أحكام الضوابط البطانة الوعائية التوظيف الكريات البيض. ويساهم التسرب الكريات البيض غير كافية أمراض التهابات البشرية. ولذلك، تبحث عن رواية العناصر التنظيمية لتفعيل غشائي ضروري لتصميم تحسين العلاج لأمراض التهابات. وهنا يصف لنا منهجية شاملة لتوصيف المنظمين غشائي الرواية التي يمكن تعديلها الكريات البيض الاتجار أثناء التهاب.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
فحص فحوصات لوصف رواية غشائي المنظمين المتورطين في الاستجابة الالتهابية
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الطبقة غشائي أمر ضروري للحفاظ على التوازن في الجسم من خلال السيطرة على العديد من الوظائف المختلفة. تنظيم استجابة التهاب الطبقة غشائي أمر حاسم لمكافحة كفاءة المدخلات الضارة والمساعدة في إنعاش المناطق المتضررة. عندما تتعرض خلايا بطانية لبيئة تحريضية، مثل العنصر الخارجي لغشاء بكتيريا سلبية الغرام، lipopolysaccharide (LPS)، أنها التعبير عن السيتوكينات برو الملتهبة القابلة للذوبان، مثل Ccl5، Cxcl1، و Cxcl10، وتؤدي تفعيل تعميم الكريات البيضاء. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن التعبير عن جزيئات التصاق سيليكتين ه، VCAM-1 والمتكاملة-1 على سطح غشائي التفاعل والتصاق الكريات البيضاء تنشيط الطبقة غشائي، وفي نهاية المطاف التسرب نحو الأنسجة الملتهبة. في هذا السيناريو، الدالة غشائي يجب أحكام تنظيم لأن التنشيط المفرط أو عيب في تجنيد الكريات البيض يمكن أن تؤدي إلى الاضطرابات المتصلة بالتهابات. نظراً للعديد من هذه الاضطرابات لم يكن علاج فعال، يجب التحقيق في استراتيجيات جديدة مع تركيز على طبقة الأوعية الدموية. ونحن نقترح فحوصات شاملة مفيدة للبحث عن المنظمين غشائي الرواية التي تعدل وظيفة الكريات البيض. نحن نحلل غشائي التنشيط باستخدام تعبير محددة الأهداف المتورطين في تجنيد الكريات البيض (مثل، السيتوكينات، المستقطبات، وجزيئات الالتصاق) مع العديد من التقنيات، بما في ذلك: (سلسلة من ردود الفعل بوليميريز الكمية في الوقت الحقيقي رتقبكر)، ووصمة عار الغربية، تدفق فحوصات الخلوي والالتصاق. تحديد وظيفة غشائي في سياق التهاب هذه النهج وهي مفيدة جداً لإجراء فحوصات الكشف لتوصيف المنظمين التهاب غشائي الرواية التي يحتمل أن تكون قيماً لتصميم استراتيجيات علاجية جديدة.
المقدمة
الالتهاب استجابة بيولوجية مفيدة ضد العوامل المعدية, مع الهدف الرئيسي للقضاء على مسببات المرض وإصلاح الأنسجة التالفة. تحت ظروف معينة، مثل الالتهابات المزمنة أو أمراض المناعة الذاتية، لا حل التهاب. بدلاً من ذلك، هناك فعل شاذة مع استمرار تسلل الكريات البيضاء، أدى استجابة مناعية مطول الذي يؤدي إلى تلف الأنسجة، التليف، وفقدان الوظيفة، وعموما، والعجز، وفي بعض الحالات وفاة المريض. هذه الاضطرابات البشرية، نشرة مصورة كأمراض التهابات، كلها تنطوي على الأوعية الدموية للسيطرة على التسرب الكريات البيض1،2.
خلايا بطانية تلعب دوراً أساسيا في تنظيم الاستجابة الالتهابية بمراقبة الاتجار الكريات البيض. ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1-"غشائي خلية ثقافة"
- زراعة الأنسجة تعامل لوحات
- معطف 100 ملم زراعة الأنسجة لوحات مع الجيلاتين 2.5 مل الحل (يعقم، 0.1% الجيلاتين في الماء المقطر) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية؛ وهذا يمكن أن يطبق بالشكل المطلوب تماما. نضح الحل الجيلاتين وترك لوحات أيردري في هود زراعة الأنسجة.
- ظروف زراعة الأنسجة
- زراعة الخلايا القانون النموذجي-04 داخل حاضنة بيولوجية (37 درجة مئوية، ورطوبة 95%، 5% CO 2). تنمو الخلايا الموجودة في وسائل الإعلام كاملة من دولبيكو ' s التعديل النسر المتوسطة: "مزيج المغذيات" F-12 (دميم/و-12) وتستكمل مع 10% مصل بقرى الجنين (FBS) و 100 وحدة/مل البنسلين و 100 ميكروغرام....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تقييم المستحثة بلبس غشائي خلية التنشيط بواسطة RT-قبكر
الخلايا القانون النموذجي-04 المصل جوعاً كانت تحفزها 100 نانوغرام/مليلتر من لبس ح 6، وتم تقييم التعبير الجيني غشائي استخدام الرايت قبكر بمقارنة التعبير عن علامات التنشيط إلى حالة الراحة. كما هو موضح في الشكل 1A، الخلايا المحتضنة لبس القانون النموذجي-04 المستحث التعبير مرناً من جزيئات الالتصاق المحدد المتورطين في تجنيد الكريات البيض خلال الاستجابة الا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويصف هذا البروتوكول غشائي تكنولوجيا التدرجي الذي يرسي الأساس لاستكشاف الآليات الرواية التي تشارك في تنظيم الاستجابة الالتهابية. تستند إلى دراسة النشاط غشائي تحفزها لبس هذه النهج وتقييم الخطوات الحاسمة التي تشارك في تجنيد الكريات البيض خلال الاستجابة الالتهابية، على وجه التحديد: إطلاق السيتوكينات بطانية، التصاق غشائي جزيئات الالتصاق التعبير والكريات البيض لطبقة الأوعية الدموية. حالما يتم إنشاء المعلمات بطانية، النظام يمكن البحث عن رواية المركبات المشاركة في تنظيم وظيفة بطانية، ونتيجة لذلك، تقدم التحريضية. يحتمل أن يمكن تل.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
شكر وتقدير
وأيده هذا العمل y وزارة الاقتصاد دي كومبيتيتيفيداد (مينيكو) ومعهد الصحة كارلوس الثالث (إيسسييي) (منحة رقم 1149/16 إييربي للجامعة؛ مبي 1410/09 إلى س. هورتيلانو)؛ قبل مينيكو عن طريق أون فوندو لبحوث الصحة (الجبهة الإسلامية للإنقاذ) (المنح الأرقام PI11.0036 و PI14.0055 إلى هورتيلانو س.). وأيد هيرانز س. إييربي 1149/16 من إيسسييي.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| الجيلاتين | سيجما | G9391 | |
| DMEM-F12 | لونزا | BE12-719F | |
| مصل الأبقار الجنيني | سيجما | A4503 | |
| البنسلين ستربتومايسين | لونزا | DE17-602E | |
| التربسين | لونزا | BE17-160E | |
| EDTA | سيجما | ED2SS | |
| LPS | سيجما | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | مخزن RNA |
| Extract Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| الإيثانول absoluto | Panreac | 1،310،861،612 | |
| نقي H2< / sub>O | Qiagen | 1017979 | RNAse خالي |
| من Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| وصمة عار لجل الاغاروز | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III أول حبلا موالفة | Invitrogen | الكواشف 18080051 ل RT-PCR | |
| Fast SYBR Green Master Mix | الأنظمة الحيوية التطبيقية | 4385610 | صبغة الفلورسنت ل qPCR |
| MicroAmp سريع بصري 96 جيدا | Biosystems | 4346906 | ل qPCR |
| U-bottom 96 لوحات بئر | Falcon | 353072 | |
| أنابيب القياس الخلوي | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | خافض للتوتر السطحي غير أيوني |
| Tris-HCl | Panreac | 1،319،401،211 | |
| كلوريد الصوديوم | ميرك | 1،064،041،000 | |
| بيروفوسفات الصوديوم | سيجما | 221368 | |
| فلوريد الصوديوم | Sigma | S7920 | |
| أورثوفاناديت الصوديوم | سيجما | 13721-39-6 | |
| كوكتيل مثبط البروتياز | سيجما | P8340 | |
| بيرس BCA فحص البروتين | كيت بيرس | 23225 | الكواشف لمقايسة حمض البيسنكونينيك |
| بيتا ؛ ميركابتو إيثانول | ميرك | 805،740 | |
| غشاء نقل PVDF ، 0.45 & micro ؛ م | ثيرمو ساینتيك | 88518 | |
| توين -20 | بانريك | 1،623،121،611 | بولي سوربات 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| الكولاجين النوع الأول | Sigma | c8919 | |
| حمض الخليك | بانريك | 1،310،081،611 | |
| تريبان الأزرق | سيجما | T8154 | |
| بارافورمالدهايد | سيجما | P6148 | |
| ميثانول | بانريك | 1،310،911،612 | |
| كريستال بنفسجي | سيجما | HT90132 | |
| سترات الصوديوم | سيجما | C7254 | |
| الإيثانول 96٪ | بانريك | 1،410،851،212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | قارئ صفيحة دقيقة متعدد الأوضاع |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | توثيق |
| جل StepOnePlus | الحيوية | التطبيقية StepOnePlus | qPCR نظام |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | معدات قياس الخلايا |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | الكشف عن التلألؤ الكيميائي |
| <قوي><الاسم / قوي > | <قوي>الشركة< قوي> | <قوي>رقم الكتالوج | تعليقات |
| < قوي > أجسام مضادة < / قوي > | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | استخدم عند 10 & ميكرو ؛ جم / مل |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | الاستخدام عند 10 & ميكرو ؛ جم / مل |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | الاستخدام عند 10 & ميكرو ؛ جم / مل |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | استخدم عند 10 & ميكرو ؛ جم / مل |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | استخدم عند 10 & micro ؛ جم / مل |
| مضاد للفئران IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | استخدم في 10 & micro ؛ جم / مل |
| الهامستر الأرمني المضاد للأرمن- FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | الاستخدام في 10 & micro ؛ جم / مل |
| التحكم في الجرذ IgG isotyope | Invitrogen | 10700 | استخدم عند 10 وميكرو ؛ جم / مل |
| الهامستر الأرمني IgG التحكم في النمط المتشاوي | Invitrogen | PA5-33220 | استخدم عند 10 & micro ؛ جم / مل |
| P-I & kappa ؛ &بيتا ;-&ألفا; | إشارات الخلية | 2859 | استخدم عند 10 & ميكرو; جم / مل |
| & بيتا ؛ -Actin | Sigma | A5441 | يستخدم في 10 & micro ؛ g / mL |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | استخدم عند 10 & micro ؛ جم / مل |
| مضاد للفأر HRP | GE Healthcare | LNXA931 / AE | استخدم في 1: 10,000 |
| مضاد للأرانب HRP | GE Healthcare | LNA934V / AG | استخدم في 1: 10,000 |
| Cruz | Sc-3823 | المضاد للفئران | استخدم في 1: 10،000 |
المراجع
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn's disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation? Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
