رصد إير / سر إطلاق الكالسيوم مع الكالسيوم المستهدفة 2+ الاستشعار الماسك +

ملخص

نقدم البروتوكولات لتطبيق لدينا الهدف الكنسي المشفرة وراثيا مؤشر (جيسي) الماسك ⁺ لرصد العابرين الكالسيوم السريع في الشبكة الداخلية / ساركوبلاسميك (إير / سر) من HEK293 والهيكل العظمي خلايا C2C12 العضلات باستخدام في الوقت الحقيقي المجهر مضان. ويناقش أيضا بروتوكول للقياس في الموقع K _د ومعايرة.

الملخص

الكالسيوم داخل الخلايا (كا ^{2 +} ) العابرين التي أثارها المحفزات خارج الخلية الشروع في العديد من العمليات البيولوجية في الكائنات الحية. في مركز الإفراج عن الكالسيوم داخل الخلايا هي العضيات الرئيسية تخزين الكالسيوم داخل الخلايا، الشبكة إندوبلازميك (إير) والسبيكوبلازمية أكثر تخصصا (سر) في خلايا العضلات. يتم بوساطة إطلاق ديناميكية من الكالسيوم من هذه العضيات من قبل مستقبلات ريانودين (رير) ومستقبلات إينوسيتول 1،4،5 ثلاثي الفوسفات (إب ₃ R) مع إعادة التعبئة التي تحدث من خلال ساركو / إندوبلازميك ريسيكلوم مضخة الكالسيوم أتباس (سيركا). تم إنشاء جهاز استشعار الكالسيوم المشفر وراثيا (جيسي) يسمى كاتشر لمراقبة الإفراج عن الكالسيوم السريع من إير / سر. هنا، والبروتوكولات التفصيلية لترنسفكأيشن والتعبير عن تحسين، إير / سر المستهدفة جيسي الماسك ⁺ في HEK293 و C2C12 الخلايا وتطبيقه في رصد إب ₃ R، ري، و سيركا بوساطة مضخة الكالسيوم عابرةs في HEK293 الخلايا باستخدام المجهر مضان موجزة. يتم تشتت ناهض مستقبلات أو مثبط الاختيار في حل الغرفة وتسجيل التغيرات كثافة في الوقت الحقيقي. مع هذه الطريقة، وينظر إلى انخفاض في الكالسيوم إير مع تفعيل ري مع 4-كلورو م- كريسول (4-سمك)، والتفعيل غير المباشر من إب ₃ R مع أدينوسين ثلاثي الفوسفات (أتب)، وتثبيط مضخة سيركا مع سيكلوبازونيك حمض (كبا). نناقش أيضا بروتوكولات لتحديد في الموقع K _د وتقدير القاعدي [كا ^{2 +} ] في الخلايا C2C12. وباختصار، فإن هذه البروتوكولات، وتستخدم جنبا إلى جنب مع الماسك ⁺ ، يمكن أن تثير مستقبلات بوساطة الإفراج عن الكالسيوم من إير مع التطبيق في المستقبل لدراسة إير / سر أمراض الكالسيوم ذات الصلة.

المقدمة

السمات المكانية والزمانية من الكالسيوم داخل الخلايا (كا ^{2 +} ) العابرين تفعيل مختلف الوظائف البيولوجية ¹ . يتم تشغيل هذه الأحداث كا ^{2 +} إشارة خارج الخلية من خلال المحفزات المختلفة والسيطرة عليها داخل الخلايا من قبل كبير كا ^{2 +} أورغانيل التخزين والعديد من كا ^{2 +} مضخات وقنوات وكا ²⁺ البروتينات ملزمة. كا ²⁺ العابرين يمكن أن تتغير بشكل كبير نتيجة للعيوب مع إشارة التشكيل، مما يؤدي إلى أمراض مختلفة ² . وبسبب سرعة وتعقيد نظام التشوير كا ²⁺ مع الشبكة النهائية والسلكوبلازمي (سر) في المركز، هناك حاجة إلى تحقيقات كا ^{2 +} المشفرة وراثيا التي تم تحسينها لتعبير الثدييات مع حركية سريعة لمراقبة كا ^{2 +} العالمية والمحلية التغييرات في خلايا مختلفة ³ .

و إير و سر، نظيره في خلايا العضلات، هي الخلايا الرئيسية كا ^{2 +} العضيات التخزين وتعمل بمثابة كا ^{2 +} المصارف التي تساعد على تضخيم كا ^{2 +} إشارة ⁴ . و إير / سر هو جزء لا يتجزأ من كا ^{2 +} يشير مع الأدوار المزدوجة كمرسل ومستقبل للإشارات ⁵ . مستقبلات ريانودين (رير) و إينوسيتول 1،4،5 ثلاثي الفوسفات مستقبلات (إب ₃ R) هي كا ²⁺ مستقبلات الافراج الموجودة على أغشية إير / سر التي ينظمها كا ^{2 + 6} . عوامل أخرى تحفز بشكل مباشر أو غير مباشر وظيفة هذه المستقبلات. 4-كلورو- م- كريسول (4-سمك) هو ناهض قوية من رير، وجود حساسية أعلى 10 أضعاف من الكافيين لإحداث ريال كا ^{2 +} الإفراج حيث يتم استخدام كلاهما بانتظام لدراسة ري بوساطة كا ^{2 +} الإفراج في خلايا صحية ومريضة ⁷ . أتب يزيد إب _3- كايد ^{2 +} إعادةالإيجار من خلال إب ₃ R ⁸ . أتب يربط إلى مستقبلات بورينرجيك P2YR، مستقبلات G- البروتين المقترنة (غر)، مما اثار انتاج إب ₃ الذي يربط إلى إب ₃ R لاطلاق سراح كا ^{2 +} من إير ^{9 ، 10} . و ساركو-إندوبلاسميك ريتيكولوم الكالسيوم أتباس مضخة (سيركا) هي مضخة P- نوع أتباس، وتقع أيضا على إير / سر الغشاء الذي يقلل من سعال عصبي كا ^{2 +} ويغسل إير / سر عن طريق ضخ بنشاط أيون في تجويف إير / سر ^{11 -} وتشمل مثبطات محددة من مضخة سيركا ثابسيجارجين، من ثابسيا غارغانيكا ، وحمض السيكلوبازونيك (كبا)، من الرشاشيات والبنسليوم . كبا لديه تقارب منخفض للمضخة وكتل عكسية كا ^{2 +} نقطة الوصول ¹² . ثابسيجارجين، من ناحية أخرى، يربط لا رجعة فيه إلى كا ^{2 +} مضخة الحرة في بقايا F256 في الحلزون M3 مع نانومولأر التقارب ¹¹ . تحليل وقياس التغيرات التي تنطوي عليها كا ²⁺ الأحداث حفز كان ولا يزال يشكل تحديا. منذ إير / سر هو تحت الخلية الرئيسية ^{2 +} كا تحتوي على مقصورة مع وظيفة مركزية في نشر إشارة كا ^{2 +} ، وقد ركز الكثير من العمل على فهم إير / سر كا ^{2 +} يشير ⁵ .

خلق الاصطناعية كا ^{2 +} الأصباغ ساعدت على التقدم في مجال وممارسة كا ^{2 +} التصوير. على الرغم من أن الأصباغ، مثل ماج-فورا-2، قد استخدمت على نطاق واسع لقياس الكالسيوم المجزأة ²⁺ في خلايا مختلفة، ^{13 ، 14 ، 15} لديهم قيود مثل تحميل الصبغ غير المتكافئ، فوتوبلاشينغ، وعدم القدرة على أن تستهدف عضيات محددة . اكتشاف البروتين الفلورسنت الأخضر (غفب) والنهوض بروتين الفلورسنت،على أساس كا ^{2 +} تحقيقات دفعت مجال كا ^{2 +} التصوير إلى الأمام ¹⁶ . بعض من جيسي الحالية هي فورستر نقل الطاقة الرنين (فريت) أزواج تنطوي على بروتين الفلورسنت الأصفر (يف)، سماوي الفلورسنت البروتين (سفب)، كالمودولين و M13 الببتيد ملزمة ^{17 ، 18} . تروبونين C- جيسيس كما تتوفر كما أزواج فريت من سفب والسترين وكما واحد فلورفور تحقيقات ^{19 ، 20 ، 21} . البعض الآخر، مثل GCAMP2 و R-غيكو هي أجهزة استشعار فلورفور واحدة تشمل كالمودولين ^{22 ، 23} . للتغلب على قيود الضيقة ضبط K _د والتعاونية ملزمة المرتبطة الكالسيوم ^{+ 2} مواقع ملزمة وجدت في الكالسيوم ²⁺ مجالات ملزمة ²⁴ ، فئة جديدة من الكالسيوم سينتم إنشاء سورس من خلال تصميم كا ²⁺ موقع ملزم على سطح برميل بيتا في موقع حساس كروموفور من تعزيز بروتين الفلورسنت الأخضر (إغف) ^{25 ، 26} . هذا الاستشعار توصف للغاية، ودعا الماسك، لديه K _د من ~ 0.18 ملم، أك _على مقربة من حد الانتشار، و أك من 700 ثانية ^-1 . وقد استخدمت الماسك لرصد مستقبلات بوساطة إير / سر الإفراج عن الكالسيوم في خطوط خلايا الثدييات المختلفة مثل هيلا، HEK293، و C2C12 ²⁵ . بسبب حركتها سريعة، كان يستخدم الماسك في الألياف العضلية المثنية ديجيتوروم (فدب) من الصغار والكبار صديق فيروس B نيه جاكسون (ففب) الفئران للكشف عن أن المزيد من كا ^{2 +} لا يزال في ريال سعودي بعد 2 ثانية من الاستقطاب في فدب ألياف الفئران القديمة مقارنة مع الفئران الشابة ²⁷ . للتغلب على مضان منخفضة في 37 درجة مئوية، مما يعيق تطبيقاته في التصوير الكالسيوم من الثديياتالخلايا، قمنا بتطوير نسخة محسنة من الماسك دعا الماسك ⁺ . الماسك ⁺ المعارض تعزيز مضان في 37 درجة مئوية لتطبيق أفضل في خلايا الثدييات. وأدرجت طفرات إضافية في الماسك لتحسين الحرارة ومضان في 37 درجة مئوية ^{28 ، 29} ، لخلق الماسك ⁺ . يظهر الماسك ⁺ زيادة ستة أضعاف في نسبة الإشارة إلى الضوضاء (شنر) على الماسك ³⁰ .

هنا، يتم عرض البروتوكولات للثقافة وترنسفكأيشن من HEK293 و C2C12 الخلايا مع الماسك ⁺ وتطبيقها لرصد إير / سر العابرة بوساطة مستقبلات الكالسيوم. وتظهر النتائج التمثيلية لل كاتشر ⁺ أعرب في خلايا HEK293 تعامل مع 4-سمك، كبا و أتب. ونحن نقدم أيضا بروتوكول لتحديد في الموقع K _د من الماسك ⁺ في الخلايا ميوبلاست C2C12 وكوانتيفيكاتيون من القاعدية [كا ^{2 +} ].

البروتوكول

1. إعداد الشرائح

1. وضع 22 مم × 40 ملم شرائح المجهر الزجاج في 6 سم أطباق ثقافة الخلية، 1 شريحة في الطبق.
2. فضح كل جانب من كل شريحة وكذلك طبق 6 سم إلى الأشعة فوق البنفسجية (أوف) ضوء لمدة 15-20 دقيقة لتعقيم في غطاء محرك السيارة العقيمة.
3. تغطية الأطباق مع الشرائح داخل مع بارافيلم وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى جاهزة للاستخدام.

2. إعداد وسائل الإعلام، مخازن، حلول، والكواشف

1. إعداد 1 لتر من حل الملح المتوازن هانك (هبس) في الماء منزوع الأيونات وإضافة 10 ملي هيبيس، 5 ملي ناهكو ₃ ، و 1 ملي إغتا. ضبط لدرجة الحموضة 7.2-7.3 مع هيدروكسيد الصوديوم. تصفية العازلة مع مرشح 0.22 ميكرون في زجاجة تعقيمها.
2. إعداد 900 مل من الجلوكوز ارتفاع دولبيكو في تعديل النسر المتوسطة (دمم) ح في الماء منزوع الأيونات. إضافة 44 ملي ناهكو ₃ وضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.3 مع حمض الهيدروكلوريك. تصفية وسائل الاعلام مع مرشح 0.22 ميكرون في زجاجة تعقيمها. إضافة 100 مل من بوفي الجنينالمصل ن (فبس) إلى وسائل الإعلام لجعل تركيز فبس 10٪. تخزين في 4 درجات مئوية.
3. إعداد 1 لتر من العازلة بين الخلايا (125 ملي بوكل، 25 ملي كلوريد الصوديوم، 10 ملي هيبيس، 0.2 ملي كاكل ₂ ، 0.5 ملي إغتا، 0.2 ملي مغكل ₂ ) في الماء منزوع الأيونات، وضبط درجة الحموضة إلى 7.25. سيكون [كا ^{2 +} ] النهائي ~ 100 نانومتر. قبل الاستخدام، إضافة 0.5 ملم أتب. احفظه في درجة حرارة الغرفة.
4. إعداد 1 لتر من العازلة قارع الأجراس (121 ملي كلوريد الصوديوم، 2.4 ملم K ₂ هبو ₄ ، 0.4 ملم خ ₂ بو ₄ ، 10 ملي هيبيس، و 1.2 ملي مغكل ₂ ) في الماء منزوع الأيونات، وضبط درجة الحموضة إلى 7.2. احفظه في درجة حرارة الغرفة. لاستخدام، قسامة 50 مل في أنبوب 50 مل وإضافة 1.8 ملي كا ^{2 +} و 10 ملي الجلوكوز.
5. إعداد 1 لتر من محلول شلال بوكل (125 ملي بوكل، 25 ملي كلوريد الصوديوم، 10 ملي هيبيس، 0.2 ملي مغكل ₂ ) في الماء منزوع الأيونات، وضبط درجة الحموضة إلى 7.25.
6. حل 5 ملغ من ايونوميسين في 1 مل من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (دمسو). قسامة 30 ميكرولتر في ميكروتوبس وتخزينها في -206؛ C.
7. إعداد حمض السيكلوبازونيك (كبا) الأسهم عن طريق إذابة سلطة الائتلاف المؤقتة في دمسو. تأكد من أن النسبة المئوية النهائية من دمسو هو ≤ 1٪ للاكتساب تضاف إلى الخلايا لمنع موت الخلايا المبرمج. إعداد 20 ملي 4-كلورو م- كريسول (4-سمك) عن طريق إذابة في H ₂ O تصفيتها والسماح لها تذوب بين عشية وضحاها عن طريق الهز عند 37 درجة مئوية. إعداد الأسهم أتب عن طريق إذابة في تصفية H ₂ O إلى 100 ملم.
8. لتحديد في الموقع K _د ، وإعداد 15 مل كل من 1 ملي إغتا، 0.2 ملي، 0.6 ملم، 2 ملي، 5 ملي، 10 ملي، 20 ملي، 50 ملي، و 100 ملي كا ^{2 +} في العازلة بوكل باستخدام 100 مم إغتا الأسهم و 1 M كاكل ₂ الأسهم الذائبة في الماء منزوع الأيونات.

3. ثقافة الخلية

1. ثقافة الخلايا C2C12 ميوبلاست و HEK293 وفقا لبروتوكولات أتسك لكل باستخدام 10 سم أطباق ثقافة الخلية في غطاء الأشعة فوق البنفسجية العقيمة.
   ملاحظة: لا ينبغي أن يسمح الخلايا C2C12 أن تنمو أعلى من التقاء ~ 70٪ منذ ميوبلاستس ستبدأ في التفاضلتي في ميوتوبيس. كل من خلايا HEK293 و C2C12 تنمو بسهولة ويجب ألا يسمح لها أن تنمو 100٪ كونفلنسي للحفاظ على سلامة الخلية. بالإضافة إلى ذلك، يجب ألا يتم تمرير الخلايا أكثر من 10 مرات قبل استخدامها لتجربة للحفاظ على صحة الخلية.

4. ترنسفكأيشن من HEK293 الخلايا

1. البذور HEK293 الخلايا على تعقيم 22 مم × 40 ملم شرائح المجهر الزجاج في أطباق 6 سم حتى تكون ~ 70٪ متموجة يوم ترنسفكأيشن.
2. في اليوم التالي، اتبع بروتوكول الشركة المصنعة للكاشف ترنسفكأيشن إلى الخلايا ترانسفكتيون باستخدام 2 ميكروغرام من الماسك ⁺ كدنا و 1: 3 (الوزن / حجم) الحمض النووي: نسبة كاشف ترنسفكأيشن في وسائل الإعلام المصل انخفاض (على سبيل المثال أوبتي-ميم).
3. إفراغ وسائل الإعلام دمم من الطبق، وإضافة 3 مل من وسائل الإعلام المصل انخفاض. إضافة الحمض النووي: ترنسفكأيشن خليط كاشف إلى الطبق واحتضان لمدة 4-6 ح في 37 درجة مئوية.
4. بعد الحضانة، وغسل الخلايا مع 5-6 مل من هبس. تجاهل هبس fروم الطبق واستبدالها مع 3 مل من دمم جديدة واحتضان لهم في 37 درجة مئوية لمدة 48 ساعة للسماح للتعبير عن جيسي.
5. ترنسفكأيشن من الخلايا ميوبلاست C2C12
   1. بالنسبة للخلايا ميوبلاست C2C12، تريبسينيز الخلايا عن طريق إضافة ما يكفي من التربسين لتغطية الجزء السفلي من الطبق (1-2 مل). وضع الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2-6 دقائق للسماح لل التربسين لتخفيف الخلايا من الجزء السفلي من الطبق.
   2. مرة واحدة في حضانة كاملة، وإزالة التربسين ونضح الخلايا في 8 مل من دمم. ماصة الخلايا بدقة مع دمم لتفريق بالتساوي وإعادة تعليق خلايا تي وبذورها على كوفرسليبس العقيمة في 6 سم أطباق ثقافة الخلية التي تحتوي على 3 مل من دمم بحيث التقاء النهائي هو 60٪.
   3. ترانسفيكت الخلايا في نفس اليوم كما هو موضح في الخطوة 4.2-4.3. احتضان لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية.
   4. كرر الخطوة 4.4.

5. إعداد الشرائح والمضان المجهر

1. شغل mالمجهر مصدر الضوء، ثم فتح برنامج يسي بسيط. السماح للمجهر إلى الاحماء لمدة 15-20 دقيقة أو حتى يبرد الكاميرا (كسد) جهاز تهمة إلى -65 درجة مئوية. إعداد الغرفة والانزلاق مع الخلايا أثناء الانتظار.
2. تغطية الجزء السفلي من الانظار مفتوحة الماس غرفة حمام التصوير مع طبقة رقيقة من تسرب، وذلك باستخدام مسحة القطن.
3. اتخاذ الشريحة التي تحتوي على خلايا ترانزفكتد من الحاضنة وشطف بلطف ثلاث مرات مع 1 مل من العازلة قارع الأجراس مع 10 ملي الجلوكوز و 1.8 ملي كا ^{2 +} مسخن إلى 37 درجة مئوية.
4. ترك 1 مل من العازلة قارع الأجراس في الطبق، لمنع الخلايا من التجفيف، واستخدام ملقط لاتخاذ الشريحة من الطبق. السماح الحل الزائد على استيعاب الأنسجة المختبرية عن طريق لمس حافة الشريحة إلى الأنسجة المختبرية. ثم ضع على جانب الغرفة التي تحتوي على الشحوم مع الخلايا التي تواجه نحو الشحوم وغرفة آمنة على جبل المرحلة باستخدام مفك البراغي.
5. إضافة 1مل من العازلة قارع الأجراس إلى الغرفة لمنع الخلايا من التجفيف في حين تصاعد الغرفة على المسرح واستكمال بقية الإعداد المجهر. مرة واحدة يتم إرفاق خرطوم شفط فراغ إلى غرفة، وحجم النهائي يحمل الغرفة هو ~ 450 ميكرولتر.
6. تحويل الهدف المجهر إلى 40X الهدف الغمر النفط.
7. استخدام عدسة الورق والعدسة تنظيف الحل لتنظيف وتجفيف الهدف. لا تفرك الهدف. داب بلطف حتى سطح نظيف.
8. إضافة قطرة واحدة من زيت الغمر إلى الهدف.
9. وضع جبل على مرحلة المجهر وإضافة طرف فراغ إلى الغرفة. مرة واحدة يتم إرفاق خرطوم شفط فراغ إلى غرفة وتشغيلها، وحجم النهائي يحمل الغرفة هو ~ 450 ميكرولتر. هذا الحجم النهائي هو المستوى مع الجانبين من الغرفة. لا بد من حل غرفة ليكون مستوى، خلال التجربة، لمنع الحل من الانسكاب في الهدف بسبب الإفراط في الملء.
رفع الهدف واستخدام التعديل الخشنة حتى يلمس النفط على الهدف الجزء السفلي من الشريحة.
10. باستخدام وضع الحقل مشرق، وضبط الكسب إلى 175 ووقت التعرض إلى 0.03 ثانية لتركيز الخلايا.
11. مرة واحدة وتركز الخلايا، والتحول إلى وضع مضان باستخدام 488 نانومتر الإثارة. تغيير وقت التعرض إلى 0.07 ثانية. حدد مجال الرؤية التي لديها ما يكفي من الخلايا التي هي صحية مع مضان كافية إلى الصورة.
12. مرة واحدة وقد تم اختيار مجال الرؤية، والتقاط الصور في مضان ووضع الحقل مشرق.
13. دائرة منطقة من الفائدة (روي) في الخلايا أو دائرة الخلية بأكملها لتسجيل كثافة من المنطقة التي تم اختيارها.

6. التصوير المخدرات التي يسببها كا ²⁺ العابرين وفي الموقع K _د المعايرة

1. بدء قياس كثافة مع معدل الإطار تعيين في واحد كل 5 ثوان.
2. السماح لشدة خط الأساس لتحقيق الاستقرار لمدة 20-30 لقطة (100-150 ق). إذا لزم الأمر، وانخفاض الابأميس / ثانية خلال هذه الخطوة لمنع فوتوبلاشينغ.
3. حساب كمية 4 سمك اللازمة من الأسهم 20 ملم على أساس حجم الغرفة النهائي من ~ 450 ميكرولتر لجعل تركيز النهائي من 200 ميكرومتر. جعل التخفيفات من المخزون حسب الضرورة.
4. تأخذ بعناية 60 ميكرولتر من العازلة قارع الأجراس من الغرفة ومكان في أنبوب ميكروسنتريفوج. تمييع كمية محسوبة من 4-سمك مع هذا الحل وإضافة مرة أخرى إلى غرفة لاستحضار الاستجابة المقصود من الخلايا التي يجري تصويرها.
5. إضافة المبلغ المحسوب من 4-سمك إلى أنبوب ميكروسنتريفوج ومزيج بواسطة بيبتينغ.
6. إضافة بلطف الحل على مجال الرؤية في حين اضاف في وقت واحد علامة الحدث في قياس كثافة.
7. السماح الوقت للدواء لربط لمستقبلات وانخفاض إشارة لاحقة، ثم يغسل مع 3-6 مل من العازلة قارع الأجراس مع 1.8 ملي كا ^{2 +} و 10 ملي الجلوكوز في حين اضاف في وقت واحد علامة الحدث. منذ حجم الغرفة هو 450 &# 181؛ L ويرتبط إلى فراغ، مضيفا 3-6 مل من العازلة يضمن أن الحل السابق الذي يحتوي على الدواء قد تم غسلها بعيدا واستبداله مع الحل المضافة حديثا.
8. كرر 6.1-6.7 ل 100 ميكرومتر أتب و 15 ميكرومتر كبا، وذلك باستخدام شريحة جديدة من الخلايا ترانزفكتد لكل فحص.
9. وبمجرد الانتهاء من القياس، إنهاء جمع البيانات في إطار قياس كثافة في برنامج يسي بسيط.
10. خذ مضان وصور برايتفيلد من الخلايا.
11. افتح ملف البيانات للتجربة. هنا، إعادة دائرة الخلايا أو المناطق التي تهم إعادة حساب قيم كثافة، إذا لزم الأمر.
12. لتحديد في الموقع K _د في الخلايا ميوبلاست C2C12، اتبع البروتوكول على النحو المبين في القسم 4.2 والجزء 5 ووضع 1 مل من 0 ملي كا ^{2 +} العازلة قارع الأجراس في الغرفة.
    1. بيرمابيليز الخلايا مع سابونين 0.002-0.005٪ في المخزن داخل الخلايا لمدة 15-30 ثانية لتفريغ خلايا أيالماسك ⁺ التي قد تكون في السيتوسول. غسل الخلايا مع 3-6 مل من 1 مل إغتا في العازلة بوكل مع 10 ميكرومتر أيونوميسين. السماح لشدة لتقليل حتى يتم التوصل إلى الهضبة.
    2. شطف مع 3-6 مل من العازلة بوكل مع 10 ميكرومتر أيونوميسين والسماح لشدة لتحقيق الاستقرار، ثم إضافة كل كا ^{2 +} حل مفصل في الخطوة 2.7. السماح لشدة للوصول إلى الهضبة بين كل إضافة.
13. لمعايرة جهاز استشعار القياس الكمي [كا ^{2 +} ]، اتبع الخطوة 6.12. استخدام إغتا و 100 ملي كا ^{2 +} العازلة من الخطوة 2.7 للحصول على الحد الأدنى والحد الأقصى كثافة مضان.

7. معالجة البيانات

1. تحميل ملف جدول البيانات من بيانات قياس كثافة.
2. تطبيع البيانات لكل خلية إلى كثافة خط الأساس (F / F ₀ ). رسم البيانات تطبيع مقابل الوقت في أي برنامج الرسوم البيانية.
3. لحساب التغيير٪، طرح الذروة تطبيع فالإي من 1 وتضاعف بمقدار 100. احسب المتوسط ​​والانحراف المعياري إذا تم تصوير خلايا متعددة.
4. لحساب نسبة الإشارة إلى الضوضاء، شنر، وفتح ملف الصورة المحفوظة من التجربة في برنامج معالجة الصور، مثل إيماجيج، ومن ثم قياس إشارة والخلايا ترانزفكتد، والضوضاء، والخلفية. احسب النسبة شنر باستعمال المعادلة شنر = سيغنال / نويز.
5. لحساب K في الموقع من البيانات التي تم جمعها التصوير مضان، متوسط ​​البيانات كثافة، التي تتألف من الهضاب، بعد إضافة كل تركيز كا ^{2 +} و إغتا (0 ملي كا ²⁺ ). حساب التشبع كسور (كثافة النسبية) باستخدام θ = (F - F _دقيقة ) / (F _ماكس - F _دقيقة )، حيث θ هو الكثافة النسبية، F هو مضان في أي لحظة، F _دقيقة هو الحد الأدنى من كثافة مضان، و F _ماكس هو أقصى كثافة مضان، لمعرفة التغيير في شدة روقال انه التحقيق مع إضافة كا ^{2 +} مقارنة مع الحد الأدنى من كثافة. رسم البيانات كثافة النسبية ضد [كا ^{2 +} ] في أي الرسم البياني والمنحنى المناسب البرنامج. استخدم معادلة الارتباط 1: 1 θ = [M _T ] / (K _d + [M _T ]) المترجمة لأي برنامج رسم بياني ومنحنى مناسب لحساب K _d . M _T هو مجموع تركيز المعادن.
6. لقياس الكالسيوم القاعدي من المعايرة المبينة في 6.13، متوسط ​​البيانات كثافة، تتألف من الهضاب، بعد إضافة 1 ملي إغتا (F _مين ) و 100 ملي كا ^{2 +} (F _ماكس ). استخدام معادلة المعايرة [كا ^{2 +} ] = K _د ([F - F _دقيقة ) / (F _ماكس - F)] لحساب الكالسيوم القاعدية.

النتائج

سيوضح هذا القسم النتائج التي تم تحقيقها باستخدام الأساليب الموصوفة سابقا باستخدام محسن جيسي كاتشر ⁺ إير / المستهدفة من أجل رصد التغيرات في إير / سر كا ^{2 +} من خلال مسارات مستقبلات بوساطة مختلفة.

يوضح الشكل 1 إير تفريغ من خلال رير حفز مع 200 ميكرومتر 4-سمك. 4-سمك هو ناهض من رير. إضافة الدواء يدفع إل...

المناقشة

يعيش التصوير خلية واحدة من تحقيقات الفلورسنت، مثل الماسك ⁺ ، هو تقنية فعالة لتحليل معقدة إير / سر كا ^{2 +} عمليات الإشارات في كل خلية استجابة لناهضات مستقبلات أو الخصوم. هذه التقنية هي أيضا مفيدة للتصوير باستخدام موجات متعددة في وقت واحد، مثل الحاجة ل فورا-2 أو صورة الماسك ⁺ و رود-2 معا لمراقبة كل من إير والتغيرات الكالسيوم خلوي خلوي، على التوالي. هناك عدة خطوات حاسمة في هذا البروتوكول. ترنسفكأيشن الخلية يمكن أن يكون لها تأثير كبير على بقاء التصوير. ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
4-كلورو-3-ميثيل فينول (4-سم مكعب)	سيجما ألدريتش	C55402
515DCXR مرآة ثنائية اللون	Chroma Technology Corp.	NC338059
أدينوزين 5 & برايم ؛ -ثلاثي فوسفات ملح ثنائي الصوديوم هيدرات	سيجما ألدريتش	A26209
كلوريد الكالسيوم ثنائي هيدرات	EMD ميليبور	102382
أطباق الثقافة المعالجة بزراعة الأنسجة كورنينج (100 مم)	بزراعة الأنسجة Sigma-Aldrich	CLS430167
Corning (60 مم)	Sigma-Aldrich	CLS430166
حمض السيكلوبيازونيك (CPA)	EMD Millipore	239805
D (+) - الجلوكوز	ACROS Organics	41095-0010
داو كورنينج 111 زيوت التشحيم وأمبير مانعة التسرب	وارنر إنسترومنتس	64-0275
Dulbecco s النسر المعدل s متوسط (DMEM)	سيجما ألدريتش	D7777
إيثيلينبيس (أوكسي إيثيلين لينيتريلو) حمض رباعي الأسيتيك (EGTA)	ACROS Organics	409911000  ؛
مصل الأبقار الجنيني (FBS)	ThermoFisher	26140087
غطاء فيشربراند نظارات 22x40 مم	فيشر العلمي	12-544 ب
هانكس أملاح متوازنة (HBSS)	Sigma-Aldrich	H4891
HEPES ، حمض خال ، بيولوجيا جزيئية من الدرجة	EMD Millipore	391340
زيت غمر بدون تألق ذاتي	Leica	11513859
Ionomycin ، فري حمض	فيشر Scientific	50-230-5804
Leica DM6100B مجهر مقلوب مع كاميرا EM-CCD مبردة	Hamamatsu	C9100-13
Lipofectamine 2000 كاشف التعداء	ThermoFisher	11668019
Lipofectamine 3000 كاشف الإرسال	ThermoFisher	L3000015
غرفة تصوير حمام الماس المفتوحة منخفضة الأضواء	Warner Instruments	RC-26GLP
كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدرات	فيشر Scientific	M33-500
Opti-MEM	ThermoFisher	51985034
كلوريد البوتاسيوم	EMD Millipore	PX1405
فوسفات البوتاسيوم ، ثنائي القاعدة	EMD Millipore	PX1570
فوسفات البوتاسيوم ، أحادي القاعدة	EMD Millipore	PX1565
Saponin	Sigma-Aldrich	47036
برنامج تحليل الصور SimplePCI	Hamamatsu	N / A
بيكربونات الصوديوم	فيشر Scientific	S233-3
كلوريد الصوديوم	فيشر Scientific	S271-500
Sterivex-GV 0.22 & micro ؛ مرشح m	EMD Millipore	SVGVB1010
حتى مصباح زينون متعدد الألوان V	حتى الضوئيات	N / A
Trypsin (2.5٪) بدون فينول أحمر (10x)	ThermoFisher	15090046