مقالة منهجية

كوانتينغينغ المتفرعة الكثافة في الجرذ الغدة الثديية كله يتصاعد باستخدام طريقة تحليل شول

14.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/55789

⸱

يوليو 12, 2017

 , 
1National Toxicology Program Laboratory, Division of the National Toxicology Program, National Institute of Environmental Health Sciences

في هذه المقالة

ملخص

وقد تم تقييم تنمية الغدد الثديية في القوارض عادة باستخدام التقييمات الوصفية أو من خلال قياس الخصائص الفيزيائية الأساسية. الكثافة المتفرعة هي مؤشر على تطور الثديية التي يصعب قياسها بشكل موضوعي. يصف هذا البروتوكول طريقة موثوق بها لتقييم الكمي من الخصائص المتفرعة الغدة الثديية.

الملخص

وهناك عدد متزايد من الدراسات التي تستخدم الغدة الثديية القوارض كنقطة نهاية لتقييم السمية التنموية للتعرض الكيميائية. يتم تقييم آثار هذه التعرضات على التنمية الغدة الثديية عادة باستخدام إما القياسات الأبعاد الأساسية أو عن طريق تسجيل الخصائص المورفولوجية. ومع ذلك، فإن مجموعة واسعة من الطرق لتفسير التغيرات التنموية يمكن أن يؤدي إلى ترجمة غير متناسقة عبر المختبرات. وهناك حاجة إلى طريقة مشتركة للتقييم بحيث يمكن تشكيل تفسيرات سليمة من البيانات التي تتم مقارنتها عبر الدراسات. وتصف هذه الدراسة تطبيق طريقة تحليل شول لتحديد خصائص الغدة الثديية المتفرعة. تم تطوير طريقة شول أصلا لاستخدامها في قياس أنماط العصبية شجيري. باستخدام إيماجيج، صورة مفتوحة المصدر تحليل البرمجيات حزمة، والمكونة وضعت لهذا التحليل، والغدة الثديية المتفرعة الكثافة وتعقيد آمتم تحديد الغدة الثديية من الفئران الإناث بيريبوبيرتال. سوف الطرق المذكورة هنا تمكين استخدام تحليل شول كأداة فعالة لقياس سمة هامة للتنمية الغدة الثديية.

المقدمة

الغدة الثديية المتفرعة هي السمة التي يتم تقييمها عادة كمؤشر على تنمية الغدة، ولكن من الصعب تحديد موضوعي. في عام 1953، وصف شول 1 طريقة لقياس أربوريزاتيون شجيري العصبية في القشور البصرية والحركية للقط، وقد تم تطوير البرنامج المساعد لهذه التقنية من قبل فيريرا وآخرون 2 . لأن كلا من الخلايا العصبية والغدد الثديية تظهر بنية تشبه شجرة مماثلة، تم استخدام البرنامج المساعد لتحديد كثافة الثديية المتفرعة الظهارية في الصور 2D من الغدة الثديية الجرذ بيريبوبيرتال. تم اختيار المرحلة المحيطة بالحيوية للتحليل لأن الفطام هو مرحلة حياة يتم تقييمها غالبا في المختبرات الأكاديمية ودراسات توجيه الاختبار. تحليل شول هو البرنامج المساعد توزيعها مع فيجي، وهو مفتوح المصدر حزمة معالجة الصور إيماجيج، مع الإضافات الإضافية المدرجة. البرنامج المساعد يخلق سلسلة من حلقات متحدة المركز تطويق بريديف(عادة سوما من الخلايا العصبية أو أصل القناة الرئيسية للغدة الثديية) وتمتد إلى الجزء البعيد البعيدة من الكائن (دائرة نصف قطرها مرفق). ثم تحسب عدد التقاطعات (N) التي تحدث على كل من الحلقات. ويعود البرنامج المساعد أيضا معامل الانحدار شول ( ك )، وهو قياس معدل تسوس من المتفرعة الظهارية.

باستخدام إيماجيج، يتم إنشاء صورة سكيليونيزد من الغدة الثديية كله جبل ويتم قياس المنطقة الظهارية الثديية (ميي). يتم تحليل الصورة باستخدام البرنامج المساعد تحليل شول، والقيم ل N و k ، من بين القيم الأخرى غير المستخدمة هنا، يتم إرجاعها. يتم تحديد الثديية الظهارة المتفرعة الظهارية من خلال حساب N / ميي. مدى استمرار المتفرعة في المناطق الخارجية من ظهارة غدية هو التعقيد المتفرعة وهو مؤشر على النمو الظهاري البعيدة موحدة. كما ك هو مقياس للانخفاض البعيدة في إبيثإليان المتفرعة، بل هو مقياس فعال للتعقيد المتفرعة ومؤشر موثوقة للتنمية الثديية.

يصف هذا البروتوكول طريقة بمساعدة الكمبيوتر لخلق صور الهيكل العظمي من الغدة الثديية يتصاعد كله وتقييم كميا الخصائص المتفرعة الثديية في الذكور بيريبوبيرتال والفئران الإناث. هذه الطريقة سريعة نسبيا ولا تتطلب استخدام معدات المجهر المتخصصة. يتم وصف التطوير والتحقق من هذه الطريقة في ستانكو وآخرون. (2015) 3 . ويصف هذا التقرير أيضا إعداد الفئران الثديية الغدة كله = يتصاعد. وقد وصفت إجراءات مماثلة جبل كامل الثدي في دي أسيس وآخرون. (2010) 4 و بلانتي وآخرون. (2011) 5 .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تمت الموافقة على جميع استخدامات الحيوان والإجراءات لهذه الدراسة من قبل نيهس مختبر رعاية الحيوان واستخدام اللجنة، وأجريت في جمعية لتقييم واعتماد مختبر مختبر رعاية الحيوان منشأة.

1. الغدد الثديية المكشوفة

  1. قبل تسمية جميع الشرائح باستخدام طريقة زيلين واقية (قلم رصاص يعمل بشكل أفضل). تغطية لهم مع تصاعد الحل في نهاية للحفاظ على التسمية.
  2. الموت ببطء الحيوان من قبل رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام أسلوب وافقت اللجنة.
  3. بعد القتل الرحيم، ووضع الحيوان على ظهرها على لوحة تشريح ( الشكل 1 ). تمدد وتثبيت جميع الأطراف الأربعة، مع الأطراف الخلفية تشكيل V مقلوب (عقد دبابيس أو إبر قياس صغير تعمل بشكل جيد).
  4. رش البطن بحرية مع الايثانول 70٪ للحفاظ على الشعر من العينة الثديية.
  5. باستخدام ملقط، سحب ما يصل الجلد في البطن في خط الوسط وجعل شق صغير معمقص تشريح، والحرص على عدم ثقب البريتوني.
    1. بدءا من شق، وقطع الجلد حتى منطقة الرقبة ومن ثم بشكل أقصى إلى الطرف الأمامي. قطع إلى المنطقة الإربية ثم بعد ذلك إلى أول مشترك من الطرف الخلفي على نفس الجانب. وهذا شق عادة يفصل الغدد الثديية 5 و 6. تجنب قطع الصفاق.
    2. سحب الجلد مع لوحة الدهون الثديية المرفقة باستخدام ملقط، فصل بلطف من الصفاق باستخدام نهاية حادة من مقص تشريح. فصل بقدر ظهريا ممكن للكشف تماما عن ال 4 و 5 الغدد الثديية الأربية عشر على الجانب السفلي من الجلد. دبوس الجلد إلى مجلس تشريح ( الشكل 2 ).
    3. فهم بلطف الأنسجة الثديية للغدة الموافق 5 مع الجانب مقربة من ملقط المنحنية وتقليم ببطء الغدة بعيدا عن الجلد، والحرص على عدم شق الغدة أو الجلد.
    4. الاستمرار في تقليم،الانتقال ظهريا حتى رفعت تماما الغدد ال 4 و 5 عشر من الجلد. تأكد من إزالة المنطقة الحلمة مع بقية الغدة، وهذا بمثابة نقطة انطلاق لتحليل شول. قطع الأنسجة الثديية بعيدا عن الجسم حيث يتم إرفاقه في الغدة 4.
  6. مرة واحدة يتم إزالة الغدة من الحيوان، ونشرها بالتساوي على مشحونة كهربائيا، 25 مم × 75 مم × 1 مم شريحة المجهر، مع الجانب الذي كان متاخما للجلد تواجه أسفل.
    ملاحظة: بالنسبة للغدد من الحيوانات القديمة أو المرضعة، قد تكون هناك حاجة شريحة 51 × 75 × 1 مم.
  7. أثناء ارتداء القفازات، والضغط بلطف من أي فقاعات الهواء. تغطية الغدة مع فيلم البارافين البلاستيك وشريحة المجهر آخر وضغط الغدة على الانضمام إلى الشريحة.
    ملاحظة: أنبوب مخروطي 50 مل مليئة بالماء بمثابة الوزن المناسب. مقدار الوقت اللازم للانضمام إلى الشريحة يعتمد على سمك الغدة. رقيقة، بوستناتال داي (بند) 4 يجب أن تكون مضغوطة الغدد لمدة لا تقل عن 30 دقيقة، في حين سمكا، والغدد الكبار قد تتطلب ما يصل إلى 2-5 ساعة.

2. إعداد الثديية كله يتصاعد

  1. إعداد حل الشبك القرم لا يقل عن 24 ساعة مقدما، لأنها تتطلب الغليان والتبريد.
    1. حل 1 غرام من الشبك القرم و 2.5 غرام من كبريتات البوتاسيوم الألومنيوم (ألك (سو 4 ) 2 · 12H 2 O) في 500 مل من الماء المقطر وتغلي لمدة 20 دقيقة في قارورة 1 لتر. جلب الحجم النهائي إلى 500 مل باستخدام الماء المقطر.
    2. تصفية الحل من خلال ورقة الترشيح تحت فراغ والتبريد للتخزين.
      ملاحظة: كارمين حل الشب يمكن إعادة استخدامها ولكن ينبغي التخلص منها عندما يبدأ لون تتلاشى.
  2. قبل التثبيت، قشر فيلم البارافين قبالة الغدة، والحرص على عدم سحب الغدة قبالة الشريحة. وضع الشريحة (ق) في الزجاج جرة تلطيخ الشريحة وتزج في تثبيتي (إيثان 100٪أول، الكلوروفورم، وحمض الخليك الجليدي في نسبة 6: 3: 1) لمدة 12-48 ساعة، اعتمادا على سمك الغدد.
  3. صب قبالة تثبيتي ونقع الغدد في الايثانول 70٪ لمدة 15 دقيقة. تدريجيا ترطيب الغدد عن طريق صب 1/3 من محلول الإيثانول واستبدالها بالماء المقطر. نقع لمدة 5 دقائق. كرر هذه العملية ثلاث مرات.
  4. بعد شطف النهائي، صب قبالة كل محلول الإيثانول / المياه واستبدالها مع 100٪ الماء المقطر. نقع الغدد لمدة 5 دقائق.
  5. صب الماء المقطر وتزج الغدد في محلول الشبك القرمزي. وصمة عار الغدد لمدة 12-24 ساعة، اعتمادا على سمك.
    ملاحظة: الغدد لا يمكن أن تكون ملطخة، ولكن الوقت تلطيخ لدفعات متعددة يجب أن يكون هو نفسه، حتى أن كثافة تلطيخ هو نفسه.
  6. صب قبالة محلول الشبك القرم وشطف الغدد في الماء المقطر 100٪ لمدة 30 ثانية. تدريجيا يذوى الغدد عن طريق تمرغها في الايثانول 70٪ لمدة 15 دقيقة، و 95٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة، وند الإيثانول 100٪ لمدة 20 دقيقة.
  7. مسح الغدد من الدهون عن طريق تمرغ في الزيلين لمدة 12-72 ساعة، اعتمادا على سمك.
    ملاحظة: يجب أن تكون الغدد شفافة (واضحة). إذا بقيت أي مناطق مبهمة (بيضاء)، استمر تمرغ في الزيلين حتى شفافة. إذا كانت ملطخة أو غيرها من الغدد سميكة جدا ويجري ملطخة وتنظيفها، قد تحتاج إلى استبدال زيلين مرة واحدة واضحة تماما الغدد.
  8. جبل الشرائح مع زيلين القائم على تصاعد المتوسطة التي بيبتينغ ما يكفي من المتوسطة لتغطية مجرد الغدة. إضافة ساترة، وضمان عدم وجود فقاعات الهواء شكل.
  9. السماح للشرائح لتجف. كما يجف المتوسطة تصاعد، وسوف تتعاقد تحت ساترة، وأنه قد يكون من الضروري إضافة إضافية متزايدة المتوسطة. مرة واحدة لا حاجة إلى وسيط إضافي، والسماح للشرائح لتجف تماما. وهذا قد يستغرق 2-3 أسابيع.
  10. مرة واحدة الشرائح هي جافة تماما، أي إزالة المتوسطة المتبقية يمكن إزالتها مع مسحة القطن وكمية صغيرة من الزيلين. يجب الحرص على عدم استخدامالكثير زيلين، وهذا يمكن حل وسط تصاعد وتخفيف ساترة. إذا حدث هذا وتجمع فقاعات الهواء تحت ساترة، وينبغي إزالة ساترة في زيلين وينبغي تكرار عملية التركيب.

3. إعداد كامل جبل صور للتحليل

  1. التقاط الصور من يتصاعد كله ( الشكل 3 ) باستخدام المجهر أو تشريح المجهر وكاميرا رقمية مع البرامج المناسبة.
    ملاحظة: في حين أن أي التكبير الذي يلتقط ظهارة غدية بأكملها يمكن اختيار، لا بد من التقاط جميع الصور كامل جبل التي سيتم مقارنتها مع بعضها البعض في نفس التكبير.
  2. تحميل برنامج إيماجيج (أو برنامج فيجي) 6 .
  3. فتح الثدي كامل صورة جبل في إيماجيج عن طريق النقر على "ملف" → "فتح". حدد أداة فريهاند وتتبع حول ظهارة غدية. حدد "تعديل" & #8594؛ "مسح خارج".
    1. إزالة العقد الليمفاوية عن طريق تتبع حول العقدة واستخدام أداة فريهاند و "تحرير" → "قص".
  4. قم بفصل قنوات الألوان عن طريق تحديد "إيماج" ← "كولور" ← "سبليت تشانلز". حدد القناة بأفضل تباين، وعادة ما تكون القناة الزرقاء.
    ملاحظة: تتكون صورة رغب من كومة من المكونات الحمراء والأخضر والأزرق لتلك الصورة. يعمل هذا الإجراء على فصل هذه المكونات إلى ثلاث صور بتدرج الرمادي 8 بت.
  5. اطرح الخلفية عن طريق تحديد "عملية" → "طرح الخلفية". اختر المعلمات المطلوبة ثم انقر فوق "معاينة" لمعاينة التغييرات.
    ملاحظة: "سوبتراكت باكغروند" يزيل الخلفيات السلسة والمستمرة. بالإضافة إلى ذلك، "عملية" → "مرشحات" → "أونشارب قناع" يمكن استخدامها لخلق التباين.
  6. اختيار واحد من ال e الطرق التالية لإزالة الضوضاء تلقائيا: قم بإزالة أو إزالة القيم المتطرفة.
    ملاحظة: إيماجيج يقدم طريقة ثالثة لإزالة الضوضاء التلقائي: إزالة نانز. ومع ذلك، لا يتم تطبيق الأمر إزالة نانز لأنه يستخدم الصور 32 بت، والطريقة الحالية يستخدم 8 بت الصور.
    1. قم بإزالة الضجيج باستخدام الأمر ديسبكل عن طريق اختيار "بروسيس" ← "نويز" ← "ديزبيكل".
      ملاحظة: هذا يعادل إضافة مرشح وسيط، الذي يحل محل كل بكسل مع القيمة المتوسطة في حي 3 × 3.
    2. قم بإزالة الضجيج باستخدام أمر إزالة القيم المتطرفة عن طريق اختيار "بروسيس" ← "نويز" ← "ريموف أوتليرس".
      ملاحظة: تستبدل هذه العملية البكسل بمتوسط ​​وحدات البكسل في المناطق المحيطة المباشرة إذا كانت تنحرف عن الوسيط بأكثر من قيمة معينة (العتبة).
  7. إزالة أي ضجيج متبقي يدويا (لاس = "زفيغ"> الشكل 4).
    1. فتح نسخة من الصورة الأصلية واستخدام هذا كدليل لما هو وما لا ضوضاء. انقر على زر السهم المزدوج الأحمر في أقصى يسار شريط الأدوات. حدد أدوات الرسم. ستظهر أزرار أداة الرسم الآن في شريط الأدوات.
    2. انقر فوق أداة ممحاة. اضبط قطر الممحاة بالنقر بزر الماوس األيمن فوق زر أداة ممحاة. اضغط على زر الماوس الأيسر لمحو الضوضاء.
      ملاحظة: يمكن التراجع عن جلسة واحدة فقط للمحو. مرة واحدة يتم تحرير زر الماوس الأيسر ونقر مرة أخرى، لا يمكن التراجع عن محو السابقة.
  8. ضبط عتبة عن طريق اختيار "صورة" → "ضبط" → "عتبة". حرك المتزلجون لضبط الحد الأدنى (المنزلق العلوي) والحد الأقصى (المنزلق السفلي) القيم العتبة حتى يتم تحقيق تصوير مناسب للغدة.
    ملاحظة: تعيين شرائح قيمة العتبة صور تدرج الرمادي إلى ميزات الفائدة والخلفية.
    1. انقر على تطبيق. إذا لزم الأمر، إزالة الضوضاء إضافية في هذه المرحلة باتباع الخطوات 3.6.1 و 3.6.2.
  9. إعادة بناء أجزاء من ظهارة غدية التي تمت إزالتها بواسطة العتبة وإزالة الضوضاء ( الشكل 5 ).
    1. إجراء إعادة بناء الصورة بعناية وعلى أساس الحد الأدنى للحفاظ على سلامة الصورة الأصلية. الرجوع إلى الصورة الأصلية للرجوع إلى ما هو وما هو ليس ظهارة.
    2. انقر فوق أداة سبراي كان (على شريط الأدوات باستخدام أدوات الرسم). ضبط قطر الرش ومعدل عن طريق النقر بزر الماوس الأيمن على زر أداة رذاذ يمكن. ملء بعناية في عداد المفقودين أقسام الغدة عن طريق النقر أو الضغط باستمرار على زر الماوس الأيسر.
  10. إنشاء صورة سكيليونيزد من الغدة لإجراء تحليل شول. تأكد من أن الصورة عتبة ثنائي عن طريق اختيار "عملية" → "ثنائي" → "جعل ب inary ".
    1. إذا كانت الصورة بيضاء على خلفية سوداء، حدد "عملية" → "ثنائي" → "خيارات" وإلغاء "خلفية سوداء". سكيليونيز الصورة عن طريق اختيار "عملية" → "ثنائي" → "سكيليتونيز".
      مالحظة: يزيل هذا بشكل متكرر البكسالت من حواف الصورة الثنائية حتى يتم تخفيضها إلى شكل على شكل بكسل واحد.
    2. تمدد الصورة مرة واحدة عن طريق اختيار "عملية" → "ثنائي" → "تمدد".
      ملاحظة: هذا يملأ الفجوات التي أنشأتها العتبة و سكيليتونيزينغ عن طريق إضافة بكسل إلى حواف الصورة الثنائية.
  11. احفظ الصورة بتحديد "ملف" ← "حفظ باسم". حدد نوع صورة (عادة جبيغ)، وأدخل اسم الملف، وانقر على "موافق".
  12. التحقق من دقة الصورة الهيكلية من خلال تراكب صورة سكيليتونيزد على الصورة الأصلية (أس = "زفيغ"> الشكل 6).
    1. إنشاء تراكب عن طريق فتح كل من الصورة الأصلية والصورة سكيليتونيزد. حدد "صورة" → "تراكب" → "إضافة صورة". في مربع الحوار "إضافة صورة"، حدد صورة الهيكل العظمي من القائمة المنسدلة "إضافة إلى" ثم عين التعتيم بنسبة 30٪.
    2. حفظ صورة صورة الهيكل العظمي مضافين على الأصل عن طريق تحديد "ملف" → "حفظ باسم". حدد نوع صورة، وأدخل اسم الملف، وانقر على "موافق".

4. إجراء تحليل شول

  1. فتح صورة هيكل عظمي وجعل الصورة الثنائية عن طريق اختيار "عملية" → "ثنائي" → "جعل ثنائي."
    1. قبل تعيين مقياس التكبير، وقياس عدد بكسل / مم باستخدام ميكرومتر للتكبير الذي تم التقاط الصور.
    2. تعيين التكبير المقاسة sمن خلال تحديد "تحليل" → "تعيين مقياس". أدخل عدد وحدات البكسل / مم. تعيين "المسافة المعروفة" و "نسبة بكسل الجانب"، على حد سواء ل 1. أدخل "مم" ل "وحدة الطول" وتحقق "العالمية" (يحافظ على نفس المقياس لكل صورة).
  2. تحديد نصف قطرها النهاية (ضم دائرة نصف قطرها) لتحليل شول عن طريق رسم خط من بداية القناة الأولية (مركز التحليل) إلى النقطة الأكثر البعيدة من ظهارة غدية ( الشكل 7 ).
    1. استخدم أداة رسم الخط في شريط الأدوات لرسم خط بين نقاط الاهتمام. اضغط على المفتاح "M" لإجراء قياس ولاحظ أنه سيتم فتح نافذة النتائج.
      ملاحظة: القيمة في عمود "الطول" هي طول السطر بالميليمتر. سيتم إدخال هذه القيمة تلقائيا كنقطة النهاية عند إعداد معلمات شول. سوف يستخدم البرنامج المساعد شول نقطة البدايةمن الخط كمركز حلقات مركزية.
  3. تشغيل تحليل شول.
    1. تشغيل التحليل عن طريق اختيار "الإضافات" "تحليل شول المتقدم؛" ستظهر نافذة معلمة.
    2. تعيين نصف قطرها البداية في "I. تعريف قذائف" إلى 0.00 ملم. سيتم إدخال طول الخط المقاس في الخطوة 4.2 تلقائيا ك "نصف قطر النهاية".
    3. تعيين "راديوس الخطوة الحجم" إلى 0.1 ملم.
      ملاحظة: يحدد حجم خطوة نصف قطرها عدد الحلقات (على نحو فعال عدد التكرارات)؛ فإن حجم الخطوة أصغر زيادة عدد من الحلقات، في حين أن حجم خطوة أكبر سوف يقلل من عدد من الحلقات. لا يمكن تعيين دائرة نصف قطرها صغيرة جدا، على الرغم من أن دائرة نصف قطرها صغيرة مفرطة سوف يؤدي إلى عدد كبير لا داعي له من الحلقات. ومع ذلك، فإنه يمكن تعيين كبيرة جدا، والتي سوف تخلق حلقات أقل وبالتالي نقلل من العدد الحقيقي للتقاطعات. راجع ستانكو إت آل.(2015) لمزيد من المعلومات حول تحديد حجم الخطوة.
    4. قم بتعيين "# سامبلز" إلى 1 و "إنتغراشيون" إلى "مين" في "إي عينات متعددة لكل نصف قطر".
    5. تعيين "قطع دائرة نصف قطرها إرفاق" إلى 1 وتحقق "استنتاج من دائرة نصف قطرها البداية" ل "# الفروع الأساسية" في "إي الواصفات ومنحنى المناسب".
      ملاحظة: "تناسب الشخصية وحساب الواصفات" و "إظهار تفاصيل المناسب" يمكن التحقق كما تريد.
    6. تحقق "الخطي" وحدد "أفضل درجة المناسب" في "التشكيلات دون تطبيع"؛ تحقق "معظم المعلومات." حدد "منطقة لمحات عادية" في "طرق شول الرابع."
    7. تحقق من "إنشاء التقاطعات قناع" في "V. خيارات الإخراج" لإنشاء خريطة الحرارة من التقاطعات (اختياري).
    8. انقر على "التقسيم إلى شرائح" لإنشاء نافذة معاينة للصورة باستخدام حلقات لتأكيد المنطقةمن التحليل.
  4. انقر فوق "موافق" لتشغيل التحليل.

5. قياس ميي

  1. قياس ميي عن طريق تتبع أقصر مسافة حول شجرة الظهارية ( الشكل 8 ).
    1. في إيماجيج مع صورة الهيكل العظمي للغدة مفتوحة، انقر فوق أداة المضلع. انقر على نقطة على محيط شجرة الظهارية لبدء المضلع، التحرك في محيط الغدة، وانقر لإضافة جزء خط.
    2. عندما تم التحايل على المنطقة الظهارية بأكملها، انقر نقرا مزدوجا فوق لإغلاق المضلع. اضغط على المفتاح "M" لفتح نافذة النتائج؛ القيمة في عمود "المنطقة" هي ميي.
  2. في الحالات التي تمتد فيها ظهارة غدية خارج العقدة الليمفاوية، طرح منطقة العقدة الليمفاوية (لنا) من ميي عند حساب كثافة المتفرعة.
    1. قياس لنا عن طريق تتبع العقدة الليمفاوية في نفس مانإيه مثل شجرة الظهارية والضغط على "M."
      ملاحظة: يجب طرح لنا من ميي في هذه الحالات لأن العقدة الليمفاوية يمنع التحليل من عد التقاطعات داخل لنا. عندما لم تصل الظهارة العقدة الليمفاوية، لنا هو صفر.

6. الإبلاغ عن البيانات

  1. قيم التقرير لنصف قطرها المرفق، ميي، N، k ، وكثافة المتفرعة.
    ملاحظة: يتم تحديد نصف القطر المرفق في الخطوة 4.2 ويتم تحديد ميي في الخطوة 5.1.
    1. تشغيل التحليل لإنشاء نافذة النتائج شول.
      ملاحظة: N المبلغ عنها هو قيمة لتداخل المجموع. و k المبلغ هو قيمة معامل الانحدار شول (شبه لوغ). تحليل شول سيعود قيمة ل k على أي منطقة قياس من ظهارة غدية. للحصول على قيمة دقيقة ل k على ظهارة كاملة، يجب أن تكون نهايات الأقنية موجودة.
    2. تعديل ثه تحليل شول للغدة الثديية باستخدام قيمة الانتاج ل N لحساب الكثافة المتفرعة (نقطة النهاية الأساسية لهذه الطريقة). احسب الكثافة المتفرعة باستخدام الصيغة N / (ميي-لنا) وأبلغ عن القيمة N / مم 2 .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يتم الإبلاغ عن القيم لنصف قطرها المغلقة المغلقة، ميي، N، K ، والكثافة المتفرعة المحسوبة للغدة الثديية تحليلها في هذا البروتوكول في الجدول 1 . تحليل شول يولد المؤامرات الخطية وشبه لوغ من عدد من التقاطعات في كل دائرة نصف قطرها ( الشكل 9 )، وإذا تم تحديدها، خريطة الحرارة من التقاطعات ( الشكل 10 ). وتظهر الغدد الأقل تطورا تقاطعات أقل داخل نفس الاتفاقات البيئية المتعدد...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

من الولادة حتى سن البلوغ، نمو الغدة الثديية هو قياس ألوميتريك. بعد سن البلوغ، الغدة الثديية تتطور من خلال واسعة المتفرعة الأقنية واستطالة، والتي تستمر حتى تحت ظهارة الثديية يحتل كامل لوحة الدهون. الخصائص المتفرعة هي جانب مهم من التنمية الغدة الثديية، والقدرة على تحديد موضوعي هذه الخصائص يمكن أن تكون مفيدة للغاية لتقييم التنمية الثديية العادية وتحديد التنمية الشاذة بعد التعرض للحياة في وقت مبكر إلى السموم الثديية.

...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

ويود المؤلفون أن يعترفوا بالدكتور مايكل إيسترلينغ (النظم الاجتماعية والعلمية، دورهام، نك) لمساعدته في التحقق من صحة هذه الطريقة والدكتور تياغو فيريرا (جامعة ماكغيل، مونتريال، كيبيك، كندا) المساعدة مع تطبيق شول.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
تشريح المجلسNANAقطعة من الستايروفوم تقريبا 10 × 12 بوصة مناسبة.
تشريح T-PinsDaiggerEF7419A
زجاجة رذاذ مع الإيثانولNANA70٪ الإيثانول مناسب.
مقص تشريح منحنيأدوات العلومالدقيقة 14569-09
مقص تفصل مستقيمأدوات العلوم الدقيقة14568-09
ملقط منحنيأدوات العلومالدقيقة 11003-12
Superfrost Plus 24 × 75 × 1 مم شرائح مجهرThermoFisher Scientific4951PLUS-001ثرمو ساینتفيك سوبر فروست بلس & تحتفظ شرائح Colorfrost Plus بأقسام الأنسجة بشكل دائم دون الحاجة إلى طلاءات باهظة الثمن في تطبيقات IHC و Anatomical Pathology. يقلل هذا العلاج من فقدان الأنسجة أثناء التلوين بالإضافة إلى ساعات من تحضير الشرائح. تجذب الشرائح كهروساكنة أقسام الأنسجة المجمدة ومستحضرات علم الخلايا وتتميز بكيمياء مشابهة للسيلان ، على الرغم من تحسينها لتحسين أداء التطبيق.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/4951PLUS4. 
Fisherfinest غطاء فاخر زجاج 24 × 60 × 1 ممفيشر علمي12-548-5P
Bemis Parafilm M فيلم تغليف مختبرفيشر علمي13-374-12
كلوروفورمسيجما ألدريتشC2432
حمض الخليك الجليديسيجما ألدريتشA9967
الإيثانول المطلق ، > 99.8٪ (GC) Sigma-Aldrich24102
XyleneSigma-Aldrich214736
Carmine alum Sigma-AldrichC1022
كبريتات الألومنيوم البوتاسيوم Sigma-AldrichA6435
Permount تصاعد وسائل الإعلامفيشر ScientificSP15
MacroscopeLeicaZ16 APO  هذه هي الأجهزة والبرامج التي تلتقط الصور المستخدمة في هذا المختبر. نظرا لوجود العديد من الخيارات المختلفة ، قد تختلف الأساليب والتطبيقات بين المختبرات.
الكاميرا الرقميةلايكاDFC295
برنامج الكاميرالايكاتطبيق جناح v3.1 
برنامج ImageJمفتوح المصدرhttp://imagej.net/Welcome
تحليل Sholl http://imagej.net/Sholl_Analysisمفتوح المصدر

المراجع

  1. Sholl, D. A. Dendritic organization of the neurons in the visual and motor cortices of the cat. J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).
  2. Ferreira, T. A., Iacono, L. L., Gross, C. T. Serotonin receptor 1A modulates actin dynamics and restricts dendritic growth in hippocampal neurons. Eur J Neurosci. 32 (1), 18-26 (2010).
  3. Stanko, J. P., Easterling, M. R., Fenton, S. E. Application of Sholl analysis to quantify changes in growth and development in rat mammary gland whole mounts. Reprod Toxicol. 54, 129-135 (2015).
  4. Assis, S., Warri, A., Cruz, M. I., Hilakivi-Clarke, L. Changes in Mammary Gland Morphology and Breast Cancer Risk in Rats. J. Vis. Exp. (44), e2260(2010).
  5. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of Mammary Gland Development and Function in Mouse Models. J. Vis. Exp. (53), e2828(2011).
  6. Ferreira, T. Sholl Analysis. ImageJ. , Available from: http://imagej.net/Sholl_Analysis (2012).
  7. Ferreira, T., Rasband, W. ImageJ User Guide. IJ 1.46r. ImageJ. , Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/146.html (2012).
  8. Tucker, D. K., Foley, J. F., Hayes-Bouknight, S. A., Fenton, S. E. Preparation of High-quality Hematoxylin and Eosin-stained Sections from Rodent Mammary Gland Whole Mounts for Histopathologic Review. Toxicol Pathol. 44 (7), 1059-1064 (2016).
  9. Fenton, S. E., Hamm, J. T., Birnbaum, L. S., Youngblood, G. L. Persistent abnormalities in the rat mammary gland following gestational and lactational exposure to 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD). Toxicol Sci. 67 (1), 63-74 (2002).
  10. Murray, T. J., Maffini, M. V., Ucci, A. A., Sonnenschein, C., Soto, A. M. Induction of mammary gland ductal hyperplasias and carcinoma in situ following fetal bisphenol A exposure. Reprod Toxicol. 23 (3), 383-390 (2007).
  11. Moral, R., Santucci-Pereira, J., Wang, R., Russo, I. H., Lamartiniere, C. A., Russo, J. In utero exposure to butyl benzyl phthalate induces modifications in the morphology and the gene expression profile of the mammary gland: an experimental study in rats. Environ Health. 10 (1), 5(2011).
  12. Johnson, M. D., Mueller, S. C. Three dimensional multiphoton imaging of fresh and whole mount developing mouse mammary glands. BMC Cancer. 13, 373(2013).
  13. Enoch, R. R., Stanko, J. P., Greiner, S. N., Youngblood, G. L., Rayner, J. L., Fenton, S. E. Mammary gland development as a sensitive end point after acute prenatal exposure to an atrazine metabolite mixture in female Long-Evans rats. Environ Health Persp. 115 (4), 541-547 (2007).
  14. Hovey, R. C., Coder, P. S., Wolf, J. C., Sielken, R. L., Tisdel, M. O., Breckenridge, C. B. Quantitative assessment of mammary gland development in female Long Evans rats following in utero exposure to atrazine. Toxicol Sci. 119 (2), 380-390 (2011).
  15. Mandrup, K. R., Hass, U., Christiansen, S., Boberg, J. Perinatal ethinyl oestradiol alters mammary gland development in male and female Wistar rats. Inter J of Androl. 35 (3), 385-396 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

ImageJ

مقالات ذات صلة