Method Article

تحليل شامل للحمض النووي باستخدام طريقة ميثيل-كبغ الملزمة القائمة على الالتقاط في مرضى سرطان الدم الليمفاوي المزمن

DOI:

10.3791/55773

⸱

June 16th, 2017

 , 
1Department of Medical Genetics, Institute of Biomedicine, Gothenburg University, 2Department of Clinical Chemistry and Transfusion Medicine, Institute of Biomedicine, Gothenburg University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا العمل بروتوكول ميثيل-كبينغ ملزم (مبد) الأمثل، وخط أنابيب حسابية لتحديد مناطق ميثيلد الغنية بغاز كبغ في مرضى سرطان الدم الليمفاوي المزمن (كل).

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

دور رناس طويلة غير المشفرة (لكرناس) في السرطان يأتي إلى الصدارة بسبب الاهتمام المتزايد في فهم وظائفهم الميكانيكية خلال تطور السرطان والتقدم. وعلى الرغم من ذلك، لم يتم التحقيق جيدا في التنظيم الجيني العالمي من لكرناس والتسلسلات المتكررة في السرطان، ولا سيما في سرطان الدم الليمفاوي المزمن (كل). وتركز هذه الدراسة على نهج فريد من نوعه: القبض على المناعي القائم على المزدوج تقطعت بهم السبل، شظايا الحمض النووي ميثليته باستخدام الميثيل ملزم المجال (مبد) البروتينات، تليها تسلسل الجيل القادم (مبد-سيق). تم في هذه الدراسة استخدام عينات المريض التي تنتمي إلى المجموعتين الفرعيتين النذيرتين (5 عينات متحولة من إيغف + 5 عينات غير مقيسة من إيغف). وقد كشف التحليل عن وجود 5،800 فرط مثلي و 12،570 من الجينات المميثلة المفرومة (كلدمغس) ذات ال هايبومثيلات مقارنة بالضوابط الصحية الطبيعية. الأهم من ذلك، حددت هذه النتائج عدة كل محددة، ليكرناس ميثليته مختلفة، إعادةالعناصر الجينية، وجينات ترميز البروتين مع قيمة النذير المحتملة. ويحدد هذا العمل بروتوكولا مفصلا لخط أنابيب مب-أدق ومعلوماتية أحيائية تم تطويره لتحليل شامل لمحات الميثيل العالمية في المناطق الغنية ب كبغ باستخدام عينات المريض كل. وأخيرا، تم التحقق من الجينات ترميز البروتين و لكرنا باستخدام بايروسكنسينغ، وهو طريقة كمية للغاية لتحليل مستويات مثيلة كبغ لمزيد من إثبات النتائج من بروتوكول مبد-سيق.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان استخدام تقنيات الجيل القادم من التسلسل لتحليل الملامح العالمية مثيلة الحمض النووي شعبية متزايدة خلال السنوات الأخيرة. وقد تم تطوير مقايسات مثيلة على نطاق الجينوم، بما في ذلك أساليب ميكروأري وغير ميكروأري على أساس ما يلي: تحويل ثنائي الكبريتات من الحمض النووي الجيني، حساس انزيم انزيم حساس تقييد، ومناعي من الحمض النووي ميثليته باستخدام الميثيل كبغ محددة الأجسام المضادة .

مشتقات الحمض النووي الشاذة هي واحدة من السمات المميزة لسرطان الدم والأورام اللمفاوية، بما في ذلك سرطان الدم الليمفاوي المزمن (كل). في وقت سابق، العديد من المجموعات بما في ذلك لدينا وصف ملام....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الموافقة الأخلاقية لجمع عينات كل هي من 2007-05-21، مع رقم التسجيل التالي: إبن غبغ دنر 239/07. تم تشخيص جميع مرضى الكل وفقا للمعايير المعدلة مؤخرا 8 ، وتم جمع العينات في وقت التشخيص. تم تضمين المرضى في الدراسة من مختلف أقسام أمراض الدم في الجزء الغربي من السويد بعد الحصول على موافقة خطية. تم اختيار فقط كل الطرفية خلايا الدم وحيدات النوى (بمك) عينات مع نسبة الورم من خلايا اللوكيميا ≥70٪ في هذه الدراسة.

1 - الأعمال التحضيرية

  1. عزل بمكس لاستخراج الحمض ا....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم إجراء مبد-سيق مؤخرا على المرضى كل والضوابط مطابقة، طبيعية، صحية لتحديد كل محددة الجينات فرط و هيبوميثيلات محددة 7 . يتم عرض خط أنابيب التجريبية والبيوانفورماتيكية المستخدمة لتحليل البيانات الناتجة عن كل وعينات صحية طبيعية في الشكل 1A و 1 B. وحددت هذه التحاليل العديد من المناطق ذات الميثيل المخصب (كلدمرز)، والتي كانت مفرطة بشكل مفرط / هايبوميثيلد من عينات إيغف المتحولة و إيغف-.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مبد-سيق هو تقنية فعالة من حيث التكلفة، على أساس مناعي التي يمكن استخدامها لدراسة أنماط مثيلة مع تغطية كاملة على نطاق الجينوم. كل من ميديب سيق (ميثليته الحمض النووي مناعي تليها التسلسل) والنتيجة مبد-سيق في إثراء الحمض النووي ميثيلاتد كبغ الغنية. ومع ذلك، مب-سيق يظهر المزيد من التقارب نحو ملزم إلى المناطق الغنية كبغ بالمقارنة مع ميديب تساوي 19 . باستخدام مجموعة إثراء ملزم الميثيل، يمكن للمرء أن تجزئ الحمض النووي في المناطق عالية كبغ و منخفضة كبغ الغنية عن طري.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذه الدراسة من قبل مجلس البحوث السويدي، والجمعية السويدية للسرطان، ومؤسسة كنوت وآليس والنبرغ (كاو)، وفو فاستراغوتالاندسريجيونين.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
طقم Dneasy للدم والأنسجةQaigen69504
محلول LymphoprepA X I SS H I E L D
قطرة نانو 2000Thermo Fischersceintific
TE عازلة درجة الحموضة 8Sigma aldrich93283
جهاز صوتنة قياسي BioruptorDiagenodeUCD-200
TPX أنابيب bioruptor 1.5 ملدياجينودC30010010-300
3 م أسيتات الصوديومدياجينودC03030002
هلام إلكتروني iBase مجموعة كومبو تصوير آمنThermo FischersceintificG6465EU
E-gel 2٪ جل أغروزحراري FischersceintificG441002
Methylminer طقم تخصيب الحمض النووي الميثيلThermo FischersceintificME10025
Labquake أنبوب شاكر / دواراتThermo Fischersceintific415110
Dynal MPC-SThermo FischersceintificA13346
خلاط دوامةVWR12620-848
الإيثانول المطلقأي شركة
70٪ إيثانولأي شركة
خالية من الحمض النوويملي كيو
مرسب الحمض النووي (أسيتات الصوديوم 3M)DiagenodeC03030002
ختم آمن 1.5 مل أنابيب eppendorfEppendorf4036-3204
Qubit dsDNA HS Assay KitThermo FischersceintificQ32851
Qubit 0.5 مل أنابيبThermo FischersceintificQ32856
QubitThermo FischersceintificQ32866
منصة Illumina Hiseq2000Illumina
Water  منحة
كتلة الحرارةمنحة
أنبوب التدويرLabquake
1114544 حمام

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kanduri, M., et al. Differential genome-wide array-based methylation profiles in prognostic subsets of chronic lymphocytic leukemia. Blood. 115 (2), 296-305 (2010).
  2. Cahill, N., et al.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

DNA Methylation AnalysisMBD seq MethodChronic Lymphocytic LeukemiaMethylated DNA CaptureNext Generation SequencingPyrosequencing ValidationCLL specific Differentially Methylated GenesLong Noncoding RNAsRepetitive ElementsProtein coding Genes

Related Articles