مقالة منهجية

نظام متكامل لتشغيل عن بعد توصيل الإشارة داخل الخلايا بوساطة نانوحبيبات Upconversion كيناز فوتواكتيفيشن

DOI:

10.3791/55769

⸱

أغسطس 30, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Chemistry, Academia Sinica, 2Department of Chemistry, National Taiwan University, 3Department of Materials and Mineral Resources Engineering, National Taipei University of Technology

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذا البروتوكول، معطلة على سطح نانوحبيبات محبوس البروتين كيناز ألف (PKA)، بيوفيكتور توصيل إشارات خلوية، وميكروينجيكتيد إلى سيتوسول وتفعيلها من خلال تحويل الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة من الإشعاع (الجرد) القريبة من الأشعة تحت الحمراء، الذي يحفز الإجهاد المصب تفكك الألياف في سيتوسول.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نانوحبيبات Upconversion (أوكنب)-فوتواكتيفيشن الوساطة نهج جديد في بيوفيكتورس التحكم عن بعد مع الضيائية أقل بكثير وأعمق اختراق الأنسجة. ومع ذلك، الأجهزة الموجودة في السوق غير سهولة متوافق مع تطبيق upconversion. ولذلك، تعديل الصك متاحة تجارياً ضروري لهذا البحث. في هذه الورقة، ونحن أولاً توضيح التعديلات فلوريميتير التقليدية ومجهر الأسفار لجعلها متوافقة لتجارب upconversion فوتون. ثم يصف لنا توليف القرب من الأشعة تحت الحمراء (الجرد)-أثارت محبوس البروتين كيناز ألف الحفاز فرعية (PKA) معطلة في مجمع أوكنب. وأفيد أيضا معلمات microinjection وإجراءات الجرد فوتواكتيفيشن. بعد أن يتم ميكروينجيكتيد PKA-أوكنب محبوس في خلايا تنتجها الخلايا الليفية REF52، مشغلات تشعيع الجرد، وتفوق إلى حد كبير لإشعاع الأشعة فوق البنفسجية التقليدية، كفاءة PKA المسار توصيل الإشارات في الخلايا الحية. وبالإضافة إلى ذلك، تؤكد تجارب التحكم الإيجابي والسلبي أن الطريق التي يسببها PKA مما يؤدي إلى تفكك ألياف الإجهاد على وجه التحديد يتم تشغيلها بواسطة تشعيع الجرد. وهكذا، يوفر استخدام أوكنب البروتين تعديل نهج مبتكر التحكم عن بعد بالتضمين في ضوء التجارب الخلوية، التي يجب تجنب التعرض المباشر للأشعة فوق البنفسجية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد وضعت البروتينات المعدلة كيميائيا يمكن أن فوتواكتيفاتيد (مثلاً، PKA محبوس البروتينات) كحقل ناشئة في مجال البيولوجيا الكيميائية لمعالجة العمليات الكيميائية الحيوية بين الخلايا1،2 غير إينفاسيفيلي ،3. استخدام الضوء كما يوفر حافزا القرار الزمانية المكانية ممتازة عند تنشيط هذه محبوس البروتينات. ومع ذلك، يمكن أن يسبب ضوء الأشعة فوق البنفسجية التغييرات الشكلية غير مرغوب فيها، والمبرمج، وتلف الحمض النووي للخلايا4،5. ومن ثم، التطورات الأخيرة في التصميم مجموعات فوتوكاجينج تركز على تمكين فوتوكليفاجي عند الإثارة أطول الطول الموجي أو اثنين-فوتون لتقليل الضيائية، كذلك فيما يتعلق بزيادة التغلغل العميق الأنسجة6،7. تنشيط مجموعات حبس تستجيب للطول الموجي أطول مما يسمح لنا باختيار الأطوال الموجية أونكاجينج المناسبة (أي، قنوات) إلى بشكل انتقائي بيوفيكتورس عند اثنين أو أكثر الفئات كاجينج الحالي7. ونظرا لهذه الخصائص المفيدة، تطوير مجموعات جديدة من فوتوكاجينج الضوء الأحمر عمل المنبع هام جداً في منهجيات الضوئية للدراسات البيولوجية بدءاً من سبر آليات ردود الفعل على مراقبة الأنشطة الخلوية8. ومع ذلك، مجموعة كاجينج اثنين-فوتون عادة مسعور جداً بسبب هيكل حلقة عطرية تنصهر فيها، ومجموعة كاجينج الضوء المرئي عادة الفلزية العضوية، مع يغاندس العطرية. هذه الخاصية العطرية/عمود المصباح غير مناسبة عندما يكون بيوفيكتور البروتين أو الإنزيم، كما ديناتوريس الموقع تنشيط الإنزيم/البروتين ويسبب فقدان وظيفة، حتى لو كان التصريف والتحلل الضوئي لا تزال تعمل على مستوى المواد الكيميائية2 ،9.

أوكنبس هي محولات الطاقة الفعالة التي تحول على ضوء الإثارة الجرد بالأشعة فوق البنفسجية. وقد عرضت هذه الخاصية الفريدة والرائعة من أوكنبس قرارات واقعية للتصدي للتحديات المرتبطة فوتواكتيفيشن وتشغيل الإصدار التي تسيطر عليها من الجزيئات الصغيرة، بما في ذلك10من حمض الفوليك، سيسبلاتين مشتقات11 ،12الحمض النووي/siRNA و حويصلات كوبوليمر13والجسيمات أجوف14. ومع ذلك، على حد علمنا، فوتواكتيفيشن أوكنب--بمساعدة من الإنزيمات أو البروتينات لم يتم اختباره حتى الآن. لأنه لا توجد أي حالة ناجحة لاستخدام الضوء الأحمر أو قوائم الجرد الوطنية فوتواكتيفي إنزيم، نحن كانت تطالب بإجراء التنشيط آثار تقرير الجرد الوطني لبناء البروتين/إنزيم تتألف من مجمعات إنزيم محبوس معدلة كيميائيا مع السليكا المغلفة، لانثانيدات يخدر أوكنب15. في هذه الدراسة، أوكنب كان مترافق مع سرعة في رد فعل إشارة توصيل كيناز في شكل قفص PKA. يتحكم PKA توليف الجليكوجين والتنظيم سيتوسكيليتال يستجيب للمنبهات الخارجية عن طريق دوري أدينوسين الفوسفات (معسكر) التنظيم في سيتوسول16. علينا دراسة جدوى لتنشيط إنزيم في الخلق الزماني والمكاني في تجربة الهاتف خلوي بعد التشعيع الجرد. هذا المنبر فوتواكتيفيشن أوكنب-بمساعدة منهجية جديدة إلى فوتواكتيفاتي إنزيم استخدام قوائم الجرد الوطنية ويتجنب استجابة الخلايا الناجم عن إشعاع الأشعة فوق البنفسجية التقليدية2،4توصيل إشارة غير مرغوب فيها.

من الصعب جداً ترانسلوكاتي بيوفيكتورس كبيرة (مثلاً، البروتينات) عبر غشاء الخلية للتحكم في النشاط الخلوي. على الرغم من أن قد يكون من الأسهل ترانسلوكاتي عن طريق الالتقام في سيتوسول البروتين الجسيمات معطلة، قد تضررت الالتقام أو المتدهورة عن طريق فخ اندوسومال وما يترتب عليه من تدهور الليزوزومية2،4. مبالغ ذوبانها حتى لو البروتين محبوس الفنية لا تزال بعد الغشاء إزفاء، قد لا يكون كافياً لإحداث الاستجابة الخلوية2،17. في تناقض حاد، microinjection نهجاً مباشرا والكمية لتسليم بيوفيكتورس الكبيرة إلى السيتوبلازم للخلية. وعلاوة على ذلك، يتطلب المعطل تداولها أوكنب بيوفيكتور تحويل الضوء لتفعيلها. ولذلك، الأجهزة البصرية يتطلب المزيد من التعديل لقياس، تصور، والاستفادة من الضوء upconversion. وسيرد في هذا العمل، تسليم مجمع أوكنب PKA محبوس إلى خلية باستخدام microinjection والتعديلات الأساسية التالية التحليل الطيفي، والفحص المجهري نير فوتواكتيفيشن بالتفصيل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يصف البروتوكول تعديل أجهزة مفصلة لساعد upconversion فوتواكتيفيشن، وإجراء اصطناعية لتوليد محبوس PKA-أوكنب، مجهر إلكتروني (TEM) من أوكنب والسليكا المغلفة وقفص عينات PKA-أوكنب والإعداد التحلل الضوئي الأشعة فوق البنفسجية والجرد، وإعداد الخلية، microinjection PKA-أوكنب، ودراسة فوتواكتيفيشن وتلطيخ الألياف الإجهاد من الخلايا REF52-

1-الإعداد فلوريميتير لقياس الطيف Upconversion

  1. تثبيت عدسة هدف X 4 بجوار حامل ومبومو مطياف الأسفار حيث أن الليزر وتركز على منتصف ومبومو.
    2. ضع
  2. 0.5-8 ث الانضباطي 980 نانومتر ليزر الصمام ثنائي 90° ضد العدسة الهدف.
    تنبيه: المشغل يحتاج إلى معرفة سلامة الليزر وارتداء نظارات الليزر نير.
  3. تثبيت مرآة انعكاس كامل في تقاطع مسار الضوء من العدسة والهدف والليزر. ضع لوحة معدنية أسود المؤكسد إلى كتلة نافذة الإثارة للتحليل الطيفي وحماية الأجزاء الداخلية-
  4. مكان ومبومو المغلفة السليكا أوكنب الحل (0.2-0.6 مغ/مل) في حامل ومبومو حتى يمكن تصور شعاع upconversion مشرق ويمكن استخدامها لضبط محاذاة الخفيفة أفضل لتركيب مرآة.
  5. التبديل التحليل الطيفي إلى وضع التﻷلؤ مع أدنى إعداد الجهد PMT (ضبط لإعداد أعلى إذا كان الإشارة ضعيفة جداً). ضبط مرآة لمحاذاة أفضل، حيث الشعاع في وسط ومبومو وتلتقط PMT أقوى إشارة.
  6. قياس الطيف upconversion، بعد المحاذاة، مع إعداد الطاقة المطلوبة. استخدم مقياس طاقة حرارية كومة لبناء منحنى معايرة للطاقة الليزر ضد القراءة الكهربائية الحالية في إمدادات الطاقة الليزر. تحقق باستمرار أداء الليزر للتأكد من أن الأداء يقع ضمن نطاق معايرة.

2. إعداد المجهر

ملاحظة: يعمل الإعداد التالي لمجاهر مزودة بمسار بصري مستويين. إذا كان المستخدم تنوي تثبيت رمز تبديل مصدر ضوء إثارة في المنفذ مرة أخرى لجعل الليزر الجرد ومصباح هاليد تتقاسم نفس المنفذ، صيد تلسكوب في المنفذ الخلفي كثيرا كتلة تقرير الجرد الوطني أنها مصممة للحد من تدفئة العينة. يجب أن تجعل المستخدم خيار صعب: الحفاظ صيد تلسكوب ويعانون من كفاءة upconversion منخفضة جداً، أو إزالة صيد تلسكوب والتضحية بكثافة الإثارة الخفيفة ابيفلوريسسينسي-

ملاحظة: رسم تخطيطي كوتاواي عرض مخطط مسار الضوء على سبيكتروفلوروميتير معدلة، الفحص المجهري التﻷلؤ upconversion ووضع قوائم الجرد الوطنية التحلل الضوئي وابيفلوريسسينسي ووضع التحلل الضوئي الأشعة فوق البنفسجية، والإعداد التجريبية استخدمت في هذه التجربة موضحة في الشكل رقم 2-

دليل
  1. تجهيز مجهر الأسفار مع هاليد معدنية خفيفة، توجه إلى الخلف منفذ
    ملاحظة: في هذا المسار الخفيفة الطبقة العليا حيث يوجد برج مكعب، موضع مكعب واحد يجب أن تكون فارغة للسماح نير قادمة من المسار. خفيفة الطبقة السفلي
  2. تثبيت الانضباطي 0.5 إلى 8.0 W 980 نانومتر ليزر الصمام ثنائي في الميناء الجانب الأيمن، مع صيد تلسكوب الجانب المنفذ مفتوح.
    ملاحظة: وهذا يوسع ميكرومتر الموضعية إلى حوالي 500 ضوء الليزر في القطر عند استخدام عدسة هدف X 10. إزالة هذا صيد تلسكوب النتائج في بقعة ضوء مدى ميكرومتر ويجعل نير تشعيع الخلايا غير عملي. صيد تلسكوب هذا هو نير شفاف.
  3. تثبيت مرآة مزدوج اللون (850 نانومتر قصيرة-تمرير) وعامل تصفية إثارة (950 نانومتر طويلة-تمرير) في الطبقة السفلي الخفيفة المسار.
    4. استخدام
  4. حل أوكنب لتصور بقعة ضوء الجرد. ضبط موضع الليزر مركز شعاع ضوء الجرد في مجال الرؤية لإنهاء المحاذاة.

3. إعداد وتوصيف من قفص PKA-أوكنب بناء

  1. إينكوباتي PKA المؤتلف (9 ميكرومتر) مع 0.5 مم 2-نيتروبينزيلبروميدي (NBB) في حبس المخزن المؤقت (20 مم تريس-HCl، مجكل 100 كلوريد الصوديوم، و 10 ملم 2؛ الرقم الهيدروجيني 8.5) لح 1-2 في 25 ° الطفايات جيم NBB الزائدة مع 10 مم دثيوثريتول (DTT)، وبعد ذلك دياليزي ضد 4-(2-هيدروكسيثيل) حمض الببرازين-1-اثانيسولفونيك (حبيس) المخزن المؤقت (10 ملم، ودرجة الحموضة 7.5) لإزالة الزائدة الكواشف والأملاح.
    ملاحظة: الرقم الهيدروجيني لحل كاجينج هو خفض من 8.5 إلى 7.5 أثناء الغسيل الكلوي مع حبيس الرقم الهيدروجيني 7.5 لرد فعل التثبيت لاحقاً.
  2. ميكس لانثانيدات أملاح-Y(CH3CO2) 3 الهيدرات (99.9%، 0.4527 ز، ملمول 1.38)، Yb (CH 3 CO 2) 3 هيدرات (99.9%، 0.2533 ز، ملمول 0.60)، و Tm (CH 3 CO 2) 3 هيدرات (99.9%، 0.0168 ز، 0.02 ميللي مول)-أوكتاديسيني (30 مل) وحمض الأولييك (12 مل)، تسخين المخلوط إلى 115 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، وتبريد لهم إلى 50 درجة مئوية. بعد ذلك، حل الخليط رد الفعل في حل باثانول (20 مل) مع 0.2 ز (5.0 مليمول) بيليه هيدروكسيد الصوديوم و 0.2964 ز (8 ميللي مول) من فلوريد الأمونيوم التي سونيكيشن عن 15 دقيقة زيادة رد فعل درجة الحرارة إلى 300 درجة مئوية للحصول على نواة أوكنب (β-كفر 4 : 1.0% Tm 3 +/30% الماليزي 3 +) جسيمات نانوية.
    3. حل
  3. nanoparticles الأساسية (25 ملغم) مع شركة-520 (0.5 مل) في الحلقي (10 مل). إضافة الأمونيا (wt 30% v/v، مل 0.08) وتيترايثيلورثوسيليكاتي (تيوس، مل 0.04) وتطبيق التحريك المستمر ح 12 في درجة حرارة الغرفة للحصول على السليكا المغلفة β-كفر 4: 1.0%Tm 3 +/30%Yb 3 + الأساسية جسيمات نانوية.
  4. احتضانها في PKA (نمول 6) أو قفص PKA (نمول 6) مع أوكنب (1 ملغ) 15 في هيبيس المخزن المؤقت (10 ملم، ودرجة الحموضة 7.5) في 4 درجات مئوية عن ح 3 شل PKA على السليكا المغلفة أوكنب عن طريق التفاعل الالكتروستاتيكي.
  5. تصفية المخلوط باستخدام تصفية PVDF (0.45 ميكرومتر)، أجهزة الطرد المركزي في 17,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية، وريديسبيرسي بيليه في 0.1% هيبيس (50 ميليلتر، 10 مم، الرقم الهيدروجيني 7.5) تحتوي على بروتين استقرار الحصول على المجمع PKA-أوكنب المنقي. الطرد المركزي في 17,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 درجات مئوية وجمع المادة طافية مقايسة برادفورد في أنبوب 1.5 مل.
    6. تحليل
  6. PKA غير محدودة في المادة طافية المحفوظة من الخطوة 3.5 مع مقايسة برادفورد للخلف-حساب مستوى الإحلال PKA على الجسيمات أوكنب، الذي عادة ما يكون مستوى إحلال ~ نمول 4.5 من PKA كل مغ جسيمات.
    ملاحظة: مقايسة برادفورد يكشف لون أزرق قوي في الكريات، مما يوحي تجميد بروتين عالية المستوى ومستقرة دون الامتزاز، بينما الكسر طافية من قفص الحل PKA-أوكنب يظهر لون مماثل حبيس المخزن المؤقت ( الشكل 4 ج-4e).

4. وصف

ملاحظة: المقايسة كيناز ويستخدم لقياس نشاط بيروفات كيناز محددة. وباختصار، الفسفرة الببتيد، الذي يقترن إلى بيروفات كيناز ونازعه لاكتات، ينتج عن أكسدة NADH. ويرصد تشكيل هذا الأخير بقياس الانخفاض في امتصاص NADH في 340 نانومتر.

  1. تحديد نشاط PKA و PKA-أوكنب في حجم الخليط المقايسة التي تحتوي على حمض مورفولينيبروبانيسولفونيك 4 (الممسحات، 100 ملم، ودرجة الحموضة 7.5)، مجموع 60 ميليلتر بوكل (100 ملم)، فوسفونولبيروفاتي (بيب، 1 ملم)، أدينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP، 1 ملم)، β- نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide، خفضت النموذج (NADH، 0.8 ملم) وكلوريد المغنيسيوم (MgCl 2, 1 ملم)، كيمبتيدي (0.4 ملم) وخليط نازعة بيروفات كيناز/لاكتات (30/40 وحدة من PK/رابطة حقوق الإنسان)-
  2. قياس الانخفاض في امتصاص NADH مع مرور الوقت بعد إضافة الحل PKA (2 ميليلتر) إلى خليط المقايسة. حساب منحدر الخط مباشرة تعكس نشاط كيناز يجري قياسه.
  3. قياس نشاط PKA-أوكنب 15 والنشاط العام، والتي يجب أن تتطابق تماما مع الضرب المنتج الأصلي PKA محددة النشاط ومبلغ المغلفة بسطح PKA محسوب.

5. الإعداد التحلل

  1. الاتفاقات البيئية المتعددة الأطرافإليها باعتبارها قوة الضوء جميع المصادر باستخدام جهاز استشعار حراري كومة وحساب كثافة الطاقة (PD = الطاقة (W)/المنطقة (سم 2)) 18 استناداً إلى منطقة بقعة الضوء.
  2. القيام بتجارب في المختبر الأشعة فوق البنفسجية التحلل الضوئي على نظام تجاري مع 365 نانومتر الصمام (200 ميغاواط/سم 2) 15-
  3. فوتواكتيفيشن "للأشعة فوق البنفسجية" على المسرح المجهر، وإلقاء الضوء على الحل أوكنب PKA مع الإثارة الخفيفة تتم تصفيتها بواسطة مكعب تجاري 15.
    ملاحظة: هو كثافة الطاقة ~ 15 ميغاواط/سم 2، دون التركيز عدسة الهدف.
  4. في المختبر فوتواكتيفيشن نير على المسرح المجهر، إلقاء الضوء على الحل PKA-أوكنب باستخدام ليزر 980 نانومتر مع إعدادات عامل التصفية/مرآة upconversion مخصصة مثبتة على مسار الطبقة السفلي الخفيفة، مرآة مزدوج اللون (850 نانومتر قصيرة-تمرير)، و عامل تصفية إثارة (950 نانومتر طويلة-تمرير).
    ملاحظة: هو كثافة الطاقة الناتج 5 واط/سم 2 قبل 4 X عدسة الهدف التركيز. كثافة الطاقة يقدر بنحو ~ 68 ث/سم 2 بعد 4 × تركز عدسة الهدف.

6. خلية إعداد العينة و Microinjection مجمعات PKA-أوكنب

  1. قبل تصفية العينات من خلال عامل تصفية 0.45 ميكرومتر بعد التثبيت PKA (الخطوة 3، 5)-
  2. احتضان الخلايا في 10% مصل بقرى الجنين (FBS) تحتوي على L-15 المتوسطة خلال فترة microinjection لمراقبة درجة الحموضة مستقرة خارج الحاضنة.
    ملاحظة: للتأكد من إتمام microinjection، شارك حقن الأصلية PKA-أوكنب، أوكنب PKA محبوس، أو سي أوكنب (7.5 مغ/مل) 15 5 6-كاربوكسيتيتراميثيلرهوداميني (طمره) (10 ميكرومتر) في الخلايا.
  3. ضبط تركيز الجسيمات PKA-أوكنب أن، بعد microinjection، تركيز سيتوسوليك 1-3 ميكرومتر PKA-مجموعة تركيز فسيولوجية ل PKA في خلية، مع افتراض أن حجم الحقن هو 1/10 حجم الهاتف الخلوي .
  4. أداء microinjection في الخلايا (الخطوة 6.2) باستخدام جهاز ميكروينجيكتور مقرونا محور واحد ميكرومانيبولاتور هيدروليكية ( الشكل 3).
  5. استخدام مقياس الضغط رقمي لمراقبة الضغوط التي مورست قبل ميكروينجيكتور في نطاق التشغيل (~ 50-200 hPa) وختم صمام موزع في حجرة الضغط على مخصصة لتوفير التعويض الضغط ل microinjection. سحب الإبرة استخدام ساحبة.
  6. الحفاظ على ضغط الحقن بين 50 و 75 hPa، مع وقت حقن ms 200-300 والضغط التعويض في 15 hPa لمنع الدفق المتوسطة الثقافة في إبرة بعمل شعري.
  7. دراسة الفتحات نصيحة من الإبر ضمان أن تكون لديهم قطر خارجي بين 1.3 و 1.5 ميكرومتر، التي يمكن تأكيدها بأخذ الصور باستخدام عدسة هدف 40 x-
    8. أغسل
  8. الخلايا مع 2 مل من L-15 المتوسطة التي تحتوي على 10% FBS بعد microinjection. مراقبة تصوير fluorescence الخلوية من-كاربوكسيتيتراميثيل-والرودامين 5 (6) (طمره) للتأكد من إتمام microinjection.

7. فوتواكتيفيشن من قفص PKA-أوكنب باستخدام الأشعة فوق البنفسجية أو ضوء الجرد في "الخلايا الحية"

فوتواكتيفيشن
  1. "للأشعة فوق البنفسجية" بعد microinjection PKA-أوكنب، تنمو الخلايا REF52 على طبق 3.5 ميكرون ومكان لهم في مرحلة مجهر، ويتهددها لهم مع تصفية بواسطة الأشعة فوق البنفسجية المكعب لمدة 3 دقيقة دون التركيز عدسة الهدف.
    ملاحظة: REF52 وأبقى على الخلايا في دميم التي تحتوي على 10% FBS في 37 درجة مئوية في 5% CO 2 حاضنة، والخلايا وكانت سوبكولتوريد عندما كونفلوينسي وصلت إلى 90% كل 2-3 أيام-
  2. فوتواكتيفيشن "للجرد" بعد microinjection PKA-أوكنب، تضيء الخلايا على 980 نانومتر ليزر من إعدادات تصفية الطبقة السفلي/مرآة، كما هو موضح في الخطوة 5، 4-
    ملاحظة: إخراج كثافة الطاقة وهو 5 واط/سم 2 قبل 10 X عدسة الهدف التركيز يقدر بنحو 300 واط/سم 2 بعد 10 x عدسة الهدف التركيز. Upconversion هو عملية تتطلب كثافة عالية فوتون، لا سيما عند الحاجة إلى تحول أنتيستوكي أكبر. ومن ثم يلزم التركيز أثناء فوتواكتيفيشن.
    3. تشعيع
  3. عند الحاجة إلى بقعة ضوء أكبر (650 مكم x 520 ميكرومتر)، هذه الخلايا مع تقرير الجرد الوطني ركز بعدسة هدف العاشر 10 مع صيد تلسكوب ل 15 دقيقة السماح لفاصل الظلام 5 دقائق بعد كل تشعيع 5-دقيقة لتجنب التدفئة.
    ملاحظة: عند الحاجة مكانية-دقة عالية (بقعة الضوء سوبسيلولار)، استخدام عدسة الهدف X 40 مع ثقب المثبتة في نهاية المطاف الخروج من توجيه الضوء لتوليد بقعة ضوء سوبسيلولار البعد (5 ميكرون x 4 ميكرومتر). في هذه الحالة، 1 s تشعيع ما يكفي نير فوتواكتيفيشن بسبب ارتفاع تدفق الفوتونات.
  4. التحلل بعد الأشعة فوق البنفسجية أو الجرد، تسمح للخلايا لاسترداد في 5% CO 2 حاضنة في 37 درجة مئوية ح 1 في المتوسط كاملة لتوليد الاستجابات الخلوية. في وقت لاحق، إصلاحها في 1 مل من 4% بارافورمالدهيد/الفوسفات-مخزنة المالحة (PBS) لمدة 20 دقيقة قبل مواصلة تلطيخ.
    تنبيه: بارافورمالدهيد شديدة السمية؛ تجنب ملامسة الجلد أو العينين أو الأغشية المخاطية. تجنب التنفس المسحوق أثناء قياس وإعداد-

8. التصور "إجهاد الألياف التفكك الناجمة عن نير فوتواكتيفيشن"

  1. بعد التثبيت، استخدم أليكسا 594-فالويدين (إضافة 5 ميليلتر من 6.6 مكم الحل الأسهم إلى 200 ميليلتر من برنامج تلفزيوني لتلطيخ؛ واحتضان لمدة 25 دقيقة في درجة حرارة الغرفة) وصمة عار و تصور الألياف الإجهاد. تصور صور أليكسا 594-فالويدين (ت 581 نانومتر nm/م 609) باستخدام عامل تصفية مجموعة-
  2. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق في 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) في درجة حرارة الغرفة. بعد تلطيخ، غسل العينات مع برنامج تلفزيوني وتأخذ كل على حدة الصور الفلورية ألياف الإجهاد ونوى-

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتضح تصميم بناء قفص الإنزيم-أوكنب في الشكل 1. أولاً كان رد فعل الإنزيم PKA مع بروميد 2-نيتروبينزيل لتوليد PKA محبوس غير نشط، ومن ثم المعطل تداولها الكهربية الاستاتية على سطح أوكنب. تنبعث منها في ضوء تحويل أوكنبس ونتيجة لذلك فوتوليتيكالي تنشق الجماعات س-نيتروبينزيل على Cys 199 و 343 Cys، توليد PKA المنشط. صور تيم والمقايسة برادفورد أكدت أن PKA و PKA قفص كانت معطلة على السطح أوكنبس، ونشاط كيناز محبوس PKA-أوكنب حل بعد أن كان فوتواكتيفيشن الأشعة فوق البنفسجية جز...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

سابقا، هوفمان وزملاء العمل وجدت أن التغييرات الشكلية المثيرة وقد لوحظت في الخلايا REF52 بعد microinjection PKA الحرة19. وفي دراسة أخرى، أن المجموعة لورانس أثبتت أن PKA محبوس يمكن تفعيلها في فيفو، مما يؤدي إلى التغييرات الشكلية وتفكك ألياف الإجهاد عند التعرض للأشعة فوق البنفسجية التحلل الضوئي20. وفي وقت سابق تقارير عن استغلال تحويل الأشعة فوق البنفسجية الخفيفة فوتواكتيفيشن أظهرت تفعيل22،21،بيوفيكت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب المصالح المالية.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ونحن نشكر العلم نانو وبرنامج التكنولوجيا من سينيكا ووزارة العلوم والتكنولوجيا في تايوان للتمويل (101-2113-M-001-001-MY2؛ 103-2113-M-001-028-MY2).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي >كاشف < / قوي >
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثانسيجما154563
كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدراتسيجماM9272
MOPSسيجماM1254
هيبسسيجماH4034
كلوريد الصوديوم   ؛سيجما31434
كلوريد البوتاسيومسيجما12636
أسيتات الإيتريوم   هيدراتسيجما326046Y (C2< / sub>H 3< / sub>CO2< / sub>) 3< / sub> & middot ؛ xH 2< / sub>O
Tholium (III) أسيتاتهيدرات Alfa Aesar14582Tm (CH3< / sub>CO2< / sub>) 3 & middot; xH2O
إيتربيوم (III) أسيتات رباعي هيدراتسيجما326011Yb (C2H3O2)3 & middot; 4H2O
1-OctadeceneSigmaO806
حمض الأوليكSigma364525
الميثانول ماكرون304168
هيدروكسيد الصوديومسيجما30620
فلوريد الأمونيومJTBaker69804
IGIGAL   CO-520سيجما238643
سيكلوهكسانجي تي بيكر920601
هيدروكسيد الأمونيوم (28٪ - 30٪)جي تي بيكر972101الأمونيا
رباعي إيثيل أورثوسيليكات (TEOS)سيجما8658
DL-Dithiothreitol (DTT)سيجماD0632
N-hydroxymaleimide (NHM)Sigma226351PKA كاشف مانع النشاط
محلول استقرار البروتين Prionex من كولاجين الخنزيرSigma81662محلول مثبت البروتين
2-بروميد النيتروبنزيل (NBB)سيجما107794PKA كاشف قفص
8- (4-كلوروفينيلثيو) أدينوزين 3 & رئيس ؛ 5 & - ملح الصوديوم أحادي الفوسفات الدوريSigmaC39128-CPT-cAMP
بيروفات كيناز / نازعة هيدروجين اللاكتيك إنزيمات من عضلة الأرانبSigmaP0294PK / LDH
Adenosine 5'-triphosphate ثنائي الصوديومSigmaA2387ATP
& beta ؛ -NADH مخفضة من ثنائي البوتاسيومسيجماN4505
فوسفوينول بيروفاتسيجماP7127PEP
كاشف فحص البروتين Coomassie ، 950 ملكاشف فحص برادفورد Thermo Scientific23200
بروتين كيناز يعتمد على cAMPPromegaV5161PKA التحكم في نشاط
pET15b-PKACAT البلازميدAddgene# 14921
pKaede-MC1 البلازميدCoralHueAM-V0012
ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) ، درجة الحموضة 7.4Thermo Scientific10010023
DMEM ، نسبة عالية من الجلوكوز ، خلية البيروفاتجيبكو12800-017 وسط ثقافة
Leibovitz L-15الصناعات البيولوجية01-115-1Aزراعة الخلايا المتوسطة
مصل الأبقار الجنينيالصناعات البيولوجية04-001-1A
ParaformaldehydeACROS416785000
DAPIInvitrogenD1306صبغة تلطيخ النواة
Alexa 594-phalloidinInvitrogenA12381صبغة تلطيخ F-actin
5 (6) -Carboxytetramethylrhodamine   ؛Novabiochem8.51030.9999
Pierce Coomassie (برادفورد) مجموعة فحص البروتينThermo Scientific23200
CelluSep T4 Tubings / تصنيف المرشح الاسمي MWCO 12,000 - 14,000 DaMembrane Filtration Products، Inc.1430-33غشاء غسيل
وحدة تصفية حقنة Millex-HV ، 0.45 وميكرو ؛ م ، PVDF ، 13 مم ، جاما معقمEMD MiliporeSLHVX13NL <
قوي > المعدات < / تشتت الضوء الديناميكي
Zetapotential Zetasizer nano-ZSMalvernM104
مجهر الإلكترون الناقلJEOLJEM-1400
مقياس الطيف الضوئي الفلوريتقنيات Agilent10075200كاري اكليبس 
UV-Vis SpectrophotometerAgilent Technologies10068900Cary 50 & nbsp;
المجهر الفلوريأوليمبوسIX-71
950 نانومتر مرشح longpass ThorlabsFEL0950
850 نانومتر مرآة ثنائية اللون قصيرةChromaNC265609
RT3 نظام CCD الملونSPOTRT2520
إضاءة مضانالتجويف السابق200
980 نانومتر ليزر الأشعة تحت الحمراءCNIMDL-N-980-8W
UV LED مصدر ضوء بقعةUVATAUVATA-UPS412مع UPH-056-365 نانومتر LED عند 200 ميجاواط / سم < سوب > 2 < / sup>
مستشعر كومة حراريOPHIR12A-V1-ROHS
Picospritzer IIIParker Hannifin052-0500-900أنظمة الاستغناء عن الحقن الدقيق
داخل الخلايا PC-10 مجتذب إبرةNarishigePC-10
MANOMETER مقياس الضغط الرقميLutronPM-9100
واحد مناور دقيق هيدروليكي للزيتNarishigeMMO-220A
Heraeus Fresco 17 جهاز طرد مركزي ،75002421علمي حراري
محلول المتوسطة الكلى القوي > محور مبرد

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
  2. Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
  3. Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
  4. Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
  5. Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
  6. Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
  7. Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
  8. Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
  9. Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
  10. Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
  11. Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
  12. Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
  13. Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
  14. Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
  15. Gao, H. -D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
  16. Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
  17. Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
  18. Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
  19. Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
  20. Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
  21. Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
  22. Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
  23. Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة