البروتين كريسبر المرتبطة Cpf1 يمكن أن تسترشد رنا كريسبر المصممة خصيصا (الحمض النووي الريبي النووي) لتلتصق الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل في المواقع المطلوبة، وتوليد نهاية لزجة. واستنادا إلى هذه الخاصية، تم إنشاء معيار تجميع الحمض النووي (C- الطوب)، ويرد وصف بروتوكول بالتفصيل استخدامه هنا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
بروتوكولات ل C-بريك دنا الجمعية القياسية باستخدام Cpf1
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
كريسبر المرتبطة البروتين Cpf1 ينقسم المزدوج الحمض النووي تقطعت بهم السبل بتوجيه من الحمض النووي الريبي كريسبر (كرنا)، وتوليد نهاية لزجة. وبسبب هذه الخاصية، تم استخدام Cpf1 لإنشاء معيار التجمع الحمض النووي يسمى C- الطوب، والتي لديها ميزة من مواقع الاعتراف طويلة وندوب قصيرة. على ناقلات C- الطوب القياسية، وهناك أربعة مواقع التعرف Cpf1 - البادئة (T1 و T2 المواقع) واللاحقة (T3 و T4 مواقع) - يحيط أجزاء الحمض النووي البيولوجية. الانقسام من T2 و T3 مواقع تنتج نهايات لزجة تكميلية، والتي تسمح لتجميع أجزاء الحمض النووي مع T2 و T3 المواقع. وفي الوقت نفسه، يتم إنشاء ندبة قصيرة "غاتسك" بين أجزاء بعد التجمع. كما البلازميد التي شكلت مرة أخرى يحتوي على أربعة مواقع الانقسام Cpf1، وتسمح هذه الطريقة لتجميع تكرارية من أجزاء الحمض النووي، والتي تشبه تلك التي من معايير بيوبريك و بغلبريك. إجراء يحدد استخدام معيار C- الطوب لتجميع أجزاء الحمض النوويهو موضح هنا. يمكن استخدام معيار C-بريك على نطاق واسع من قبل العلماء والدراسات العليا وطلاب المرحلة الجامعية، وحتى الهواة.
المقدمة
وتوحيد الأجزاء البيولوجية دنا مهم لتطوير البيولوجيا التركيبية 1 . تطوير إجراء التجمع الحمض النووي يمكن أن تحل محل التصاميم التجريبية المخصصة وإزالة العديد من النتائج غير المتوقعة التي تنشأ خلال تجميع المكونات الوراثية في النظم الأكبر حجما. وكان معيار بيوبريك (بف رك 10) واحدة من أقرب معايير التجمع الحمض النووي المقترحة. ويستخدم تسلسل البادئة (التي تحتوي على إكوري و زباي قطع المواقع) وتسلسل لاحقة (التي تحتوي على سبي و بستي قطع المواقع) 2 ، 3 . لأن زباي و سبي لها نهاية متماسكة متماسكة، أجزاء بيوبريك الحمض النووي التي يتم قطع مع زباي و سبي ي....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. إعداد الحمض الريبي النووي النقال
- إعداد قوالب الحمض الريبي النووي النقال
- إعادة تعليق أوليغونوكلأوتيدس الفردية ( الجدول 1 ) في المياه خالية من ريبونوكلياز إلى تركيز 10 ميكرومتر.
- إضافة 22.5 ميكرولتر من أوليغونوكليوتيد أعلى حبلا (T7-F في الجدول 1 )، 22.5 ميكرولتر من قليل النوكليوتيد أسفل حبلا ( الجدول 1 )، و 5 ميكرولتر من العازلة الصلب ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وأظهر هذا البروتوكول تجميع ثلاثة أشرطة الكروموبروتين (كجبلو (BBa_K592011)، إفوريد (BBa_K592012)، و أميلغف (BBa_K592010)). أولا، تم استنساخ تسلسل التشفير للجينات والمطاريف الثلاثة المذكورة أعلاه بشكل فردي في متجه قياسي C-بريك. تم إدخال أجزاء الحمض النووي قصيرة، المروج والمخترق، في ناقلات C- الطوب من خلال التضخيم ير باستخدام الاشعال التي تحتوي على أجزاء الحمض النووي قصيرة على محطة 5 '. وأعقب ذلك طريقة الربط الذاتي. تم ترتيب ثلاثة تسلسل تروم.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول إجراء التجمع دنا القياسية C- الطوب. الخطوة الأكثر أهمية في هذا البروتوكول هو الخطي من ناقلات القياسية C- الطوب. والانقسام غير مكتملة من ناقلات يمكن أن تؤثر تأثيرا خطيرا على معدل النجاح. بالإضافة إلى ذلك، على الرغم من Cpf1 يستهدف أساسا تسلسل الحمض النووي تسلسل في "18-23" نمط الانقسام، كما تم الكشف عن انشقاق غير دقيق بالقرب من القواعد اثنين 4 ، والتي يمكن أن تسبب عددا صغيرا من الطفرات بعد التجمع الحمض النووي. لذلك، هناك حاجة إلى ت.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
نشكر شنغهاي تولو التكنولوجيا الحيوية لمساعدتهم التقنية خلال تطوير معيار C- الطوب. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من برنامج البحوث ذات الأولوية الاستراتيجية للأكاديمية الصينية للعلوم (منحة رقم XDB19040200).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Comercial Oligonucleotide | Sangon Biotech | ||
| 10x Taq PCR Buffer | Transgen | #J40928 | |
| Ultra Pure Water المقطر | Invitrogen | 10977-015 | |
| 5x RNA Transcription Buffer | Thermo Scientific | K0441 | |
| T7 RNA polymerase | Thermo Scientific | #EP0111 | |
| خليط NTP | سانجون | #ND0056 | |
| RRI (مثبط RNase المؤتلف) | Takara | 2313A | |
| RNA Clean & المكثف -5 | Zymo Research | R1015 | |
| UV-Vis مطياف | حراري علمي | نانو قطرة 2000c | |
| 2x فانتا ماكس عازلة | فازيم | PB505 | PCR عازلة |
| dNTPs | Transgen | AD101 | |
| Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase | Vazyme | P505-d1 | |
| Ezmax لاستنساخ Tolobio بخطوة | 24303-1 | مجموعة تجميع غير ملحومة | |
| 5x عازلة ل Ezmax استنساخ خطوة واحدة | Tolobio | 32006 | |
| BamHI | NEB | #R0136L | |
| BamHI-HF | NEB | #R3136L | |
| BglII | NEB | #R0144L | |
| XbaI | NEB | #R0145L | |
| SpeI | NEB | #R3133L | |
| 10x Buffer 3 | NEB | #B7003S | |
| 10x CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| 10x T4 DNA ligase Buffer | Tolobio | 32002 | |
| T4 PNK | Tolobio | 32206 | |
| T4 DNA ligase | Tolobio | 32210 | |
| DpnI | NEB | #R01762 | |
| SV Gel ونظام تنظيف PCR | Promega | A9282 | |
| Plasmid Mini Kit I | أوميغا | D6943-02 | طقم تحضير البلازميد |
| فوسفاتيز قلوي حساس للحرارة | حراري علمي | #EF0651 | FastAP |
| 10x Cpf1 عازلة | Tolobio | 32008 | |
| Cpf1 | Tolobio | 32105 | FnCpf1 |
| thermocycler | Applied Biosystems | veriti 96 well | |
| C-Brick Standard vector | Tolobio | 98101 | |
| E. coli [DH10B] | Invitrogen | 18297010 | |
| وسائط لوريا بيرتاني (التربتون) | أوكسويد | LP0042 | |
| وسائط لوريا بيرتاني (مستخلص الخميرة) | أوكسويد | LP0021 | |
| وسائط لوريا بيرتاني (كلوريد الصوديوم) | سانجون للتكنولوجيا | الحيوية B126BA0007 |
المراجع
- Canton, B., Labno, A., Endy, D. Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices. Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).
- Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts. J Biol Eng. 2, (2008).
- ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
