الحفاظ على تغطية حاجز الدم في الدماغ هو المفتاح لتوازن الجهاز العصبي المركزي. يصف هذا البروتوكول في تقنيات المختبر لترسيم العمليات الأساسية والمرضية التي تعدل تغطية حاجز الدم في الدماغ.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
في مقايسات المختبر لتقييم الحاجز الدموي الدماغي تشبه تشكيل سفينة وتشوه
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تلعب حاجز الدم في الدماغ (بب) دورا محوريا في توازن الجهاز العصبي المركزي (نس). يتم الحفاظ على حيوي بب بواسطة الخلايا النجمية، بيريسيتس والخلايا البطانية في الدماغ (بيكس). هنا، نحن بالتفصيل أساليب لتقييم تغطية بب باستخدام الثقافات واحدة من بيكس الإنسان الخالد، والثقافات واحدة من بيك الأساسي الماوس، ونموذج الثقافة الثلاثي أنسنة (بيكس، النجمية و بيريسيتس) من بب. لتسليط الضوء على تطبيق المقايسات لحالات المرض، ونحن تصف تأثير أميلويد أوليغوميريك β (oAβ)، الذي هو مساهم مهم في مرض الزهايمر (أد) التقدم، على تغطية بب. وعلاوة على ذلك، فإننا نستخدم عامل نمو البشرة (إغف) لإلقاء الضوء على إمكانية فحص المخدرات من التقنيات. نتائجنا تبين أن واحدة وثلاثية بيكس مثقف تشكل هياكل تشبه شبكة في ظل الظروف القاعدية، وأن oAβ يعطل هذه التشكيل خلية تشكيل ويتحول الهياكل شبكة بريفورمد،ولكن إغف يمنع هذا الاضطراب. وبالتالي، فإن التقنيات الموصوفة مهمة لتشريح العمليات الأساسية والمرض ذات الصلة التي تعدل تغطية بب.
المقدمة
الحاجز الدموي الدماغي (بب) من الشعيرات الدموية الدماغية هو أكبر واجهة من الدم إلى الدماغ الاتصال ويلعب دورا رئيسيا في التوازن من الجهاز العصبي المركزي (نس) 1 ، 2 . العمليات الحيوية في بب منع امتصاص الجزيئات غير المرغوب فيها من الدم، وإزالة النفايات من الجهاز العصبي المركزي، وتوفير المواد الغذائية الأساسية وجزيئات الإشارة إلى الجهاز العصبي المركزي، وتعديل نيوروينفلاماشيون 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 . تلف بب هو السائد خلال الشيخوخة والعديد من الاضطرابات العصبية بما في ذلك مرض الزهايمر (أد)، والتصلب المتعدد والسكتة الدماغية 1 ، 2 ، 3 ، 4 ، 5 ،أس = "كريف"> 6. لذلك، قد تلعب خلل بب دورا رئيسيا في الاضطرابات العصبية، بما في ذلك كهدف علاجي.
الحفاظ على تغطية السفينة مهم لوظائف التماثل من بب. ومع ذلك، في الجسم الحي وفي المختبر تضارب البيانات على ما إذا كانت العمليات التي تنطوي على الاضطرابات العصبية تسبب أعلى أو أقل تغطية بب 6 ، 7 ، 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، وخاصة في م. لذلك، هناك مبرر قوي لتطوير نماذج في المختبر باستخدام أنواع الخلايا ذات الصلة لتقييم وفهم شامل لديناميات تغطية بب. وتتكون الشعيرات الدموية الدماغي من الخلايا النجمية، بيريسيتس والخلايا البطانية الدماغ (بيكس) 3. تساهم جميع أنواع الخلايا في وظيفة بب من خلال الدعم الهيكلي وعن طريق إفراز جزيئات المستجيب مثل عوامل نمو الأوعية الدموية، السيتوكينات والكيموكينات التي تعمل بطريقة باراكرين و أوتوكرين مثل. ومع ذلك، فإن الخلايا المستجيب الرئيسية لل بب هي بيكس 3 . بشكل عام، وتقنيات زراعة الخلايا لتقييم وظيفة بب هي مقايسات نفاذية أجريت على الخلايا التي تزرع على إدراج فلتر، أو تقييم مستويات البروتينات الرئيسية بيك، سواء بعد إضافة الضغوطات 14 ، 15 ، 16 . على الرغم من أهمية، هذه المقايسات لا تركز على التغطية الدماغية الوعائية.
هنا، يتم تفصيل أساليبنا السابقة 17 لتقييم تغطية بيك والهياكل الشبيهة بالشبكات باستخدام ثقافات واحدة من بيكس الإنسان الخالدة، والثقافات واحدة من بيك الأساسي الماوس، وثلاثة ثقافة إنسانيةنموذج (بيكس، أستروسيتس و بيريسيتس) من بب. وكان الهدف هو إظهار الأثر الضار لل OAβ، الذي يعتبر مساهما هاما في تقدم أد، على تغطية بيك. تأثير وقائي من عامل نمو البشرة (إغف) يسلط الضوء على إمكانات هذه التقنية كأداة الفحص العلاجي. هذه التقنية لديها العديد من التطبيقات واسعة للبحوث الأساسية والتطبيقية بما في ذلك: 1) تحديد دور مسارات محددة على الأوعية الدموية وتغطية السفينة، 2) تقييم آثار المرض والشيخوخة ذات الصلة العوامل على الأوعية الدموية وتغطية السفينة، و 3) تحديد الدوائية أهداف.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
جميع التجارب تتبع جامعة إلينوي، شيكاغو المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام بروتوكولات اللجنة.
1. الإعداد العام
ملاحظة: الدماغ خط الأوعية الدموية الدقيقة الخلايا البطانية (هميك / D3) هو وصفت على نطاق واسع خط بيك الإنسان خلد 14 ، 15 ، 16 ، 18 ، 19 . ثقافة الخلايا هميك / D3 على قوارير زراعة الأنسجة المغلفة مع الكولاجين النوع الأول (جلد العجل، 1:20 التخفيف من محلول 0.1٪ في حل الملح المتوازن هانك (هبس) التي تحتوي على كا 2 + و مغ 2+ ) في النمو البطاني القاعدية المتوسطة القاعدية (إب-2) التي تحتوي على 2-5٪ مصل بقري جنيني (فبس) و 10٪ حامض الاسكوربيك و 10٪ كبريتات جنتاميسين و 25٪ هيدروكورتيزون و 1/4 من الحجم الكلي لعامل النمو المضافات المكملة لكل 500 مل من الوسائط [ الأوعية الدموية البطانة غروعامل نمو البشرة (إغف)، وعامل النمو الشبيه بالانسولين 1 (إيغف-1)، وعامل النمو الليفي الأساسي البشري (بفغف)، انظر جدول المواد ].
ملاحظة: يشار إلى المتوسطة إب-2 مع فبس وعوامل النمو باسم "إيب-2 كاملة". ويشار إلى إب-2 دون فبس والمكملات الغذائية باسم "إب-2 القاعدية". في التقاء الكامل، والخلايا هميك / D3 هي ~ 1 × 10 5 خلايا / سم 2 .
- مرور الخلايا هميك / D3 بنسبة 1: 5 قبل احتضان لأول مرة مع هبس لمدة 3 دقائق دون كا 2 + و مغ 2+ تليها مفرزة مع 5 مل التربسين / إدتا (0.25٪) لمدة 5 دقائق. تحييد التربسين باستخدام إب-2 كاملة (1: 1 تحييد)، وأجهزة الطرد المركزي في 290 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. تجاهل طاف. ريسوسبيند الكرية في إب-2 كاملة وإعادة لوحة في نسبة 1: 5.
- ثقافة بيريسيتس الإنسان الأساسية والنجمية وفقا لبروتوكول المورد [ جدول المواد ]. الثقافيهه بيريسيتس في المتوسطة القاعدية بريسيت مع فبس وتكملة نمو بيريسيت.
- ثقافة الخلايا النجمية البشرية في المتوسطة النجمية التي تحتوي على عوامل نمو الخلايا النجمية. ثقافة كل من بيريسيتس و النجمية في قوارير زراعة الأنسجة المغلفة مع 3 مل من بولي L- يسين (بل) لالتزام الخلايا والاستفادة من الخلايا بين الممرات 2 و 5.
- الموت ببطء 7 الفئران وإزالة ينبع الدماغ و سيريبيلا مع ملقط. فصل السحايا عن طريق المتداول بعناية العقول على الشاش. يفرز أنسجة المخ المتبقية في طبق بتري في الحد الأدنى الأساسية المتوسطة (ميم) مع هيبيس (5 مل في الدماغ) مع شفرة الحلاقة العقيمة. عزل بيكس الماوس الأساسي من الفئران C57BL / 6J منذ شهرين من العمر وفقا للبروتوكول المشار إليه 20 .
- نقل أنسجة المخ المفروم إلى أنبوب مخروطي 15 مل. أجهزة الطرد المركزي في 290 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. إزالة طاف واحتضان الأنسجة في غشاء (833.33 ميكرولتر لكل الدماغ) والدناز (41.7 ميكرولتر في الدماغ)الحل، في حمام مائي 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة، لهضم الأنسجة.
- تساوق التجانس بالتتابع من خلال 19 و 21 الإبر قياس، وخلط في نسبة 1: 1 مع 22٪ البقري مصل الزلال (بسا) الحل، وأجهزة الطرد المركزي في 1360 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية.
- ريسوسبيند الناتجة بيليه في 1 مل إب-2 كاملة وأجهزة الطرد المركزي في 290 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند مرة أخرى في 1 مل إب-2 كاملة وصفيحة الخلايا (1 مل / جيدا) على 6 لوحات جيدا المغلفة مع الكولاجين (~ 1 الدماغ لكل بئر).
- استبدال وسائل الإعلام 24 ساعة في وقت لاحق مع إب-2 كاملة تحتوي على 4 ميكروغرام / مل هيدروكلوريد البوروميسين. استبدال مع إب-2 كاملة بعد 2 أيام. يتم استزراع بيك الأولية كما لخلايا هميك / D3 وتكون في التقاء الكامل في 1 × 10 5 خلايا / سم 2 .
- إعداد 100 ميكرومتر من oAβ، 24 ساعة قبل الفحص.
ملاحظة: يعتبر OA the شكل المرض ذات الصلة من A. ل oAβ، استخدام الاستعدادات التي تتميز جيدا وصفها دالغرn إت آل. 21- - ذوبان الجليد الغشاء القاعدي حل المخزون بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية وقسامة في شرائط أنبوب العقيمة ير (8 أنابيب) في 140 ميكرولتر الغشاء القاعدي لكل أنبوب. إعادة تجميد كل قطاع ومخزن في -20 درجة مئوية. ذوبان الجليد شريط واحد لكل لوحة 96 جيدا في 4 درجات مئوية، 24 ساعة قبل الفحص. قبل تبريد نصائح ماصة لتجنب التصلب.
ملاحظة: يجب أن تتم جميع التعامل مع مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد لتجنب التصلب السريع. كما يتم استخدام 10 ميكرولتر لكل بئر من غشاء الطابق السفلي في يوم الفحص، كل قطاع يكفي لواحد 96 لوحة جيدا. - احتضان بيكس متموجة بشكل كامل في إب-2 القاعدي، 24 ساعة قبل الفحص.
ملاحظة: الأساس المنطقي هو: إب-2 كاملة يحتوي على العوامل المستكملة و فبس بهدف تعزيز نمو الخلايا الأمثل. ومع ذلك، فإن المسارات الجزيئية نفسها التي تعزز نمو الخلايا هي أيضا مهمة لتغطية الخلايا البطانية الدماغ والديناميات، سواء في وجود و أبسنس من الإجهاد. لذلك نحن مصل و تكملة تجويع بيكس للحد من تأثير مربكة من تفعيل المتبقية من مسارات الإشارات الخلوية. من المذكرة، وخلايا لفترة وجيزة (5 دقائق) تتعرض ل فبس خلال تحييد الخلايا تريبسينيزد قبل الفحص. على النقيض من بيك، و بيريسيتس والنجمية ليست المصل جوعا، وذلك بسبب متطلبات عوامل مختلفة للنمو وعدم الاستقرار النسبي من هذه الأنواع من الخلايا ردا على المجاعة في الدم (مختبر تاي، ملاحظات غير منشورة).
ملاحظة: يتم استخدام إب-2 القاعدية خلال الفحص لتشكيل شبكة واحدة وثلاثية ثقافة وتشويهات الفوضى. هذا أمر بالغ الأهمية لمنع تشويش الخلط أو العلاج تعتمد الإشارات.
2. تشبه تشبه الفحوصات وتشكيل
- المقايسات ثقافة بيك واحد:
ملاحظة: وترد ثلاثة نماذج مختلفة للثقافات واحدة من بيك في الشكل 1A . تم تصميم كل نموذج لتقييم استجابة بيكس في نماذج مختلفة من تغطية السفينة. النموذج 1 هو تشكيل شبكة. تم تصميم هذا النموذج لدراسة آثار الضغوطات و / أو العلاجات على تكوين الأوعية وتشكيل شبكة. يتم إضافة بيكس، OAβ، والعلاجات إلى لوحة في 0 ساعة نقطة الوقت. النموذج 2 هو منع انقطاع الشبكة. يتم مطلي الخلايا في وجود عامل النمو أو المخدرات وحضنت لمدة 4 ساعات لتشكيل هياكل تشبه شبكة مشبك. ويضاف الإجهاد، oAβ في هذه الحالة، بعد 4 ساعات. هذا النموذج يقيم قدرة العلاج لمنع الضرر الناجم عن الإجهاد إلى هياكل تشبه شبكة مشبعة مسبقا. النموذج 3 هو علاج في وقت واحد من انقطاع شبكة. يتم مطلي الخلايا ويسمح لتشكيل هياكل تشبه الشبكة لمدة 4 ساعات. ثم تضاف العلاجات و OA simult في وقت واحد في نقطة الوقت 4 ساعة، وتقييم قدرة شبكة الخلية بريفورمد للرد على العلاجات المختلفة. جميع النماذج فولوو خطوات مشتركة مماثلة، إلا مع الاختلافات في توقيت إضافة العلاج.- في يوم الفحص، ماصة مصفوفة الغشاء القاعدي في 10 ميكرولتر / جيدا في الجزء السفلي من لوحات 96 جيدا وتسمح لضبط لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- تعليق المجففة بالتجميد خلية خضراء تتبع صبغ (انظر جدول المواد ) في 10 ميكرولتر دمسو لتوليد حل الأسهم 10 ملم، وتمييع إلى 10 ميكرومتر (1: 1000) في إب-2 القاعدية. إزالة وسائل الإعلام من قارورة متموجة بالكامل واستبدالها مع إب-2 القاعدية التي تحتوي على خضراء تتبع صبغ (5 مل ل 75 سم 2 قارورة). التحميل المسبق بيك مع الخلية الخضراء تتبع صبغ، 20 دقيقة قبل بدء الفحص.
- احتضان الخلايا لمدة 20-30 دقيقة عند 37 درجة مئوية، وإزالة المتوسطة مع خلية تتبع صبغ، وفصل الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.1. تحييد وسائل الإعلام مع إب-2 تحتوي على 10٪ فبس وأجهزة الطرد المركزي في 240 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية. ريسوسبيند بيليه في 1 مل من إب-2 القاعدية.
- لوحة بيكس في لوحة 96 جيدا في 10000 الخلايا / حسنا في إب-2 القاعدية (0 ساعة نقطة في جميع النماذج).
ملاحظة: اعتمادا على النموذج يجري استخدامها، يتم إضافة العلاجات، والإجهاد، أو الضوابط السيارة في نقاط زمنية محددة. في جميع النماذج، يتم حصاد المتوسط لتحليل لاحق (على سبيل المثال تحليل إليسا) والخلايا ثابتة في 24 ساعة مع بارافورمالدهيد 4٪ الطازجة في مصل الفوسفات مخزنة (بس). كنهج بديل لتحديد مصطلح آثار oAβ على تشكيل شبكة، يمكن تعديل البروتوكول إلى ما قبل احتضان قوارير ثقافة الخلايا متموجة مع oAβ، ومن ثم تنفيذ نماذج تشكيل شبكة (+/- oAβ).
ملاحظة: الحجم النهائي في كل بئر لجميع النماذج هو 70 ميكرولتر. جميع العلاجات (oAβ، إغف، وما إلى ذلك ) تضاف إلى الآبار الخاصة بهم في التخفيف 1:20 أي 3.5 ميكرولتر لكل معاملة. ل باراديجم 1، يتم إضافة الخلايا في حل تعليق خلية في 63 ميكرولتر / ثالذراع. على الفور oAβ، والعلاجات المطلوبة، ويضاف الضوابط في 3.5 ميكرولتر / جيدا لكل منهما، وإعطاء ما مجموعه 70 ميكرولتر. ل باراديجم 2، يتم إضافة 63 ميكرولتر من تعليق الخلية و 3.5 ميكرولتر من العلاج (على سبيل المثال 100 نانوغرام / مل إغف) عند 0 ساعة نقطة الوقت. بعد 4 ح الحضانة، يتم إضافة 3.5 ميكرولتر من الأسهم OA ((على سبيل المثال ل 100 نانومتر التركيز OA final النهائي، 3.5 ميكرولتر من 2 ميكرومتر الأسهم OA)). ل باراديجم 3، يتم إضافة 63 ميكرولتر من تعليق خلية عند نقطة 0 ساعة و 4 ساعة، oAβ ويتم إضافة العلاجات المطلوبة في 3.5 ميكرولتر / جيدا كل، مما مجموعه ما مجموعه 70 ميكرولتر. هذه المجلدات يمكن تعديلها وفقا للمعالجات. على سبيل المثال، إذا كان مطلوبا فقط علاج واحد، ويمكن تعديل حجم تعليق الخلية إلى 66.5 ميكرولتر (الحفاظ على 10،000 خلية / بئر) وحجم العلاج يمكن أن تبقى في 3.5 ميكرولتر.
- فحص الثقافة الثلاثي:
ملاحظة: بالإضافة إلى المقايسات ثقافة واحدة من بيك، لدينا تطوير(نموذج 1B ) لتحديد استجابة بيكس، بيريسيتس، والنجمية داخل الشبكات سابقة التشكيل إلى الضغوطات ذات الصلة (على سبيل المثال oAβ). يتم مطلي بيك في وجود العلاجات المطلوبة في 0 ساعة. في 4 ساعات، يتم إضافة بيريسيتس بلطف إلى لوحة. في 7 ساعة، تضاف النجمية إلى لوحة، تليها إضافة إجهاد في 11 ساعة. ثم يتم احتضان الخلايا حتى 24 ساعة نقطة الوقت.
ملاحظة: لفحوصات ثقافة الثلاثي، فمن المهم النظر في توقيت لضمان جميع الخلايا متكدسة في نفس الوقت. وينبغي استزراع الخلايا النجمية البشرية و بيريسيتس 1 أسبوع قبل الفحص، في حين أن الخلايا هميك / D3 تحتاج إلى أن تكون مطلية أو ممر 4-5 أيام قبل تاريخ الفحص. وعلاوة على ذلك، فمن المهم استخدام مرور منخفض (2-5) الخلايا الأولية لتجنب الانجراف المظهري.- إضافة خلية خضراء تتبع صبغ حل العمل لخلايا هميك / D3 20 دقيقة قبل بدء الفحص. لوحة هميك / خلايا D3 في 10، 000 خلية / جيدا في إب-2 القاعدية (0 ساعة نقطة الوقت). وحدات التخزين المستخدمة هي 45 ميكرولتر من تعليق الخلية و 3.5 ميكرولتر من العلاج ( أي تركيزات إغف النهائية من 50 نانوغرام / مل، 100 نانوغرام / مل، أو 1000 نانوغرام / مل من الأسهم التي هي أكثر تكرارا 20 مرة).
- بعد الحضانة 3.5 ساعة في 37 درجة مئوية، إضافة الخلية الزرقاء تتبع صبغ حل العمل (10 ميكرومتر خلية تعقب الأزرق في إب-2 القاعدية) إلى بيريسيتس الابتدائي البشري. في نقطة ح 4 ساعة (~ 30 دقيقة الحضانة مع خلية تتبع صبغ)، إضافة بلطف 2000 بيريسيتس / جيدا إلى لوحة تحتوي على هميك / D3 في حجم 6 ميكرولتر / جيدا.
- بعد 2.5 ساعة إضافية الحضانة (مجموع 6.5 ساعة من 0 ساعة نقطة الوقت)، إضافة البرتقال تتبع خلية حل صبغ العمل (10 ميكرومتر خلية تعقب البرتقال في إب-2 القاعدية) إلى الخلايا النجمية الأولية الإنسان. في نقطة الوقت 7 ساعة، إضافة بلطف 10،000 النجوم النجمية / جيدا إلى لوحة في 12 حجم ميكرولتر. ولذلك، فإن نسبة الخلوية الإجمالية للخلايا البطانية: بيريسيتس: أستروسيتس طs 5: 1: 5. وعلاوة على ذلك، فإن حجم تحقيق هذه النقطة هو 66.5 ميكرولتر.
- إضافة oAβ (3.5 ميكرولتر من الأسهم 100 ميكرومتر) 4 ساعات في وقت لاحق (مجموع 11 ساعة من 0 ساعة نقطة الوقت).
- إصلاح الخلايا 13 ساعة في وقت لاحق في بارافورمالدهيد 4٪ الطازجة في برنامج تلفزيوني.
تنبیھ: ارتدي ملابس واقیة وقفازات ونظارات أثناء التعامل مع بارافورمالدھاید.
3 - التحديد الكمي
- التقاط الصور مضان للبئر كله من لوحة 96 جيدا في 1.6X التكبير مع 2 ثانية وقت التعرض في 50٪ الطاقة القصوى باستخدام المجهر تشريح.
ملاحظة: المجاهر المكافئة يمكن استخدامها. ومع ذلك، فإنه من الأهمية بمكان لالتقاط البئر بأكمله لتحليل شامل. - للتحليل الكمي، معالجة الصور باستخدام إيماجيج الأوعية الدموية محلل المساعد 22 لتحديد عدد من الفروع، وعدد من تنسجم، وإجمالي طول الخلية (يتم قراءتها هذه القراءات تلقائيا من قبل سوفتواري) كما هو موضح أدناه. ويرد بروتوكول بصري مفصل من هذه الخطوة في الشكل 2 .
- فتح فيجي إيماجيج من خلال النقر على أيقونة البرنامج.
- انقر على الأسهم الحمراء الحمراء المزدوجة الموجودة في نهاية شريط الأدوات، ثم انقر فوق "محلل الأوعية الدموية".
- حدد المجلد مع ملفات الصور، انقر فوق "فتح".
- عندما يظهر مربع "إعدادات للتحليل"، انقر فوق "موافق".
- عند ظهور مربع "معالجة الصور"، مما يشير إلى عدد الصور المراد معالجتها، انقر فوق "موافق".
- عند ظهور مربع "نافذة تقدم الدفعة"، مما يشير إلى وقت المعالجة المقدر. خلال هذا الوقت البرنامج يحدد النواتج بما في ذلك عدد من الفروع، وعدد من تنسجم، وإجمالي طول الخلية.
ملاحظة: بمجرد أن يتم تحديد كل الصور، سيظهر ملف النتائج في مجلد الصورة الأصلي كوثيقة جدول بيانات. - تحديدملف جدول البيانات التي تحتوي على نتائج ومقارنة عدد من الفروع، تنسجم ومجموع طول الخلية بين المجموعات.
ملاحظة: في مقايسة الثقافة الثلاثي يتم استخدام إيماجيج أيضا لتحليل التغطية بيراسيت / النجمية وعدد. يتم عتبة الصور من قبل المجرب أعمى و "تحليل الجسيمات" وظيفة تستخدم لتوليد قراءات. ويمكن أيضا خلايا ثابتة وأنابيب تشبه الهياكل تكون إمونوستيند ل Aβ 17 أو علامات أخرى.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
في الثقافات واحدة، على حد سواء خلايا هميك / D3 ( الشكل 3A ) و بيس الأساسي الماوس ( الشكل 3B ) شكل هياكل تشبه شبكة في جميع أنحاء البئر. وتتميز الهياكل بشبكة من العقد المترابطة ( الشكل 3 ). في جميع النماذج وصفها ( الشكل 1 )، هياكل تشبه شبكة متشابهة بعد 24 ساعة في مجموعات السيطرة، وتشكيل ~ 20 هياكل تشبه شبكة مع طول الخلوي الكلي ~ 100...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الأساليب المذكورة يمكن استخدامها لمعالجة العديد من الأسئلة البيولوجية الأساسية المحيطة بالتغطية الدماغية الوعائية 24 . على وجه التحديد، فإنها يمكن أن تحدد أي المستقبلات ومسارات الإشارات تلعب دورا في الأوعية الدموية، وتغطية السفينة في أنسجة السرطان، والخلايا البطانية الطرفية ذات الصلة إلى الدماغ. ومن الأمثلة على ذلك مستقبلات عامل النمو الوعائي، وأكسيد النيتريك، وتشكيل بروتين كيناز المنشط من الميتوجين وتشوير الكالسيوم 25 ، <...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
يتم تمويل ليون تاي من جامعة إلينوي شيكاغو بدء الأموال.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| خلايا hCMEC / D3 | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 الوسائط القاعدية | Lonza | CC-3156 | |
| الكولاجين من النوع 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS والكالسيوم والمغنيسيوم ، بدون فينول أحمر | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS ، خال من الكالسيوم ، لا المغنيسيوم ، لا الفينول الأحمر | ThermoFisher | 14175095 | |
| التربسين EDTA (0.25٪) | ThermoFisher | 25200056 | |
| التركيزات النهائية لمكملات عامل النمو SingleQuot لوسائط EBM2 | Lonza | CC-4147 | |
| 5٪ FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10٪ حمض الأسكوربيك | Lonza | CC-4147 | |
| 10٪ كبريتات الجنتاميسين | Lonza | CC-4147 | |
| 25٪ هيدروكورتيزون | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 حجم عوامل النمو المزودة: عامل نمو الخلايا الليفية ، عامل نمو البشرة ، عامل النمو الشبيه بالأنسولين ، عامل النمو البطاني الوعائي | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR 80503-312 | ||
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| نظام تفكك خلايا Papine (غراء و DNase1) | ورثينجتون الكيمياء الحيوية | LK003150 | |
| الحضيض البشري | Sciencell | 1200 | |
| الوسائط القاعدية الزحفية | Sciencell | 1201 | |
| مكمل نمو الحضاق | Sciencell | 1252 | |
| النجمية البشرية | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte مكمل النمو | Sciencell | 1852 | |
| الغشاء القاعدي (تقليل عامل نمو Matrigel) | Corning | 356231 | |
| الأوعية الدموية m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| عامل نمو البشرة البشري | Shenendoah التكنولوجيا الحيوية | 100-26 | |
| CellTracker الأخضر | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker برتقالي | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker أزرق | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10٪ محايد مخزن Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL الفئران | مختبر جاكسون | و | |
| شرائط أنبوب PCR | GeneMate | T-3014-2 | |
| زايس ستيريو اكتشاف v.8 تشريح المجهر | Zeiss | na |
المراجع
- Abbott, N. J. Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery. J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).
- Engelhardt, B., Liebner, S. Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier. Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).
- Zlokovic, B. V. Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders. Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).
- Pardridge, W. Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier. Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease. PLoS One. 6 (8), e23789(2011).
- Cameron, D. J., et al. Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis. PLoS One. 7 (7), e39598(2012).
- Boscolo, E., et al. Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo. Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).
- Paris, D., et al. Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis. Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).
- Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease. Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).
- Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain. Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280(2011).
- Donnini, S., et al. Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis. FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).
- Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation. J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).
- Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).
- Tai, L. M., et al. Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123. Brain Res. 1292, 14-24 (2009).
- Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16(2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells. Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).
- Dahlgren, K. N., et al. Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability. J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).
- Carpentier, G. Angiogenesis Analyzer. ImageJ News. , (2012).
- Thomas, R., et al. Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice. Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111(2016).
- Tai, L. M., et al. The role of APOE in cerebrovascular dysfunction. Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).
- Ambrose, C. T. Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging. J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).
- Ambrose, C. T. A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis. J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).
- Ambrose, C. T. The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis. J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
