في هذا البروتوكول، معطلة على سطح نانوحبيبات محبوس البروتين كيناز ألف (PKA)، بيوفيكتور توصيل إشارات خلوية، وميكروينجيكتيد إلى سيتوسول وتفعيلها من خلال تحويل الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة من الإشعاع (الجرد) القريبة من الأشعة تحت الحمراء، الذي يحفز الإجهاد المصب تفكك الألياف في سيتوسول.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
نظام متكامل لتشغيل عن بعد توصيل الإشارة داخل الخلايا بوساطة نانوحبيبات Upconversion كيناز فوتواكتيفيشن
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
نانوحبيبات Upconversion (أوكنب)-فوتواكتيفيشن الوساطة نهج جديد في بيوفيكتورس التحكم عن بعد مع الضيائية أقل بكثير وأعمق اختراق الأنسجة. ومع ذلك، الأجهزة الموجودة في السوق غير سهولة متوافق مع تطبيق upconversion. ولذلك، تعديل الصك متاحة تجارياً ضروري لهذا البحث. في هذه الورقة، ونحن أولاً توضيح التعديلات فلوريميتير التقليدية ومجهر الأسفار لجعلها متوافقة لتجارب upconversion فوتون. ثم يصف لنا توليف القرب من الأشعة تحت الحمراء (الجرد)-أثارت محبوس البروتين كيناز ألف الحفاز فرعية (PKA) معطلة في مجمع أوكنب. وأفيد أيضا معلمات microinjection وإجراءات الجرد فوتواكتيفيشن. بعد أن يتم ميكروينجيكتيد PKA-أوكنب محبوس في خلايا تنتجها الخلايا الليفية REF52، مشغلات تشعيع الجرد، وتفوق إلى حد كبير لإشعاع الأشعة فوق البنفسجية التقليدية، كفاءة PKA المسار توصيل الإشارات في الخلايا الحية. وبالإضافة إلى ذلك، تؤكد تجارب التحكم الإيجابي والسلبي أن الطريق التي يسببها PKA مما يؤدي إلى تفكك ألياف الإجهاد على وجه التحديد يتم تشغيلها بواسطة تشعيع الجرد. وهكذا، يوفر استخدام أوكنب البروتين تعديل نهج مبتكر التحكم عن بعد بالتضمين في ضوء التجارب الخلوية، التي يجب تجنب التعرض المباشر للأشعة فوق البنفسجية.
المقدمة
وقد وضعت البروتينات المعدلة كيميائيا يمكن أن فوتواكتيفاتيد (مثلاً، PKA محبوس البروتينات) كحقل ناشئة في مجال البيولوجيا الكيميائية لمعالجة العمليات الكيميائية الحيوية بين الخلايا1،2 غير إينفاسيفيلي ،3. استخدام الضوء كما يوفر حافزا القرار الزمانية المكانية ممتازة عند تنشيط هذه محبوس البروتينات. ومع ذلك، يمكن أن يسبب ضوء الأشعة فوق البنفسجية التغييرات الشكلية غير مرغوب فيها، والمبرمج، وتلف الحمض النووي للخلايا4،5. ومن ثم، التطورات الأخيرة في التصميم مجموعات فوتوكاجينج تركز على تمكين فوتوكليفاجي عند الإثارة أطول....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يصف البروتوكول تعديل أجهزة مفصلة لساعد upconversion فوتواكتيفيشن، وإجراء اصطناعية لتوليد محبوس PKA-أوكنب، مجهر إلكتروني (TEM) من أوكنب والسليكا المغلفة وقفص عينات PKA-أوكنب والإعداد التحلل الضوئي الأشعة فوق البنفسجية والجرد، وإعداد الخلية، microinjection PKA-أوكنب، ودراسة فوتواكتيفيشن وتلطيخ الألياف الإجهاد من الخلايا REF52-
1-الإعداد فلوريميتير لقياس الطيف Upconversion
- تثبيت عدسة هدف X 4 بجوار حامل ومبومو مطياف الأسفار حيث أن الليزر وتركز على منتصف ومبومو. ضع
- 0.5-8 ث الانضباطي 980 نانومتر ليزر الصمام ثنائي 90° ضد العدسة الهدف.
تنبيه: المشغل يحتاج إلى معرفة سلامة الليزر وارتداء نظارات الليزر نير.
<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويتضح تصميم بناء قفص الإنزيم-أوكنب في الشكل 1. أولاً كان رد فعل الإنزيم PKA مع بروميد 2-نيتروبينزيل لتوليد PKA محبوس غير نشط، ومن ثم المعطل تداولها الكهربية الاستاتية على سطح أوكنب. تنبعث منها في ضوء تحويل أوكنبس ونتيجة لذلك فوتوليتيكالي تنشق الجماعات س-نيتروبينزيل على Cys 199 و 343 Cys، توليد PKA المنشط. صور تيم والمقايسة برادفورد أكدت أن PKA و PKA قفص كانت معطلة على السطح أوكنبس، ونشاط كيناز محبوس PKA-أوكنب حل بعد أن كان فوتواكتيفيشن الأشعة فوق البنفسجية جز.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
سابقا، هوفمان وزملاء العمل وجدت أن التغييرات الشكلية المثيرة وقد لوحظت في الخلايا REF52 بعد microinjection PKA الحرة19. وفي دراسة أخرى، أن المجموعة لورانس أثبتت أن PKA محبوس يمكن تفعيلها في فيفو، مما يؤدي إلى التغييرات الشكلية وتفكك ألياف الإجهاد عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية التحلل الضوئي20. وفي وقت سابق تقارير عن استغلال تحويل الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة فوتواكتيفيشن أظهرت تفعيل22،21،بيوفيكت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.
شكر وتقدير
ونحن نشكر العلم نانو وبرنامج التكنولوجيا من سينيكا ووزارة العلوم والتكنولوجيا في تايوان للتمويل (101-2113-M-001-001-MY2؛ 103-2113-M-001-028-MY2).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| <قوي >كاشف < / قوي > | |||
| تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان | سيجما | 154563 | |
| كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدرات | سيجما | M9272 | |
| MOPS | سيجما | M1254 | |
| هيبس | سيجما | H4034 | |
| كلوريد الصوديوم ؛ | سيجما | 31434 | |
| كلوريد البوتاسيوم | سيجما | 12636 | |
| أسيتات الإيتريوم هيدرات | سيجما | 326046 | Y (C2< / sub>H 3< / sub>CO2< / sub>) 3< / sub> & middot ؛ xH 2< / sub>O |
| Tholium (III) أسيتات | هيدرات Alfa Aesar | 14582 | Tm (CH3< / sub>CO2< / sub>) 3 & middot; xH2O |
| إيتربيوم (III) أسيتات رباعي هيدرات | سيجما | 326011 | Yb (C2H3O2)3 & middot; 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| حمض الأوليك | Sigma | 364525 | |
| الميثانول | ماكرون | 304168 | |
| هيدروكسيد الصوديوم | سيجما | 30620 | |
| فلوريد الأمونيوم | JTBaker | 69804 | |
| IGIGAL CO-520 | سيجما | 238643 | |
| سيكلوهكسان | جي تي بيكر | 920601 | |
| هيدروكسيد الأمونيوم (28٪ - 30٪) | جي تي بيكر | 972101 | الأمونيا |
| رباعي إيثيل أورثوسيليكات (TEOS) | سيجما | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | سيجما | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA كاشف مانع النشاط |
| محلول استقرار البروتين Prionex من كولاجين الخنزير | Sigma | 81662 | محلول مثبت البروتين |
| 2-بروميد النيتروبنزيل (NBB) | سيجما | 107794 | PKA كاشف قفص |
| 8- (4-كلوروفينيلثيو) أدينوزين 3 & رئيس ؛ 5 & - ملح الصوديوم أحادي الفوسفات الدوري | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| بيروفات كيناز / نازعة هيدروجين اللاكتيك إنزيمات من عضلة الأرانب | Sigma | P0294 | PK / LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate ثنائي الصوديوم | Sigma | A2387 | ATP |
| & beta ؛ -NADH مخفضة من ثنائي البوتاسيوم | سيجما | N4505 | |
| فوسفوينول بيروفات | سيجما | P7127 | PEP |
| كاشف فحص البروتين Coomassie ، 950 مل | كاشف فحص برادفورد Thermo Scientific | 23200 | |
| بروتين كيناز يعتمد على cAMP | Promega | V5161 | PKA التحكم في نشاط |
| pET15b-PKACAT البلازميد | Addgene | # 14921 | |
| pKaede-MC1 البلازميد | CoralHue | AM-V0012 | |
| ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، خلية البيروفات | جيبكو | 12800-017 | وسط ثقافة |
| Leibovitz L-15 | الصناعات البيولوجية | 01-115-1A | زراعة الخلايا المتوسطة |
| مصل الأبقار الجنيني | الصناعات البيولوجية | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | صبغة تلطيخ النواة |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | صبغة تلطيخ F-actin |
| 5 (6) -Carboxytetramethylrhodamine ؛ | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (برادفورد) مجموعة فحص البروتين | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings / تصنيف المرشح الاسمي MWCO 12,000 - 14,000 Da | Membrane Filtration Products، Inc. | 1430-33 | غشاء غسيل |
| وحدة تصفية حقنة Millex-HV ، 0.45 وميكرو ؛ م ، PVDF ، 13 مم ، جاما معقم | EMD Milipore | SLHVX13NL < | |
| قوي > المعدات < / تشتت الضوء الديناميكي | |||
| Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| مجهر الإلكترون الناقل | JEOL | JEM-1400 | |
| مقياس الطيف الضوئي الفلوري | تقنيات Agilent | 10075200 | كاري اكليبس |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 & nbsp; |
| المجهر الفلوري | أوليمبوس | IX-71 | |
| 950 نانومتر مرشح longpass | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 نانومتر مرآة ثنائية اللون قصيرة | Chroma | NC265609 | |
| RT3 نظام CCD الملون | SPOT | RT2520 | |
| إضاءة مضان | التجويف السابق | 200 | |
| 980 نانومتر ليزر الأشعة تحت الحمراء | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED مصدر ضوء بقعة | UVATA | UVATA-UPS412 | مع UPH-056-365 نانومتر LED عند 200 ميجاواط / سم < سوب > 2 < / sup> |
| مستشعر كومة حراري | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | أنظمة الاستغناء عن الحقن الدقيق |
| داخل الخلايا PC-10 مجتذب إبرة | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER مقياس الضغط الرقمي | Lutron | PM-9100 | |
| واحد مناور دقيق هيدروليكي للزيت | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 جهاز طرد مركزي ، | 75002421 | علمي حراري |
المراجع
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged"....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
