مقالة منهجية

تحليل الفجوة تعتمد على تقاطع نقل ميرنا مع المجهر 3D فراب

DOI:

10.3791/55870

⸱

يونيو 19, 2017

 ,  ,  , 
1Reference and Translation Center for Cardiac Stem Cell Therapy (RTC), 2Department of Cardiac Surgery, University of Rostock, 3Department of Life, Light and Matter of the Interdisciplinary Faculty, University of Rostock

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نحن تصف تطبيق الانتعاش مضان ثلاثي الأبعاد بعد فوتوبلاشينغ (3D-فراب) لتحليل الفجوة تقاطع تعتمد على مكوك من ميرنا. على النقيض من الأساليب المطبقة عادة، 3D-فراب يسمح لكمية النقل بين الخلايا من الحمض النووي الريبي الصغيرة في الوقت الحقيقي، مع ارتفاع القرار المكاني والزماني.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الرنا الصغيرة المضادة للعدوى، مثل ميرنا و سيرنا، تلعب دورا هاما في علم وظائف الأعضاء الخلوية وعلم الأمراض، وعلاوة على ذلك، يمكن أن تستخدم كعوامل علاجية في علاج العديد من الأمراض. ويستند تطوير استراتيجيات جديدة ومبتكرة للعلاج ميرنا / سيرنا على معرفة واسعة من الآليات الكامنة. وتشير البيانات الأخيرة إلى أن رنا صغيرة يتم تبادلها بين الخلايا بطريقة تعتمد على تقاطع الفجوة، وبالتالي إحداث آثار تنظيمية الجينات في الخلية المتلقية. وتستخدم التقنيات البيولوجية الجزيئية وتدفق تحليل سايتوميتريك عادة لدراسة التبادل بين الخلايا من ميرنا. ومع ذلك، فإن هذه الأساليب لا توفر القرار الزماني العالي، وهو أمر ضروري عند دراسة الفجوة تدفق وظيفية من الجزيئات. لذلك، للتحقيق في تأثير ميرنا / سيرنا كما جزيئات الإشارات بين الخلايا، وهناك حاجة إلى أدوات جديدة من شأنها أن تسمح لتحليل هذه الرنا الصغيرة على المستوى الخلوي. يصف هذا البروتوكول أبتقطيع الانتعاش مضان ثلاثي الأبعاد بعد فوتوبلاشينغ (3D-فراب) المجهري لتوضيح التبادل تعتمد على تقاطع الفجوة من جزيئات ميرنا بين خلايا القلب. الأهم من ذلك، وهذا نهج التصوير الخلية الحية مباشرة وغير الغازية يسمح لتصور وتقدير من الفجوة التكتيكية الوصفي من رنا صغيرة فلورزنتلي المسمى في الوقت الحقيقي، مع قرار المكاني والزماني عالية. البيانات التي تم الحصول عليها من قبل 3D-فراب تؤكد مسار جديد من تنظيم الجينات بين الخلايا، حيث رنا الصغيرة بمثابة الجزيئات إشارة داخل الشبكة بين الخلايا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الرنا الصغيرة غير المشفرة هي لاعبين مهمين في تنظيم الجينات الخلوية. وتتكون هذه الجزيئات من 20-25 النيوكليوتيدات التي ترتبط مرنا الهدف محددة، مما يؤدي إلى انسداد الترجمة أو إلى مرنا تدهور 1 ، 2 . العملية التنظيمية الجينية التي تقوم بها الرنا الصغيرة، مثل ميرنا و سيرنا، هو آلية المحافظة للغاية التي تم العثور عليها في العديد من الأنواع المختلفة 3 . على وجه الخصوص، جزيئات ميرنا ذات أهمية حاسمة لمجموعة متنوعة من العمليات الفسيولوجية، بما في ذلك الانتشار، والتمايز، والتجديد 4 ، 5 . وبالإضافة إلى ذلك، يعزى إلى عدم انتظام التعبير ميرنا لكثير من الاضطرابات المرضية. في المقابل، وقد ثبت ميرناس لتكون مناسبة كما المؤشرات الحيوية للتشخيص وكعوامل علاجية للعلاج الجيني 6 ، 7 .

تقاطعات الفجوة (غس) هي هياكل البروتين المتخصصة في غشاء البلازما من اثنين من الخلايا المجاورة التي تسمح التبادل المنتشر للجزيئات مع الوزن الجزيئي تصل إلى 1 كيلو دالتون. وقد تبين أنها مهمة لتطوير الأنسجة، والتمايز، والموت الخلية، والاضطرابات المرضية مثل السرطان أو أمراض القلب والأوعية الدموية 8 ، 9 ، 10 . وقد وصفت عدة جزيئات بأنها قادرة على عبور قنوات جي جي، بما في ذلك الأيونات، الأيض، والنيوكليوتيدات. ومن المثير للاهتمام، تم العثور على غس أيضا لتوفير مسار للحركة بين الخلايا من الرنا الصغيرة 11 ، 12 . وهكذا، ميرناس يمكن أن تعمل ليس فقط داخل الخلية التي يتم إنتاجها، ولكن أيضا داخل الخلايا المتلقية. هذا يسلط الضوء على دور ميرناس في نظام التنبيه إشارة بين الخلايا. وفي الوقت نفسه، تظهر البياناتأن الفجوة التواصل بين الخلايا اتصال بين يرتبط ارتباطا وثيقا وظيفة ميرنا. بسبب تأثير كبير من ميرنا و غس على التوازن الأنسجة، علم الأمراض، والتشخيص، وفهم شامل لوظيفة غس والديناميات بين الخلايا ذات الصلة ميرنا تساعد على توضيح آليات الأمراض القائمة على ميرنا ووضع استراتيجيات جديدة ل ميرنا العلاجات.

اعتمادا على مدى الفجوة اقتران الوصلي، ونقل جزيئات ميرنا بين الخلايا يمكن أن تكون عملية سريعة جدا. لذلك، هناك حاجة إلى منهجية تسمح التصور وكمية الحركة بين الخلايا السريعة من هذه الجزيئات تشوير التنظيمية. عادة، وقد تم تطبيق التدفق الخلوي والتقنيات البيولوجية الجزيئية لإثبات المكوك من الرنا الصغيرة 11 ، 12 ، 13 ، 14 . ومع ذلك، بدلا من ميكروس فرابنسخ، هذه النهج تفتقر إلى القرار الزماني عالية، وهو إلزامي عند تحليل تبادل ميرنا عبر غس. وعلاوة على ذلك، فراب المجهري هو أقل الغازية، وبالتالي يمثل قوية ورواية الخلية الحية تقنية التصوير لتقييم تبادل غ تعتمد على جزيئات في عدة أنواع الخلايا 15 ، 16 ، 17 .

هنا، نقدم بروتوكول مفصل يصف تطبيق 3D-فراب لتقييم ميرنا المكوك بين الخلايا العضلية. لهذا الغرض، تم ترانزفكتد كارديوميوسيتس مع ميرنا فلورزنتلي المسمى. وكانت خلية ملحوظ مع هذا ميرنا فوتوبلاشد، وسجل فجوة ميرنا الوريد إعادة تدفق من الخلايا المجاورة سجلت بطريقة تعتمد على الوقت. القرار الزماني العالي للتجارب فراب يوفر إمكانية لإجراء دراسات الحركية لتقييم دقيق لنقل بين ميرنا و سيرنا بين الخلايا الحية. Moreoحيث يمكن تبادل رنا صغيرة عن طريق آليات مختلفة مع حركية مختلفة للغاية، يمكن أن يساعد المجهر فراب لتوضيح مدى مشاركة غس في عمليات المكوكية ذات الصلة 18 . وبالإضافة إلى ذلك، 3D-فراب يمكن استخدامها للتحقيق في التغيرات الفسيولوجية والمرضية في نفاذية غ وأثره على نقل الحمض النووي الريبي الصغيرة 15 ، 19 .

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الخطوات في هذا البروتوكول التي تنطوي على الفئران حديثي الولادة في المبادئ التوجيهية الأخلاقية لرعاية الحيوان من المركز الطبي جامعة روستوك.

1. إعداد أطباق ثقافة الخلية والمتوسطة للثقافة كارديوميوسيت

  1. معطف لوحة ثقافة الخلية مع 0.1٪ الجيلاتين في برنامج تلفزيوني واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات أو في 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها. إزالة الجيلاتين والسماح لها لتجف تحت العقيمة تدفق الهواء الصفحي.
  2. إعداد وسط ثقافة الخلية تتألف من 50 مل من دمم تستكمل مع 10٪ مصل بقري الجنين (فبس) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين (P / S). قبل دافئ إلى 37 درجة مئوية.

2. عزل كارديوميوسيتس حديثي الولادة

  1. التضحية الفئران حديثي الولادة (1-2 أيام من العمر) بواسطة قطع الرأس مع مقص العقيمة وفتح الصدر على طول القص. إزالة القلب باستخدام ملقط أثناء الضغط قليلا على الصدر معا ونقل القلب إلى لوحة 24 جيدا تحتوي على الجليد الباردة هبس(بدون كا 2 + و مغ 2+ ).
  2. إزالة الأنسجة غير القلبية وأوعية أكبر باستخدام ملقط معقم. نقل قلوب تنظيفها في أنبوب 1.5 مل تحتوي على الجليد هبس الباردة. استخدام الحد الأقصى من 5 قلوب لكل أنبوب للهضم الأنزيمي.
  3. يخلط القلوب مع مقص صغير في <0.5 إلى 1 مم³ قطعة.
  4. غسل قلوب المفروم مع هبس مرتين عن طريق الشفط / إضافة هبس باستخدام ماصة ميكروليتر 1 مل. إزالة هبس تماما قبل إضافة الإنزيمات.
  5. للحصول على الهضم الأنزيمي من قلوب حديثي الولادة، استخدم عدة متوفرة تجاريا واتبع بروتوكول الشركة المصنعة (انظر جدول المواد ). هز الأنبوب الذي يحتوي على قلوب المفروم كل 5 دقائق أثناء احتضان مع الانزيمات عند 37 درجة مئوية لمدة 35 دقيقة.
  6. البذور علقت الخلايا على غير المغلفة أطباق ثقافة الخلية التي تحتوي على خلية ثقافة المتوسطة لمدة 1.5-2 ساعة للسماح للالتزام من جزء غير كارديوميوسيت. كرر هذه الخطوة إذا كان نقاء عاليةمن كارديوميوسيتس. إذا رغبت في ذلك، مزيد من الثقافة الجزء غير كارديوميوسيت.
    ملاحظة: لتعليق خلية من 15 قلوب، يمكن إجراء خطوة ما قبل الطلاء على 75 سم ² قوارير ثقافة الخلية. عادة، ~ 5 × 10 5 خلايا يتم الحصول عليها من قلب حديثي الولادة.
  7. جمع طاف في أنبوب مخروطي 15 مل وطرد مركزي لمدة 10 دقيقة في 300 × ز. ريسوسبيند الخلايا في 1 مل من خلية ثقافة المتوسطة.
  8. عد الخلايا مع عدادة الكريات غرفة نيوباور، أو استخدام طريقة مكافئة.
  9. لوحة كارديوميوسيتس معزولة على لوحات 6 جيدا مع كثافة 3 × 10 5 خلايا / سم ². احتضان الخلايا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 .
    ملاحظة: اختياريا، يمكن أيضا الخلايا ترانزفكتد في هذه المرحلة. ومع ذلك، لوحظ زيادة القدرة على البقاء عندما تم استزراع الخلايا لمدة يوم واحد قبل أن يتعرض لل إليكتروبوراتيون.

3. ترنسفكأيشن مع ميرنا فلورزنتلي المسمى

  1. ما قبل(انظر الخطوة 1.2) إلى 37 درجة مئوية في حمام مائي أو جهاز مماثل.
  2. إعداد حل 20 ميكرومتر الأسهم من ميرنا الفلورسنت في المياه المعاد خالية من ريبونوكلياز.
  3. إعداد إليكتروبوراتيون عازلة تحتوي على 90 ملي نا 2 هبو 4 ، 90 ملي ناه 2 بو 4 ، 5 ملي بوكل، 10 ملي مغكل 2 ، و 10 ملي سكسينات الصوديوم وضبط درجة الحموضة إلى 7.2، يمكن تخزين العازلة إليكتروبوراتيون في -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
  4. فصل الخلايا من طبق الثقافة باستخدام 0.05٪ التربسين لمدة 5 دقائق. تعطيل التربسين عن طريق إضافة خلية ثقافة المتوسطة.
  5. عد الخلايا مع عدادة الكريات غرفة نيوباور، أو استخدام طريقة مكافئة. أجهزة الطرد المركزي الخلايا في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
  6. ريسوسبيند الخلايا في العازلة إليكتروبوراتيون للحصول على تركيز 4 × 10 5 خلايا لكل 100 ميكرولتر.
  7. مزيج 100 ميكرولتر من تعليق خلية مع ميرنا الفلورسنت (التركيز النهائي: 0.25 ميكرومتر) في أنبوب وتحميل الخليط في كوفيت إليكتروبوراتيون.
    1. تحديد تجريبيا كمية مناسبة من ميرنا، اعتمادا على نوع الخلية.
  8. أداء إليكتروبوراتيون باستخدام جهاز إليكتروبوراتيون (انظر جدول المواد )، وذلك باستخدام برنامج "G-009".
  9. إضافة 500 ميكرولتر من مرحلة ما قبل تحسنت زراعة الخلايا المتوسطة ونقل تعليق خلية كاملة (4 × 10 5 خلايا) في بئر من 4-جيدا الشرائح الزجاج أسفل الغرفة. ثقافة الخلايا لمدة 1 يوم عند 37 درجة مئوية في 5٪ كو 2 الغلاف الجوي.
    ملاحظة: لتحليل فراب، وكثافة الخلايا من ~ 80٪ هو الأمثل. ترنسفكأيشن من ميرنا المسمى ينبغي أن يؤديها حصرا باستخدام إليكتروبوراتيون. منذ التوزيع المتجانسة لجزيئات ميرنا المسمى هو مفيد لقياس فراب، لا ينصح ترنسفكأيشن القائم على كاشف.

4. تطبيق 3D-فراب المجهري (يوم 3)

  1. الاحماء الحاضنة المجهر إلى 37 درجة؛ C والتبديل على نظام المجهر متحد البؤر لا يقل عن 2 ساعة قبل قياس فراب لإنشاء التوازن الحراري وتقليل إمكانية الانجراف. إذا كان ذلك ممكنا، والحفاظ على 5٪ كو 2 الغلاف الجوي.
  2. إدراج الشريحة غرفة في حامل عينة المرحلة.
  3. العثور على مجموعة من كارديوميوسيتس ترانزفكتد باستخدام هدف النفط 1.4 نا (التكبير 400X) و 561 نانومتر ليزر ضوء الإثارة في طاقة الليزر منخفضة، مع مجموعة الكشف عن 570-680 نانومتر.
    ملاحظة: تم تحديد إعدادات فراب، والحصول على الصور، والتحليل باستخدام برامج المجهر محددة (انظر جدول المواد ).
  4. قم بتنشيط أزرار "z-ستاك" و "تايم سيريز" و "بليتشينغ" و "ريجيونس" في "سيتوب ماناجر".
  5. تحديد المعلمات فراب.
    1. تحديد إعدادات الحصول على الصور في "وضع الاكتساب" القائمة عن طريق وضع "حجم الإطار(4)؛ إلى 512 × 512، "خطوة خط" إلى 1، و "وقت الفحص" إلى <1 ثانية.
    2. في القائمة "القنوات"، وضبط قوة الليزر، تعويض، واكتساب إعدادات للحصول على مضان القصوى من الحد الأدنى الإثارة الليزر (على سبيل المثال، قوة الليزر: 1-5٪). ضبط لتجنب تشبع كثافة. تعيين "حجم الثقب" إلى 2 ميكرون.
    3. بعد ذلك، في قائمة "المناطق"، حدد "أداة رسم عائد الاستثمار" واستخدم المؤشر لوضع علامة على الخلية المستهدفة والخلية المرجعية ومنطقة الخلفية. إذا لزم الأمر، حدد عدة خلايا الهدف ل فوتوبلاشينغ.
    4. ضبط إعدادات فوتوبلاشينغ في القائمة "التبييض" (على سبيل المثال، التكرارات: 9-14، قوة الليزر ل فوتوبلاشينغ: 100٪، الفاصل الزمني من الحصول على الصور: 60 ثانية، دورات: 15). تحديد بداية التبييض بعد 3 المسح الأولي.
    5. في القائمة "z- المكدس"، وتحديد حدود اكتساب ض المكدس، اعتمادا على سمك الخلايا. اضبط الرقم "of z-لايرس "إلى 12 - 15.
    6. بدء تجربة فراب وتسجيل الانتعاش مضان.
      ملاحظة: منذ إعدادات تجربة فراب تعتمد على نوع الخلية، وصبغ الفلورسنت، ونظام المجهر، فمن الأفضل لإجراء تجارب تجريبية لتحديد المعلمات المثلى ل فراب. وينبغي أن يكون التبييض كافيا للحد من كثافة مضان الأولية بنسبة 50٪ على الأقل. عادة، ينبغي تسجيل الانتعاش مضان كل 30-60 ثانية حتى يتم التوصل إلى مرحلة الهضبة.

5. تحليل البيانات

  1. إنشاء أقصى التوقعات من اكتساب Z- أكوام والحصول على قيم شدة مضان من الخلايا المستهدفة ابيض، الخلية المرجعية، والخلفية. باستخدام برنامج المجهر محددة، انقر فوق "معالجة" → "أقصى كثافة إسقاط" → حدد ملف → "تطبيق".
    1. بدلا من ذلك، استخدم أداة تحليل صورة مكافئة ( على سبيل المثال، إيماجيج).
  2. نسخ بيانات كثافة مضان في جميع نقاط الوقت من الخلية المستهدفة، والخلفية، والخلية المرجعية في جدول بيانات.
    1. طرح كثافة الخلفية وشدة الخلية المرجعية من قيم شدة الخلية المستهدفة لتصحيح ل فوتوبلاشينغ الناجمة أثناء عملية الاستحواذ. إجراء التصحيحات الخلفية والخلايا المرجعية لكل نقطة زمنية.
    2. تطبيع البيانات فراب تصحيح إلى كثافة مضان الأولية قبل التبييض عن طريق قسمة كل قيمة من قبل مضان الأولي.
    3. للحصول على منحنيات فراب، تعيين خط الأساس لشدة مضان مباشرة بعد التبييض عن طريق طرح من قيم كثافة كل نقطة زمنية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم 3D-فراب المجهري باعتبارها تقنية غير الغازية لدراسة الفجوة التكتيكي الوصلي من ميرنا الفلورسنت ضمن العضلية حديثي الولادة. كشفت العضلية معزولة نموذجي α- الأكتينين مخطط وضمت لويحات كبيرة من Cx43 على طول حدود خلية الخلية ( الشكل 1A ، السهام البيضاء)، والذي سمح للتدفق بين الخلايا عالية من الجزيئات. تم تقييم نقاء كارديوميوسيتس معزولة عن طريق القياس المجهري للخلايا إيجابية α- الأكتينين. على الرغم من أن بعض الخلايا غي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ميرناس هي اللاعبين الرئيسيين في علم وظائف الأعضاء الخلوية، وتبين أنها تعمل كجزيئات الإشارات باستخدام-من بين أمور أخرى-غس كمسار لتبادل بين الخلايا 11 ، 12 ، 22 . يعرض البروتوكول الحالي تقنية التصوير في الخلية الحية في المختبر لتوصيف هذه التكتيكية التي تعتمد على غ باستخدام ميرناس الفلورسنت داخل مجموعات الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أي تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل الوزارة الاتحادية للتعليم والبحث في ألمانيا (فكز 0312138A و فكز 316159)، و مكلنبورغ-ويسترن بوميرانيا الحكومية مع صناديق الاتحاد الأوروبي الهيكلية (إسف / إيفوم-B34-0030 / 10 و إسف / إيفبم-B35-0010 / 12)، و دفغ (DA1296-1)، ومؤسسة القلب الألمانية (F / 01/12). وبالإضافة إلى ذلك، ويدعم أردي من قبل برنامج فورون من المركز الطبي جامعة روستوك (889001)، ومؤسسة دامب، و بمبف (فيب + 00240).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
حديثي الولادة NMRI الفئرانتشارلز ريفر
الجيلاتينسيجما ألدريتشG70410.1 ٪ حل في PBS ، معقم
PBSعموم التكنولوجيا الحيويةP04-53500
Dulbecco & حاد ؛ s متوسطة معدلةعموم التكنولوجيا الحيويةP04-03550
البنسلين / الستربتومايسينثيرمو فيشر العلمي15140122100 وحدة / مل ، 100 وميكرو ؛ جم / مل
مصل بقري الجنينPan BiotechP30-3306
بلاستيك زراعة الخلاياTPP
طقم عزل خلايا عضلة القلب الأوليةThermo Fisher Scientific88281
HBSSThermo Fisher Scientific88281المدرجة في مجموعة عزل خلايا عضلة القلب الأولية
Trypan blueThermo Fisher Scientific15250061
miRIDIAN Dy547 المسمى microRNA تقليدDharmaconCP-004500-01-05يذوب في الماء الخالي من RNAse ، محلول المخزون 20 & micro ؛ M
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةSigmaS3139
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةكارل روثT877.2
كلوريد البوتاسيومSigmaP9333
كلوريد المغنيسيومServa28305.01
سكسينات الصوديومكارل روث3195.1
0.05٪ محلول التربسين / EDTAMerckL2153
4 آبار - شرائح الغرفة السفلية الزجاجية معطفIBIDI80827مع محلول جيلاتين 0.1٪
برنامج Amaxa Nucleofector IILonzaG-009 ل Electroporation   ؛
نظام LSM 780 ELYRA PS.1Zeiss
ExcelMicrosoft
& alpha - الأكتينين المضادAbcamab9465التخفيف 1: 200
Connexin43 الجسم المضادسانتا كروزsc-9059التخفيف 1:200
الماعز المضاد للفأر Alexa 594 الجسم المضادThermo Fisher ScientificA-11005التخفيف 1:300
الماعز المضاد للأرانب Alexa 488 الجسم المضادThermo Fisher ScientificA-11034التخفيف 1:300
Connexin43 siRNAThermo Fisher ScientificAM16708 ID158724التركيز النهائي 250 نانومتر
Near-IR Live / DeadCell Stain Kit Thermo Fisher ScientificL10119
CellTrace Calcein أحمر برتقاليحراري Thermo ScientificC34851
DAPI وصمة عار نوويةالثرثرو العلميD1306
تم استخدام برنامج

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Carthew, R. W., Sontheimer, E. J. Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs. Cell. 136 (4), 642-655 (2009).
  2. Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).
  3. Grimm, D. Small silencing RNAs: state-of-the-art. Adv Drug Deliv Rev. 61 (9), 672-703 (2009).
  4. Raghunathan, S., Patel, B. M. Therapeutic implications of small interfering RNA in cardiovascular diseases. Fundam Clin Pharmacol. 27 (1), 1-20 (2013).
  5. Sluijter, J. P. G. MicroRNAs in Cardiovascular Regenerative Medicine: Directing Tissue Repair and Cellular Differentiation. ISRN Vasc Med. , 1-16 (2013).
  6. Li, M., Zhang, J. Circulating MicroRNAs: Potential and Emerging Biomarkers for Diagnosis of Cardiovascular and Cerebrovascular Diseases. Biomed Res Int. , 1-9 (2015).
  7. Romaine, S. P. R., Tomaszewski, M., Condorelli, G., Samani, N. J. MicroRNAs in cardiovascular disease: an introduction for clinicians. Heart. 101 (12), 921-928 (2015).
  8. Maes, M., Crespo Yanguas,, Willebrords, S., Cogliati, J., Vinken, B., M, Connexin and pannexin signaling in gastrointestinal and liver disease. Transl Res. 166 (4), 332-343 (2015).
  9. Michela, P., Velia, V., Aldo, P., Ada, P. Role of connexin 43 in cardiovascular diseases. Eur. J. Pharmacol. 768, 71-76 (2015).
  10. Naus, C. C., Laird, D. W. Implications and challenges of connexin connections to cancer. Nat Rev Cancer. 10 (6), 435-441 (2010).
  11. Hong, X., Sin, W. C., Harris, A. L., Naus, C. C. Gap junctions modulate glioma invasion by direct transfer of microRNA. Oncotarget. 6 (17), Available from: http://www.impactjournals.com/oncotarget 15566-15577 (2015).
  12. Lee, H. K. H., et al. Mesenchymal stem cells deliver synthetic microRNA mimics to glioma cells and glioma stem cells and inhibit their cell migration and self-renewal. Oncotarget. 4 (2), 346-361 (2013).
  13. Katakowski, M., Buller, B., Wang, X., Rogers, T., Chopp, M. Functional microRNA is transferred between glioma cells. Cancer Res. 70 (21), 8259-8263 (2010).
  14. Zong, L., Zhu, Y., Liang, R., Zhao, H. -B. Gap junction mediated miRNA intercellular transfer and gene regulation: A novel mechanism for intercellular genetic communication. Sci Rep. 6, 19884(2016).
  15. Yum, S. W., Zhang, J., Scherer, S. S. Dominant connexin26 mutants associated with human hearing loss have trans-dominant effects on connexin30. Neurobiol Dis. 38 (2), 226-236 (2010).
  16. Kuzma-Kuzniarska, M., Yapp, C., Pearson-Jones, T. W., Jones, A. K., Hulley, P. A. Functional assessment of gap junctions in monolayer and three-dimensional cultures of human tendon cells using fluorescence recovery after photobleaching. J Biomed Opt. 19 (1), 15001(2013).
  17. Lemcke, H., Nittel, M. -L., Weiss, D. G., Kuznetsov, S. A. Neuronal differentiation requires a biphasic modulation of gap junctional intercellular communication caused by dynamic changes of connexin43 expression. Eur J Neurosci. 38 (2), 2218-2228 (2013).
  18. Lemcke, H., Steinhoff, G., David, R. Gap junctional shuttling of miRNA - A novel pathway of intercellular gene regulation and its prospects in clinical application. Cell Signal. 27 (12), 2506-2514 (2015).
  19. Lemcke, H., Kuznetsov, S. A. Involvement of connexin43 in the EGF/EGFR signalling during self-renewal and differentiation of neural progenitor cells. Cell Signal. 25 (12), 2676-2684 (2013).
  20. Lemcke, H., Peukert, J., Voronina, N., Skorska, A., Steinhoff, G., David, R. Applying 3D-FRAP microscopy to analyse gap junction-dependent shuttling of small antisense RNAs between cardiomyocytes. J. Mol. Cell. Cardiol. 98, 117-127 (2016).
  21. Laupheimer, M., et al. Selective Migration of Subpopulations of Bone Marrow Cells along an SDF-1 α and ATP Gradient. Bone Marrow Res. , 1-10 (2014).
  22. Zhang, S., Wang, Q., Liu, L., Hong, X., Zhang, Y., Tao, L. Gap junctions enhance the antiproliferative effect of microRNA-124-3p in glioblastoma cells. J Cell Physiol Physiol. 230 (10), 2476-2488 (2015).
  23. Vasilescu, C., Tanase, M., Dragomir, M., Calin, G. A. From mobility to crosstalk. A model of intracellular miRNAs motion may explain the RNAs interaction mechanism on the basis of target subcellular localization. Math Biosci. 280, 50-61 (2016).
  24. Pitchiaya, S., Androsavich, J. R., Walter, N. G. Intracellular single molecule microscopy reveals two kinetically distinct pathways for microRNA assembly. EMBO Rep. 13 (8), 709-715 (2012).
  25. Heinze, K. G., Costantino, S., De Koninck, P., Wiseman, P. W. Beyond photobleaching, laser illumination unbinds fluorescent proteins. J Phys Chem B. 113 (15), 5225-5233 (2009).
  26. Jou, M. J., Jou, S. B., Guo, M. J., Wu, H. Y., Peng, T. I. Mitochondrial reactive oxygen species generation and calcium increase induced by visible light in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 1011, 45-56 (2004).
  27. Dong, H., Lei, J., Ding, L., Wen, Y., Ju, H., Zhang, X. MicroRNA: Function, detection, and bioanalysis. Chem Rev. 113 (8), 6207-6233 (2013).
  28. Liang, Y., Ridzon, D., Wong, L., Chen, C. Characterization of microRNA expression profiles in normal human tissues. BMC Genomics. 8 (1), 166(2007).
  29. Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nat Commun. 2, 282(2011).
  30. Squadrito, M. L., et al. Endogenous RNAs Modulate MicroRNA Sorting to Exosomes and Transfer to Acceptor Cells. Cell Rep. 8, 1432-1446 (2014).
  31. Zhang, B., Farwell, M. A. microRNAs: a new emerging class of players for disease diagnostics and gene therapy. J Cell Mol Med. 12 (1), 3-21 (2008).
  32. Chen, Y., Gao, D. -Y., Huang, L. In vivo delivery of miRNAs for cancer therapy: Challenges and strategies. Adv Drug Deliv Rev. 81C, 128-141 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

miRNA 3D FRAP 43 Connexin43

مقالات ذات صلة