى 6 أشهر في درجة حرارة الغرفة ملفوفةفي احباط لتقليل التعرض للضوء.
    3. إضافة 2.5 مل من 1٪ (ث / ت) العقيمة تك إلى وسائل الإعلام تعقيمها.
    4. صب وسائل الإعلام سميكة قدر الإمكان (≥50 مل / لوحة) إلى كبير 150 مم × 15 ملم أطباق بتري العقيمة. وسائل الإعلام مطلي يمكن تخزينها ملفوفة في البلاستيك لمدة تصل إلى أسبوع واحد، غطاء الجانب حتى في 4 درجات مئوية. إعداد 150 ملم × 15 ملم أطباق بتري معقمة عن طريق صب وسائل الإعلام أجار مختلطة في أطباق بتري.
  9. فوجيس بروسكاوير
    1. للمكون 1 (مرق أحمر-فوج-بروسكور مرق؛ مر-ف): تزن 1.7 غرام مر-ف المتوسطة في قارورة إرلنماير 500 مل، وضبط حجم إلى 100 مل مع الماء منزوع الأيونات والأوتوكلاف. يمكن تخزين مرق مر-ف العقيمة في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    2. للمكون 2 (5٪ (ث / ت) ألفا (α) نفثول): تزن 1.0 غرام α-نفثول في حويصلة معقمة وضبط حجم إلى 20 مل مع الايثانول 95٪. α-نفثول يمكن تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 1 أسبوع ملفوفة في احباط للحد من ضوء إكسosure.
    3. للمكون 3 (40٪ (ث / ت) هيدروكسيد البوتاسيوم؛ كوه): تزن 20.0 غرام كوه في حويصلة معقمة، وضبط حجم إلى 50 مل مع الماء منزوع الأيونات معقم. يمكن تخزين كوه لمدة تصل إلى 6 أشهر في درجة حرارة الغرفة في وعاء من البلاستيك.

2. صيانة ونمو الخامس . سلالات الكوليرا

  1. إعداد واستخدام الثقافات الأسهم المجمدة
    1. بيليه 1.8 مل من الثقافة بين عشية وضحاها السائل لمدة 2 دقيقة بواسطة الطرد المركزي (≥8،600 x ج) في معقمة 2 مل أنبوب ميكروسنتريفوج، وإزالة طاف، وإعادة تعليق بيليه الخلية في 900 ميكرولتر من مرق لب الطازجة التي بيبتينغ.
    2. إضافة 900 ميكرولتر من العقيمة 60٪ (الخامس / الخامس) الجلسرين إلى الثقافة ومزيج من فورتيكسينغ.
    3. نقل الخليط إلى معقمة أنبوب 2 مل المبردة وتخزينها إلى أجل غير مسمى في -80 درجة مئوية.
    4. لاستخدام، وإزالة كمية صغيرة من الأسهم المجمدة باستخدام عقيمة تطعيم حلقة وخطوط لمستعمرات واحدة على لب أغأر. على الفور عودة الأسهم المجمدة إلى -80 درجة مئوية بعد الاستخدام لمنع الثقافات من الذوبان تماما. احتضان لوحات غطاء الجانب أسفل لمدة 12 إلى 16 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  2. نمو الثقافات بين عشية وضحاها في السائل المتوسطة
    1. متتالية للمستعمرات واحدة (وفقا للقسم 2.1.4) من الأسهم المجمدة على لوحات أجار لب. احتضان لوحات غطاء الجانب أسفل لمدة 12 إلى 16 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. تطعيم 4 مل من السائل مرق لب في معقمة 10 مل أنبوب الثقافة مع مستعمرة واحدة عن طريق لمس سطح مستعمرة واحدة مع عصا العقيمة قضيب ونقل المستعمرة في مرق السائل.
    3. احتضان مع التهوية في حاضنة شاكر في 225 دورة في الدقيقة لمدة 12 إلى 16 ساعة عند 37 درجة مئوية.
  3. منحنى النمو
    1. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها في مرق لب السائل كما ذكر سابقا في بروتوكول 2.2.
    2. جعل 1: 100 التخفيف من الثقافة بين عشية وضحاها عن طريق نقل 250 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 25 مل من مرق لب الطازجة في معقمة 250 مل قارورة إرلنمير.
    3. قياس كثافة بصرية من الثقافات السائلة في 600 نانومتر (أود 600 ) كل ساعة ابتداء من وقت التلقيح (T 0 ).
    4. احتضان 1: 100 التخفيف من الثقافة بين عشية وضحاها مع التهوية في حاضنة شاكر في 225 دورة في الدقيقة لمدة تصل إلى 30 ساعة عند 37 درجة مئوية، أو حتى تصل الثقافة الكثافة القصوى.
    5. رسم بياني أود 600 مقابل الوقت واستخدام الانحدار الخطي لتحديد الوقت التقريبي مضاعفة لكل سلالة.
  4. إل تور بيوتيب فيروولنس إندوسينغ كونديتيونس
    1. الإنتصارات لمستعمرات واحدة من الأسهم المجمدة على لوحات أجار لب. احتضان لوحات غطاء الجانب أسفل، لمدة 12 إلى 16 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. تطعيم 10 مل من أكي المتوسطة تحتوي على 0.03٪ (ث / ت) ناهكو 3 مع مستعمرة واحدة.
    3. احتضان الثقافة دون تهوية عند 37 درجة مئوية لمدة 3.5 ساعة.
    4. إزالة 7 مل من الثقافة واحتضان 3 مل المتبقية من كولتوإعادة مع التهوية في حاضنة شاكر في 225 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعات إضافية.
  5. الكلاسيكية بيوتيب الفوعة حالات تحريض
    1. الإنتصارات لمستعمرات واحدة من الأسهم المجمدة على لوحات أجار لب. احتضان لوحات غطاء الجانب أسفل لمدة 12 إلى 16 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    2. تطعيم 4 مل السائل مرق لب (الرقم الهيدروجيني 6.5) مع مستعمرة واحدة.
    3. احتضان مع التهوية في حاضنة شاكر في 225 دورة في الدقيقة لمدة 12 إلى 16 ساعة في 30 درجة مئوية.
  6. غسل خلية بيليه في برنامج تلفزيوني 1X
    1. بيليه 1.8 مل من الثقافة بين عشية وضحاها لمدة 2 دقيقة بواسطة الطرد المركزي (≥8،600 x ج) في معقمة 2 مل أنبوب ميكروسنتريفوج وإزالة طاف باستخدام ماصة. إعادة تعليق بيليه الخلية في 1.8 مل 1X بس بواسطة بيبتينغ.
    2. كرر غسل الإجراء ثلاث مرات تليها إعادة تعليق النهائي في 1.8 مل 1X بس.

3. توصيف V. الكوليرا

  1. Pالشاشات الوراثية المستندة إلى كر باستخدام كتكس و تكبا
    1. تصميم مجموعة من الاشعال، والتي تصلب ما يقرب من 50-70 نقطة أساس المنبع والمصب من بداية متعدية ومواقع وقف كتكسب و تكبا ، على التوالي.
    2. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها في مرق لب السائل كما ذكر سابقا في بروتوكول 2.2.
    3. عزل الحمض النووي الكروموسومات باستخدام مجموعة متاحة تجاريا مصممة للبكتيريا سالبة الجرام. يمكن تخزين الحمض النووي الكروموسومات المنقى إلى أجل غير مسمى في -20 درجة مئوية. العزلة الكروموسومية الحمض النووي باستخدام مجموعات متاحة تجاريا يستغرق عادة حوالي 4 ساعات.
    4. استخدام مقياس الطيف الصغير الحجم لضمان عينة الحمض النووي الكروموسومات هي ذات جودة عالية (A 260/280 > 1.8).
    5. لكل عزل الكروموسومات الحمض النووي، وإعداد تفاعل البوليميراز (ق) (ير) على الجليد في العقيمة 200 ميكرولتر ير أنبوب (ق) وتضخيم المناطق كتكسب و تكبا باستخدام مكونات ير القياسية: بوليميراز طق وبو(أو ما يعادلها)، حل دنتب، و الاشعال إلى الأمام / عكس. استخدام معايير ير القياسية (~ 3 ح). على سبيل المثال، استخدم البروتوكول التالي:
      1. انكماش الأولي في 95 درجة مئوية لمدة 120 ثانية.
      2. ينكر عند 95 درجة مئوية لمدة 60 ثانية.
      3. أنيل الاشعال في 60 درجة مئوية لمدة 45 ثانية.
      4. تمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 90 ثانية.
      5. كرر الخطوات من 3.1.5.2 خلال 3.1.5.4 لمدة 34 دورات.
      6. التمديد النهائي 72 درجة مئوية لمدة 600 ثانية.
      7. عقد لانهائية في 4 درجات مئوية.
    6. صبغ 5 ميكرولتر من كل المنتج ير (ق) باستخدام معيار 6X الحمض النووي هلام تحميل الصبغة، وتحميل ما يقرب من 10 ميكرولتر من سلم 1 كيلو بايت و 10 ميكرولتر من المنتج ير على هلام الاغاروز 1٪ في 1X تريس-بورات-إدتا (تب) متعادل.
    7. تشغيل الكهربائي هلام في 130 V حتى يصل صبغ الجبهة نهاية، ولكن ليس خارج، من هلام (حوالي 90 دقيقة). ويوصى الرصد المستمر كما الجهد وتشغيل مرات يمكن أن تختلف اعتمادا على المعدات.
    8. عند التحقق منناجحة ير التضخيم في الحجم المتوقع، وتنقية المتبقية 45 ميكرولتر ير المنتج (ق) باستخدام دنا المتاحة تجاريا نظيفة ومكثف عدة.
    9. تسلسل ير المنتج (ق) تنظيف باستخدام الاشعال المستخدمة في التضخيم ير، وإعداد لكل المبادئ التوجيهية المحلية تسلسل المرفق.
    10. قارن تنسيق فاستا من تسلسل الجينات من كل عزلة إلى تسلسل المنشورة المتاحة على الموقع نسبي (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)، من خلال البحث في أرقام الانضمام التالية في مربع الاستعلام البحث.
    11. كتكس : المنطقة (الكلاسيكية) بين VC0395_A1059 إلى VC0395_A1060 (إل تور) VC_1456
    12. تكبا : (كلاسيكال) VC0395_A0353 (إل تور) VC_0828
  2. المقايسات النمطية لتصنيف بيوتيب عن طريق الإكتشاف
    1. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها في مرق لب السائل كما ذكر سابقا في بروتوكول 2.2.
    2. غسل بيليه الخلية (ق) على النحو المحدد في بروتوكول 2.6.
    3. استخدام ماصة لبقعة 1 ميكرولتر من ثقافة غسلها على المتوسطة منها. بالنسبة للمواصفات المتوسطة والحضانة، يرجى الرجوع إلى الجدول 2.
  3. فحص الحركة
    1. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها (ق) في مرق لب السائل كما ذكر سابقا في بروتوكول 2.2.
    2. غسل بيليه الخلية (ق) على النحو المحدد في بروتوكول 2.6.
    3. تطعيم لوحات أجار الحركة عن طريق إدخال طعم تطعيم في ثقافة السائل غسلها و "طعن" عموديا في وسائل الإعلام. بين كل التلقيح، تعقيم طعنة الأسلاك باستخدام الموقد بنسن، وعندما طعن أجار، وضمان طعن تطعيم لا ينحني، وهذا يمكن أن يغير النتائج.
    4. احتضان لوحات غطاء الجانب حتى لمدة 14 إلى 24 ساعة عند 37 درجة مئوية. بعد 14 ساعة، رصد لوحات الحركة بشكل وثيق لمنع فرط نمو الثقافات.
  4. فوجيس-بروسكور (ف) الفحص
    1. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها (ق) في مرق لب السائل كما ذكر سابقا في بروتوكول 2.2.
    2. تطعيم 4مل من ميثيل الأحمر فوجيس بروسكاور، أو مرق ف م، عن طريق بيبتينغ 10 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها أعدت سابقا إلى 4 مل مر-ف مرق في أنبوب الثقافة العقيمة واحتضان مع التهوية في حاضنة شاكر في 225 دورة في الدقيقة لمدة 12 إلى 16 ساعة عند 37 درجة مئوية.
    3. إضافة 150 ميكرولتر من 5٪ (ث / ت) α-نفثول و 50 ميكرولتر 40٪ (ث / ت) كوه إلى 1 مل قسامات من مر-ف الثقافة بين عشية وضحاها في أنابيب الثقافة العقيمة، على التوالي.
    4. دوامة لفترة وجيزة والسماح الوقوف في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى 4 ساعات حتى يتغير لون يتطور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للصيانة المناسبة واستخدام أي سلالة بكتيرية، فمن المستحسن أن نعرف الوقت مضاعفة من سلالة (ق) من الفائدة. هنا، ومعدلات النمو المتفاوتة من شائعة الاستخدام V. وظهرت سلالات الكوليرا من خلال منحنى النمو، وتحسبت مرات مضاعفة تقريبية باستخدام الانحدار الخطي. أظهرت وت إل تور N16961 و إل تور البديل MQ1795 أقصر مضاعفة مرات (~ 1 ساعة و ~ 1 ساعة، على التوالي) من وت الكلاسيكية O395 (~ 2 ساعة) ( الشكل 1 ؛ الجد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أكثر من 200 حددت V. مجموعات كوليراي، O1 فقط و O139 لديها إمكانات وبائية. يمكن تقسيم المجموعة المصلية O1 إلى نوعين بيوتيبس: الكلاسيكي و إل تور. ومع ذلك، ظهرت سلالات هجين، وصفت المتغيرات إل تور 13 ، 17 ، التي تمتلك الخلفية النور إل تور، وخصائص الكلاسيكية الميناء 8 ، 9 ، 10 ، 11 ،

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البحوث التي تدعمها نيو هامبشاير-إنبري من خلال جائزة التنمية المؤسسية (إيديا)، P20GM103506، من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1 كيلو بايت سلم الحمض النووينيو إنجلاند بيولابسN3232Shttps://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder
60٪ جلسرينكالبيوكيم356352 http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352
أجاربيكتو وديكنسون وشركاه.214030 http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch
أجار مع ضخ الدماغ والقلببيكتو وديكنسون وشركاه.237500http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch
أغاروزبيكلاب732-2789https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale = +
اللامائي K2< / sub>HPO4< / sub> FisherScientificP288-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID
لوحات أجار الدمRemelR01200يخزن في درجة حرارة 4 درجات. ج;  http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar
حمض البوريكفيشر ScientificA73-500https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID
بروموثيمول بلوفيشر ScientificB388-10https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID
حمض الكبد & middot; H2< / sub>OFisher ScientificS72836-3https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363
Deoxynucleotide (dNTP) SolutionEngland BiolabsN0446SStore at -20 & deg ؛ ج;  https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset
ثنائي الصوديوم EDTAفيشر ScientificS311-500https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID
الحمض النووي النظيف & المكثف والتجارة; -25 كيتزيمو ريسيرشD4007http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit
جل صبغة الحمض النووي الأخضرالبيوتيوم41005https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/
Genesys 10SUV-VIS مقياس الطيفالحراريالعلمي 840-208100https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100
الخميرة / البكتيريا جينية جينتراكياجين158567https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation
حمض الهيدروكلوريكفيشر العلميA144-212تاكل;   https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID
KClفيشر العلميP217-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID
KH< الفرعي>2PO4 FisherScientificP285-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID
KOHFisher ScientificP250-500https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID
شركة Le LoopDecon Labs Inc.MP190-25http://deconlabs.com/products/leloop/
Le StabDecon Labs Inc.MP186-5http://deconlabs.com/products/lestab/
MgSO4& middot; 7H2< / sub>OFisher ScientificM63-500https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID
نظام الرحلان الكهربائي الأفقي ذو الخلية الفرعية الصغيرة GTRad Labs1704406http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373
MR-VP مرقديفكو216300http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch
Na2HPO4Fisher ScientificS374-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID
كلوريد الصوديومفيشر العلميS271-10https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID
NaHCO3Fisher ScientificS233-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID
NaNH4HPO4· 4H2< / sub>OFisher ScientificS218-500https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID
NanoDrop Lite SpectrophtometerThermo ScientificND-LITE-PRhttps://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR
الحليب الجاف الخالي من الدسمنستله قرنفلN / AN /
A الببتونبيكتو وديكنسون وشركاهأطباق بتري http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch 211677
(100 مم × 15 مم)FB0875712فيشر Scientificأطباق بتري https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712
(150 مم × 15 مم)FB0875714فيشر العلميhttps://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID
ملح كبريتات بوليميكسين بسيجما ألدريتشP1004-10MUيخزن في درجة حرارة 2-4 درجة ؛ C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US
Taq< / em> DNA PolymeraseNew England BiolabsM0273SStore at -20 & deg; C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
Taq< / em> Reaction BufferEngland BiolabsM0273SStore at -20 & deg; ج;  https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer
الحرارية Cycler Bio-Rad C1000 Touch & Trade ؛  مختبرات بيو راد1840148http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME
كلوريد TriphenyltetrazoliumAlfa AesarA10870https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/
Tris BaseFisher ScientificBP152-1https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID
TryptoneBecto و Dickinson و شركة211705http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch
مستخلص الخميرةبيكتو وديكنسون وشركاه.212750http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch
&-naptholMP Biomedicals204189http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189
Kit New الضوئي Bio New

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Shimada, T., et al. Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae. Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).
  2. Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups. Jpn. J. Infect. Dis. 71 (10), 1037-1045 (1997).
  3. Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae. J. Bacteriol. 177 (11), 3191-3198 (1995).
  4. Albert, M. J., et al. Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal. Lancet. 342 (8868), 387(1993).
  5. Barua, D. History of Cholera. Cholera. Barua, D., Greenough III, W. B. , Plenum Publishing Corporation. 1-36 (1992).
  6. Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A. Population Genetics of Vibrio cholerae. Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. Faruque, S. M., Nair, G. B. , Caister Academic Press. 29-47 (2008).
  7. Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77 (6), 853-856 (1983).
  8. Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes. J. Clin. Microbiol. 49 (11), 3739-3749 (2011).
  9. Ghosh-Banerjee, J., et al. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 48 (11), 4283-4286 (2010).
  10. Ansaruzzaman, M., et al. The Mozambique cholera vaccine demonstration project coordination group. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg. Infect. Dis. 10 (11), 2057-2059 (2004).
  11. Ansaruzzaman, M., et al. Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique. Int. J. Med. Microbiol. 297 (6), 443-449 (2007).
  12. Lan, R., Reeves, P. R. Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism. J. Clin. Microbiol. 40 (1), 172-181 (2002).
  13. Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 40 (9), 3296-3299 (2002).
  14. Nair, G. B., et al. Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1559-1562 (2006).
  15. Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y. Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1. Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. Faruque, S. M., Nair, G. B. , Horizon Scientific Press. 179-190 (2008).
  16. Safa, A., et al. Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes. J. Med. Microbiol. 55 (11), 1563-1569 (2006).
  17. Nusrin, S., et al. Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic. J. Clin. Microbiol. 42 (12), 5854-5856 (2004).
  18. Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate. mSphere. 1 (5), e00253(2016).
  19. Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor. Microbiol. Immunol. 30 (11), 1075-1083 (1986).
  20. DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).
  21. Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae. Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).
  22. Vogel, H. J., Bonner, D. M. Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties. J. Biol. Chem. 218 (1), 97-106 (1956).
  23. Son, M. S., Taylor, R. K. Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor. Curr. Protoc. Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).
  24. Kovacikova, G., Skorupski, K. Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter. Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).
  25. Wang, Y., et al. The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains. Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).
  26. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques. J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).
  27. Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae. Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PCR LB

مقالات ذات صلة